Western Blot操作步骤.doc

Western Blot操作步骤（一）提蛋白 所需试剂： 细胞蛋白裂解液RIPA 蛋白酶抑制剂PMSF SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5) 1收集对数生长期的胶质瘤细胞于1.5ml EP中，离心，1000rpm/5min,弃上清，PBS洗两次。 2冰上操作，按RIPA:PMSF=100:1的比例配制裂解液，混匀，每EP管约加200ul（六孔板）（需计算）,于漩涡器上震荡几秒（以看不到沉淀为准,期间未震荡的EP管仍放入碎冰中，以确保低温）后，置碎冰上裂解20 min. 3. 4离心，12000rpm/10min. 4.取上清液180ul于新的EP管中，做好标记，于紫外分光光度仪上测蛋白浓度。（测浓度方法：准备去离子水，仪器1 1 2 UV 用3-5ul测量 ） 5.向每管加入45ul SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5)（180ul上清中加入45ul，即4:1），混匀，封口膜封口，沸水中煮约5-10min. 可于-80保存半年。（二）配胶、上样、电泳 1. 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在烘箱里烤干。 2玻璃板对齐后放入夹中卡紧（注意前后、上下方向），然后垂直卡在架子上准备灌胶，可先灌水看是否漏液。3配胶所需试剂： 双蒸水、30%Acr/Bic、1.0mol/L Tris.Hcl(PH6.8)、1.5mol/L Tris.Hcl(PH8.8)、10%SDS、10%AP（0.1g AP溶于1ml双蒸水中）、TEMED Tris(三羟甲基氨基甲烷)、SDS、甘氨酸、分离胶12% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml蒸馏水 1ml 2.0 ml 3.0 ml30%丙烯酰胺溶液 2.0 ml 4.0 ml 6.0mlpH8.8、Tris溶液 1.9 ml 3.8 ml 5.7 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml10%过硫酸铵 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml4 ml6 ml蒸馏水1.4 ml2.8 ml4.1 ml30%丙烯酰胺溶液0.3 ml0.6 ml1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris溶液0.25 ml0.5 ml0.75 ml10%SDS0.02 ml0.04 ml0.06 mlTEMED0.002 ml0.004 ml0.006 ml10%过硫酸铵0.02ml0.04ml0.06ml加AP、TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）。 配电泳缓冲液 Tris(三羟甲基氨基甲烷) 3gSDS 1g甘氨酸 14.4g蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存（低温易产生沉淀），次溶液可重复使用35次。 （电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的外槽，内槽最好使用新鲜的电泳缓冲液）3.1 按前面方法配12分离胶，加入AP、TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸胶沿玻璃板放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）3.2 30min后当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 3.3 按前面方法配5的浓缩胶,加入AP、TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 3.4 用水冲洗一下浓缩胶以冲净孔内的碎胶，将其放入电泳槽中,加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液要漫过内测的玻璃板,外部加到三分之一即可。安装好的电泳槽要保证不漏液）。3.5 根据所测蛋白浓度上样，每孔蛋白量约（30-100）ug,上样量约(10-20)ul,用10ul枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将枪头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，注意换枪头）。3.6 接通电源，注意正负极，以电泳槽下端有气泡向上冒出为准，电泳约40min,开始用80V，到分离胶以后用100V1h或者90min（此时蛋白跑成一条直线），电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。（三）转膜电泳期间配制转膜液转膜液 Tris 3g甘氨酸 14.4g蒸馏水至 700ml 然后磁力搅拌器中搅拌5min 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml (现配现用)1. 切一张35cm的硝酸纤维素膜，切膜时带手套，将切好的硝酸纤维素膜置于甲醇上浸10s才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的平皿里，要使膜浮于甲醇上，只有下层才与甲醇接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。）然后将膜与切好的带有目的条带的分离胶一起放入转膜液中平衡10min.2. 用转膜液将两张滤纸在半干转板上浸湿，按照滤纸、膜、胶、滤纸的顺序叠放好（注意不要有气泡，放一层东西加一层转膜液），最后用玻棒擀走气泡。3接通电源，转一块胶300mA，2h; 4转完后，做好正反面标记，将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇），胶用考马斯亮蓝染色。（染色可做可不做）考马斯亮蓝配方 考马斯亮蓝R-250 1.0g 甲醇 450ml 冰醋酸 100ml 蒸馏水至 1000ml（四）封闭 所需试剂：Tween20、20TBS、脱脂奶粉 1. 用TBST洗膜2-3次，直至红色褪去。 2用TBST稀释的5%的脱脂奶粉室温（18）封闭1-2h,摇床上轻摇(转速20) 3用TBST洗5min。（转速40-50）TBST配方 Tween20 0.5ml 20TBS 50ml 蒸馏水至 1000ml封闭液： 1.5g脱脂奶粉+30ml蒸馏水（五）孵育抗体1 一抗（1:250封闭液）比例用TBST或封闭液稀释,将硝酸纤维素膜平铺在贴有封口膜的平皿上，一抗稀释液加在PVDF膜上至鼓胀起来即可。室温（18）静置孵育2h后，4过夜。2 用TBST在室温下脱色摇床上洗膜4次，10min/次（转速50-60）3. 二抗（羊抗兔）按1:5000的比例用TBST或封闭液稀释，同上方法室温（18）静置孵育1-2h。 4用TBST在室温下脱色摇床上洗膜4次，5 min/次（转速50-60），洗膜要彻底。（六）化学发光，显影，定影 （注意加入AB液后一定要避光） 1将PVDF膜平铺到封口膜上，将ECL发光液的A、B两种试剂等体积混合后，加到PVDF膜上，避光2-3min后，将膜移至一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。 2在暗室中，将1显影液和定影液分别倒入塑料盘中，取出X光片，打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间