南方医科大学研究生细胞培养技术考试重点总结.doc

一. 细胞培养技术的概念,简史在体外对细胞培养并进行研究的技术, 也叫细胞克隆技术. 细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 细胞培养技术主要包括二大方面内容:1.微生物细胞培养技术 2.动, 植物细胞培养技术 ：1) 器官培养技术 2) 组织培养技术 3) 细胞培养技术 二. 细胞培养的优点1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制：（1）可控制-选择对象：类型： 上皮？间质？性质：正常？肿瘤？（2）可控制-调节条件：各种因素:物理、化学、生物等因素（3）可控制-利用方法。采用各种研究技术、记录方法：研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记-记录：摄影照片、缩时电影、电视-3. 应用广（1）学科多：（2）对象广：各种动物：低等动物-高等动物-人类；一种动物：不同年龄；不同组织: 正常或异常（肿瘤）4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象5. 不易污染环境三、细胞培养的缺点 1. 现人工无法完全模拟体内环境：a. 失去彼邻关系b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 细胞趋向单一化 3.失去原有组织结构和细胞形态4.分化减弱或不显：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。5. 某些类型细胞还很难培养6.大规模培养难度大四. 体外细胞培养的方式1.粘附型培养: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式2.悬浮型培养: 不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。来源:来自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团优点 : 生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获可获得稳定状态.缺点:观察不方便, 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)五.体外培养细胞的生长形态分类根据形态大致的不同，主要2类：1.上皮样：来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状2.成纤维细胞样：培养中形态与成纤维细胞类似。来源：中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核。3.其它，不定型六. 常用术语1.细胞系（cell line）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。不能或有限传代下去称有限细胞系。能连续传代的称连续细胞系。2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。5.转染（transfection）：将某个基因转移到培养细胞核内。6.lipofection：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA）后形成复合物可转染到动物细胞。第二章 细胞培养的条件及设备一、细胞培养室二、常用设备1. 超净工作台；2. 纯水装置；3. 抽气泵；4. 消毒装置；5. 干燥装置；6. CO2培养箱(孵箱)；7. 液氮生物容器；8. 冰箱；9. 离心机10. 天平11. 显微镜12. 过滤装置13. 空调14. 酸度计15. 干燥器三、常用消耗器材1.培养瓶及各种相关玻璃用品、塑料用品和棉制品2.手术器材四、培养用液1.天然培养基（液）：血清、鸡胚浸出液、鼠尾胶2.人工合成培养液：合成培养基、平衡盐溶液、缓冲液、蒸馏水、消化液和抗菌素等五、消耗性器皿的清洗、包装及消毒第三章 细胞培养基本技术一、原代培养基本技术：取材漂洗剪切消化计数接种二、传代培养技术：去旧换新液消化分装三、细胞冻存及复苏技术培养液高度：2.53.0mm第四章 每代细胞基本的生长过程一. 游离期：细胞接种后最初一段时间, 细胞在培养基中呈悬浮状, 胞体圆形二. 贴壁期：细胞附着于支持物上三. 潜伏期：四. 指数增长期影响因素 1. 细胞种类 (附着最强)巨噬细胞(30)一成纤维 细胞上皮细胞血细胞(最弱) 2. 生物因素 血清、培养液中的促附着因子3. 机械，物理等 离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着增加细胞粘附的措施（因素）1.增加支持物粘附性a. 赖氨酸类b. 血清c. 某些生物活性物质,纤维性物质d. 减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液e. 减少培养液中血清的含量 使培养液黏度降低f. 培养液中离子成分及其浓度 如，培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展g. 培养液的温度低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁伸展过程细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状 当接触坚硬平面 即铺展于底物上，扁平状 与底物形成很多接触点 伸展分几个阶段(1)开始阶段 开始附着铺开 细胞附着于底物 球形的细胞，下方表面与底物接触成扁 但尚未形成新的伪足 (2) 放射状铺展阶段在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起伪足形状 主要 柱形丝状: 直径0.2-0.5um 长10-20 扁平片状: 厚0.1-0.5 宽2-5 尚有: 小泡状叶状: 直径1-2 开始时: 絲状多 以后 片状增加 许多伪足 形成薄的胞质小片牢固贴于底物 胞体中央部分 扁 整亇细胞扁平(3) 极化阶段细胞最后伸展附着的情况 实验：用多种细胞， 以显微操作及缩时电影 定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况 检测-显微针头 结果：附着规律附着点： 附着规律几乎未见于细胞的中央区 (如不在核之下) 总在边缘，边缘”摆动”活动的部位 凸的边缘 在薄的边缘 附着区： 约为细胞下面表面的15-35附着、伸展的条件底物 细胞能在很多固体表面附着 最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素： 活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中， 或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上 如Fn，胶原，聚赖氨酸 机械，物理因素 三. 潜伏期细胞活着但无分裂.细胞株624h原代2496ho 四. 指数(对数)增长期o 细胞增殖旺盛, 数量成倍增多, 最适合实验研究. 35d以后来到.o 判断方法:o a. 细胞群体倍增时间o B. 细胞分裂指数o 五. 停止期(衰退期) o 细胞长满瓶壁, 有活力, 不增殖, 能存活一段时间. 如传代进