生物芯片技术.doc

生物芯片技术 电子083班 陈仕强 6100208101生物芯片技术概念生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。生物芯片技术研究的背景生物芯片技术研究背景基因组计划原定于2005年竣工的人类30亿碱基序列的测定工作由于高效测序仪的引入和商业机构的介入已经完成，。怎样利用该计划所揭示的大量遗传信息去探明人类众多疾病的起因和发病机理，并为其诊断、治疗及易感性研究提供有力的工具，则是继人类基因组计划完成后生命科学领域内又一重大课题。现在，以功能研究为核心的后基因组计划已经悄然走来，为此，研究人员必需设计和利用更为高效的硬软件技术来对如此庞大的基因组及蛋白质组信息进行加工和研究。建立新型、高效、快速的检测和分析技术就势在必行了。这些高效的分析与测定技术已有多种，如DNA质谱分析法，荧光单分子分析法，杂交分析等。其中以生物芯片技术为基础的许多新型分析技术发展最快也最具发展潜力。早在1988年，Bains等人就将短的DNA片段固定到支持物上，以反向杂交的方式进行序列测定。当今，随着生命科学与众多相关学科（如计算机科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等）的迅猛发展，为生物芯片的实现提供了实践上的可能性。生物芯片的设想最早起始于80年代中期，90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，即将特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上，作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出优点。生物芯片的应用样品制备芯片生物样品往往是复杂的混合物，在大多数情况下需要先对生物样品进行预处理，即样品制备。以核酸样品制备为例，它包括了细胞分离、破胞、脱蛋白、提取等多步工作。这些工作可以在样品制备芯片上完成。目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离和介电电泳分离等；芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、高压脉冲破胞以及化学破胞等。过滤分离芯片 过滤分离即根据生物颗粒的尺寸差异进行分离。针对人白细胞的分离，年美国宾夕法尼亚大学的研究小组研究出了一种芯片微过滤法。芯片微过滤器的工作原理是根据人白细胞的尺寸比红细胞大的特点，使人外周血流过微过滤器时只让血浆和尺寸较小的红血细胞及血小板通过，而截住尺寸较大的白细胞。加工微过滤用芯片是通过在硅片上刻出各种形状的过滤通道，通道直径为几个微米，然后再在硅芯片上键合上一块玻璃盖片而完成。通过反复试验和设计，微芯片过滤器已从最初的竖式形结构，通过竖式条状梳式结构过渡最后定型为横坝式结构。采用横坝式结构的优点是人白细胞的回收率高，过滤器不易被堵塞。微芯片过滤器的另一应用是它可将孕妇外周血中极少量的胎儿细胞过滤出来，供下一步作产前诊断之用。介电电泳分离芯片 介电电泳分离的原理是细胞在高频不均匀电场作用下产生极化，不同的细胞由于介电特性、电导率、形状不同而感应出不同的偶电极，因此受到不同介电力的作用。利用介电电泳方法制备样品的优点是：通过测量细胞的运动速度，可以得到细胞的介电特性；可以对细胞进行无物理接触的选择性操纵、定位、分离。生化反应芯片生化反应芯片的目的是把在实验室试管中进行的生化实验缩微到一块小小的芯片上。目前较典型的生化反应芯片包括聚合酶链反应（ -，）芯片、药物合成芯片等，其中扩增芯片是生化反应芯片的典型代表。在芯片上进行扩增反应的背景是，目前在生物芯片领域中所用的检测仪器灵敏度还不够高，所以从血液或活体组织中提取的在标记或应用前都需要扩增复制。例如，在对一个肿瘤的活体解剖样品进行检测时，需要在几千个正常基因中找到一个异常的癌基因，显然这需要对样品进行必要的扩增复制才易于检测。