蛋白质下游纯化解决方案专帖.doc

【专题讨论】生物制药产业化及膜分离技术，下游纯化解决方案专帖！请教一个关于超滤浓缩疫苗(病毒)的问题，目标病毒是2022nm，但是超滤膜是以kd表示的，不知道nm和kd对应关系如何，我应该选用多大截留分子量的膜包合适 啊。谢谢前辈指导。A:你可以考虑用截流分子量为100kDa的超滤膜，对于疫苗应该没问题。另外，还应该看杂质的种类和大小。B:一般地，浓缩疫苗，选择的原则是100KD和300KD为多。更大的500KD和900KD也有用，但是很少。至于换算，粗略的是1nm对应911KD。但是您最好是以实验为准。 血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化?含血清的培养，会受血清中多种杂蛋白影响，纯化难度较大。不知道你的表达量有多少，血清百分之几？可以考虑阴离子capture，但是注意phenol red, 核酸以及多种杂蛋白都会binding，所以要先建立比较灵敏的assay方法，如Elisa，用于监测纯化整个过程。目标蛋白等电点和BSA相差不多，第一步很可能分不开，后面可以考虑用HIC进行精纯。 我的建议是先得到澄清液体，然后用切向流去除小分子杂质，然后层析分离。为保证二聚体不解离，二硫键不断裂，建议整个过程考虑pH值，还有还原剂。 haibei00 wrote:血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化?对于血清培养细胞，可以先考虑用盐析沉淀进行粗提后，再用凝胶过滤和阴离子交换柱，如Q Sepharose FF或DEAE Sepharose FF进行分离。 ligand wrote:你可以考虑用截流分子量为100kDa的超滤膜，对于疫苗应该没问题。另外，还应该看杂质的种类和大小。一般的疫苗用100K应该没有问题。但是对于这么小的病毒，用100K，可能会影响回收率。建议实验后决定孔径选择。 ligand wrote:对于血清培养细胞，可以先考虑用盐析沉淀进行粗提后，再用凝胶过滤和阴离子交换柱，如Q Sepharose FF或DEAE Sepharose FF进行分离。这样做肯定没有问题。但是下游纯化是生物技术的主要成本所在（90%？，95%？更多？）。如何使填料的寿命延长以减少成本，是我们工艺选择时候考虑的。有些时候，多个步骤可能会更有利于获得理想结果。如果要是实验室研究， 那是另外一回事。盐析要考虑条件。别把目标蛋白一起去了。是与否，请参考。 我们用PVDF 0.22um的滤芯过滤培养液，用后总是清洗不干净，听说不能用碱洗，我们又打算反复使用，希望大家给一个过滤器清洗建议吧。我们的产品是蛋白或者抗生素. 羟丙甲纤维素药液过滤问题：我们曾尝试1微米和5微米预过滤器的过滤,结果很快就堵住了，过不了,急啊。各位前辈能给点建议吗,非常感谢!0.5%羟丙甲纤维素、0.5%氯化钠.动力黏度（用平氏黏度计测）范围为1032mpa warmice1 wrote:我们用PVDF 0.22um的滤芯过滤培养液,用后总是清洗不干净,听说不能用碱洗,我们又打算反复使用,希望大家给一个过滤器清洗建议吧. 我们的产品是蛋白或者抗生素.可以15min 用碱（0.2M)清洗。然后迅速用水洗干净。 swordhearter wrote:羟丙甲纤维素药液过滤问题：我们曾尝试1微米和5微米预过滤器的过滤,结果很快就堵住了，过不了,急啊。各位前辈能给点建议吗,非常感谢!0.5%羟丙甲纤维素、0.5%氯化钠.动力黏度（用平氏黏度计测）范围为1032mpa以下几点建议：1，选择合适的过滤器；2，根据过滤器的使用条件选择合适的压力。3，欲速则不达。粘度很大的料液，不能要求太快，或者加大使用面积。 warmice1 wrote:888老师.谢谢!我们试过,但是通量下降.您方便详细描述一下？ 我们用碱清洗后,发现PVDF滤膜过料液变得很慢. warmice1 wrote:我们用碱清洗后,发现PVDF滤膜过料液变得很慢.你描述还是很简单.