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二苯胺试剂:鉴定DNA。 二苯胺试剂的配制 A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。 B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。 配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。 DNA的粗提取与鉴定 实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。 当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 注意事项 1.步骤3析出含DNA的黏稠物中,蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入,不能一次快速倒入。 2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌,但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。 实验用具 鸡血细胞液(510 mL);体积分数为95的冷酒精,蒸馏水,质量浓度为0.1 gmL的柠檬酸钠溶液,物质的量浓度分别为2 molL和0015 molL的NaCl溶液,二苯胺试剂;烧杯(100 mL,1个, 50 mL, 500 mL,各2个),漏斗,试管(20 mL,2个),玻璃棒,滴管,量筒(100 mL,1个),纱布,镊子,滤纸,铁架台,铁环,三角架,酒精灯,石棉网,载玻片,试管夹。 实验原理: 1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。 2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。 方法步骤: 1提取细胞核物质:顺时针方向搅拌,稍快,稍重。 5 min 2溶解DNA: 3析出含DNA的黏稠物:蒸馏水300mL,逆时针方向搅拌,缓慢 4过滤:取黏稠物 5再溶解:顺时针方向搅拌,较慢。3 min 6过滤:取滤液。 7提取出含杂质较少的DNA,逆时针方向搅拌,稍慢。5 min 8DNA的鉴定:沸水浴5min 【实验十二】DNA的粗提取与鉴定 实验原理 DNA在氯化钠溶液中的溶解度,是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时,DNA的溶解度最大,浓度为 014 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于95%的酒精溶液,但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 DNA中含有脱氧核糖,能与二苯胺(沸水浴)反应生成蓝色物质,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 目的要求1. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法。2. 观察提取出来的DNA物质的颜色和形状。 材料用具 材料:活鸡或鲜血鸡血。 仪器:离心机、恒温水裕锅、载玻片,玻璃棒,滤纸,滴管,量简(100 mL,l个),烧杯(100 mL,l个,50 mL、500 mL各 2个),试管(20 mL,2个),漏斗,试管夹,纱布。 试剂:酒精的体积分数为95的溶液(实验前置于冰箱内冷却24 h),蒸馏水,柠檬酸钠的质量浓度为 01gmL的溶液,氯化钠的物质的量浓度分别为 2 molL和0015 mol/L的溶液,二苯胺试剂。 方法步骤 实验前需要制备鸡血细胞液(由教师完成),制备的方法是:取柠檬酸钠的质量浓度为 01 gmL的溶液(抗凝剂)100 mL,置于500 mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约180 mL)注入烧杯中,同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免凝血。然后,将血液倒入离心管内,用 1000 rmin的离心机离。2min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离。心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。 1提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL,注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL,同时用玻璃棒充分搅拌5 min,使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。 2溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶液40mL加入到滤液中,并摇动烧杯,使其混合均匀,这时DNA在溶液中呈溶解状态。 3析出含DNA的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL)。 4滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中,含 DNA的粘稠物被留在纱布上。 5将DNA的粘稠物再溶解 取 1个 50 mL烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃择不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100 mL烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液,DNA溶于滤液中。 7提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL(使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳),并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA 。注意观察丝状物是什么颜色的。 8DNA的鉴定 取两支20 mL的试管,各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热 5 min,待试管冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在实验报告册上。 结论 步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什
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