作为生物学中最常用的扩增手段，由变性、延伸、退火三个步骤所构成，其每个步骤的工作温度大约分别为、。通过该反应可将极微量的成千上万倍地扩增，以满足实验需要。检测芯片 检测芯片主要包括毛细管电泳芯片和微阵列芯片两类。毛细管电泳芯片毛细管电泳（ ，）对于测序、司法鉴定、产物分析来说是一个强有力的手段。与平板凝胶电泳相比，毛细管电泳能更快速、更准确地分离片段，这是因为可以在毛细管两端加上更高的电压。毛细管电泳的缺点是一次只能分析一个样品，毛细管微阵列电泳将平板凝胶电泳和毛细管电泳两种方法的优点结合起来，在毛细管微阵列上并行地进行电泳，它能增大电泳泳道数目、提高电泳速度，是一种有着巨大应用前景的方法。在毛细管电泳的基础上，近几年发展出集成度更高的集成毛细管电泳技术。集成毛细管电泳技术是在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀出毛细管槽，用盖板封闭好后，在毛细管中填入媒体，使电泳分离的整个过程集成到一块几平方厘米的基片上。集成毛细管电泳芯片具有高效、快速、试样用量少等优点，并已经在免疫测定、分析和测序、氨基酸和蛋白质分析、生物细胞研究方面得到应用。伍利（ ）等人报道的方法，利用光刻掩膜和化学刻蚀技术在玻璃基底上光刻出微通道阵列，然后使基底与另一块玻璃片键合构成毛细管阵列，其中上层玻璃片上钻有小孔作为样品输入孔。片段在缓冲液中被荧光标记，最后利用激光共焦荧光探测系统检测毛细管电泳的结果。拉加利（ ）等人构建了一种将反应和毛细管电泳集成在一起的器件。他们将热循环所需的加热元件直接微加工在器件上，升温降温的速度为每秒，每一次热循环的时间为秒，利用纳升容量的微阀和疏水性出口将样品输运到纳升容量的反应腔中。基于该集成化器件，能够实现对单个分子的扩增和检测。此外刘英杰等人还构建了一种基于聚碳酸酯材料的集成毛细管器件来分析样品。他们利用压模方法加工出毛细管微通道，聚碳酸酯材料在键合前接受了紫外线辐射以增强亲水性。实验表明该器件能显著区分长度为个碱基对、个碱基对个碱基对等的片断。微阵列芯片微阵列芯片基于杂交反应的原理，先将许多片段末端固定在芯片上，然后让荧光标记的样品核酸通过流路或加样至芯片上，杂交反应结束后清洗芯片，留在芯片上的样品核酸即可用荧光检测的方法来检测。由于微阵列芯片不要求先对基底做微细加工，因此可利用自动化或化学合成方法在基底上直接施加或合成生化物质。目前有种典型的微阵列芯片制备方法：光引导原位合成法、接触式点涂法、化学喷射法、压电喷射原位合成法。 光引导原位合成法是将微电子工业中的光刻技术与的光化学合成方法相结合。首先把用光敏保护基团保护的种核苷酸固定在玻片上，然后根据设计要求用不同的掩模板对玻片进行掩蔽，光照处的光敏保护基团分解，暴露的地方即可加上新的被保护的核苷酸，如此循环下去就能以很高的密度和精度来制备微阵列芯片。现在人们已经能在厘米的玻片上合成万组寡核苷酸。这种方法的缺点是需要花费大量的时间和成本来制备掩模板，因为寡核苷酸的每个碱基位需要块掩模板，合成一个个碱基对的微阵列芯片就需要块掩模板。接触式点涂法先将探针合成好，然后通过一个点接触装置自动地将探针点到玻片上的指定地点。点接触法的优点是快速、经济、多功能，缺点是每种样品都必须是合成好、经过纯化并事先保存的。化学喷射法是以定滴供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从喷嘴内将生物样品喷射到玻璃基片上。喷射法所需的样品是已经合成好的，它与点接触法的区别是喷嘴不与玻片接触。压电喷射原位合成法主要包括两个步骤：先在直径为毫米的二氧化硅基底上制备高密度的小坑，每个小坑的直径为微米，间距微米，共约万个小坑，小坑内作羟基化亲水处理，小坑间作氟化疏水处理，这样得到的小坑即可作为合成的微型反应池；然后根据实际要求，在个压电喷头中分别装入、核苷酸，由计算机控制微阵列芯片方向的运动，将种核苷酸喷射到适当的小坑中，由此在预制的基底上并行合