植物激素对愈伤组织形成和分化的影响.doc

实验 植物激素对愈伤组织形成和分化的影响 在植物组织培养中，原已分化的外植体（根、茎、叶、花、果实、种子、花粉等）细胞，又能重新进行分裂生长，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这个过程称为脱分化。愈伤组织经过继代培养后又可分化形成根和芽，称为再分化。植物激素在“再分化”中起重要作用。 【原理】 愈伤组织分化根和芽受培养基中生长素和细胞分裂素的相对浓度的影响，生长素/细胞分裂素比值高时，促进根的分化；比值低时，则促进芽的分化；两种激素比值适中时，则愈伤组织生长占优势或不分化。这样，通过改变两种激素的相对浓度即可有效地调节愈伤组织再分化的进程。 【仪器与用具】 超净工作台；高压灭菌锅1个；手术刀一把；长柄镊子1把；三角瓶4 支； 容量瓶：25ml、50ml、500ml、1000ml各1支；吸量管：1ml、2ml、5ml、10ml各1支；培养皿1个；下口杯1个；烧杯1000ml 1个；酒精灯1个；牛皮纸；白线绳；培养室。 【试剂】75乙醇；1次氯酸纳；1mol/L HCI；琼脂；6-苄基腺嘌呤；萘乙酸；MS培养基中各种化合物（配方见附录七）。 【方法】 1.配制培养基 按MS培养基配方（见附录七），先配制各母液。(1)按表36-1，配置10倍的大量元素母液：表36-1 10倍的大量元素母液配置表无机盐NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4重量(g)16.5194.43.71.7用蒸馏水溶解并定容至1000ml。(2)按表36-2配置100倍的微量元素母液：用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 (3)200倍的铁盐母液：称EDTA-Na2 3.37g，FeSO47H2O 2.78g，用蒸馏水溶解并定容至500ml。 (4)有机成分： 20mg/ml的肌醇溶液 称取2g肌醇，用蒸馏水溶解后定容至100ml。 0.5mg/ml的烟酸溶液 称取12.5mg的烟酸，用蒸馏水溶解后定容至25ml。 1mg/ml的甘氨酸溶液 称取25mg甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容至25ml。表35-2 100倍的微量元素母液配置表无机盐重量（mg）KI83H3BO4620MnSO44H2O2230ZnSO47H2O860Na2MoO42H2O25CuSO45H2O2.5CoCl26H2O2.5 0.5mg/ml的盐酸吡哆醇（维生素B6） 称取12.5mg盐酸吡哆醇，用蒸馏水溶解后定容至25ml。0.1mg/ml的盐酸硫胺素（维生素B1） 称取10mg盐酸硫胺素，用蒸馏水溶解后定容至100ml。 (5)植物激素： 0.1mg/ml的萘乙酸溶液 称取10mg NAA，用少量95乙醇溶解后，用蒸馏水定容至100ml。 1mg/ml 6-苄基腺嘌呤 称取50mg6-BA，用少量1mol/L的HCl溶解后，用蒸馏水定容至50ml。将各种元素的母液混合，配制成MS培养基，其中1升体积中所含各种元素的母液含量如表36-3：表36-3 1L MS培养基中各种元素的母液含量大量元素母液100ml微量元素母液10ml铁盐母液5m l肌醇母液5ml甘氨酸母液2ml烟酸母液1ml盐酸吡哆醇母液1ml蔗糖30g盐酸硫胺素母液1ml琼脂9g再按表36-4分别加入NAA和6-BA母液：表36-4 培养基14加入NAA、6-BA配置表培养基1234NAA母液0.1ml0.2ml0.1ml06-BA母液3ml3ml03ml 先在三角烧杯（或不锈钢锅）加入600ml蒸馏水，加入所需的琼脂和糖，在水浴锅里将琼脂溶化，如果直接加热应不停地搅拌，防止在瓶底（或锅底）烧焦或沸腾溢出。再将溶解的琼脂糖溶液倒入盛有上述各种物质母液的下口杯中，混匀，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至5.8，用蒸馏水定容至1升。将培养基分注到三角瓶或试管中，按容器的大小和培养要求放入适当量的培养基。分装时注意不要把培养基沾附到瓶口或管口附近的内壁上，以免培养过程中发生污染。分装中还要不时搅动下口杯中的培养基，否则先后分装的各瓶培养基凝固能力不同。盖上棉塞，用牛皮纸包扎好后，放入高压灭菌锅，1.2大气压下灭菌15min，冷却后备用。 2.材料的灭菌与接种 取开花前23天已露白的菊花花蕾，先用自来水冲洗花蕾，然后在75乙醇中浸泡15秒钟，后用无菌水冲洗2次，再用1次氯酸纳溶液浸泡15min，并不时轻轻搅动。用无菌水清洗三次，再转入放有滤纸而又无菌的培养皿中，用剪刀剪取舌状花，用解剖刀切取舌状花的5毫米见方大小的小块，一个100ml的三角瓶中68个小块。接种后放到培养室中培养。培养室内的温度为252，日光灯每天照明12h，光照强度约2000lx。 3.结果观察和记录 接种后注意观察记录外植体上愈伤组织和根芽出现的时间和数量，加以分析比较。 【注意事项】 1.在配制植物激素时，溶解试剂的乙醇和盐酸用量要少，用蒸馏水稀释时，慢慢沿烧杯内壁加入。 2.对培养基和材料及器皿的灭菌要严格。 3