过滤器除了滤膜的材质之外,还有支撑层,保护支架,尖头,封口等.各部位的材质是不一样的.如果用碱清洗-大多数是这么处理的. 不能长时间浸泡.不同的厂家生产的产品是不一样的.所以不能一概而论.你还是需要详细的说明. 我在毕赤酵母里分泌表达的一个融合蛋白存在降解，加PMSF和EDTA都不能抑制降解 ，而且上清存放-20一段时间仍会继续降解，在做纯化过程中也会出现一系列降解的连续条带，实在太郁闷了，有人遇到过类似情况吗？大家有什么应付降解的良策吗？希望大家给些建议。谢谢！ printmyheart wrote:我在毕赤酵母里分泌表达的一个融合蛋白存在降解 ， 加PMSF和EDTA都不能抑制降解 ，而且上清存放-20一段时间仍会继续降解，在做纯化过程中也会出现一系列降解的连续条带，实在太郁闷了，有人遇到过类似情况吗？大家有什么应付降解的良策吗？希望大家给些建议。谢谢！立刻上柱，去掉杂质。 purify0921 wrote:立刻上柱，去掉杂质。您最好描述详细一些.上柱.什么柱?分子筛? 去掉的是什么杂质?我建议最好先了解该融合蛋白的特征.什么条件下容易降解?降解动力学如何?受影响的因素主要是什么?把影响降解的关键因素弄明白后，然后有条件的解决 ,可能更好! 非常感谢888wym ，biosepq ，ligand 前辈的指教！对这个蛋白（由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5pH5.5）现在我们还是不考虑血清培养细胞了，采用无血清培养，用的是北京的SAF和一个进口的SFM培养基，现在表达量在12ug左右，不是很理想，不知道还有没有其它的培养基？对现在有人采用将培养上清液进行阳离子后再用阴离子。用阳离子时pH高于等电点，接着用阴离子时用等电点附近的pH缓冲液去杂蛋白，再洗脱得目的物。不知道前辈认为如何？考虑成本和操作简单以及回收率问题，前辈有何好的思路，还请多赐教，现在买了AKATA prime纯化仪器。因为我是新手，纯化好多都不懂，前辈能否给一些相关得学习资料和思路。非常感谢！（） 老师好,我有个问题:在用切向流过滤时,可以选择膜包或者是中空纤维的滤柱,我想知道在什么条件下选择那种滤器比较好.谢谢了! haibei00 wrote:非常感谢888wym ，biosepq ，ligand 前辈的指教！对这个蛋白（由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5pH5.5）现在我们还是不考虑血清培养细胞了，采用无血清培养，用的是北京的SAF和一个进口的SFM培养基，现在表达量在12ug左右，不是很理想，不知道还有没有其它的培养基？对现在有人采用将培养上清液进行阳离子后再用阴离子。用阳离子时pH高于等电点，接着用阴离子时用等电点附近的pH缓冲液去杂蛋白再洗脱得目的物。不知道前辈认为如何？考虑成本和操作简单以及回收率问题，前辈有何好的思路，还请多赐教，现在买了AKATA prime纯化仪器。因为我是新手，纯化好多都不懂，前辈能否给一些相关得学习资料和思路。非常感谢！（）表达量的问题，属于上游的问题，你还是好好摸索条件，我不能给出太多的建议.所有原料的来源好质量你再好好检查.昨天有事情，未及回复完。pH高于PI，目标蛋白主要以阴离子状态存在，用阳离子目的是什么？请确认。我认为，您首先要考虑尽可能在上游想办法，获得高得表达量。在此基础上，可以选择合适的方法获得好的回收率。合适的方法不是千篇一律。既然您有AKTA，那么怎么做就很容易摸索出来。有几点提醒：1，离子交换之前，需要脱盐。可以用超滤方法。2，分子筛层析之前，建议浓缩。超滤是好的方法。3，离子交换之前，需要考虑合适的pH选择。洗脱的合适条件。 chendaqian wrote:老师好,我有个问题:在用切向流过滤时,可以选择膜包或者是中空纤维的滤柱,我想知道在什么条件下选择那种滤器比较好.谢谢了!1，待处理料液的体积大小：大，建议用Hollow fiber，HF；小，建议用Membrane cassette，MC；2，在意