抗体制备技术的发展及其医学应用.doc

抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。1.2 单克隆抗体研究阶段杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。试验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。1.3 基因工程抗体技术研究阶段自从第一个单克隆抗体产生以来, 单抗已广泛地应用于疾病的诊治上。然而长期以来, 临床上使用的单抗多为鼠源性单抗, 存在着很大弊端, 最突出地表现在其异源性异质性所引起的人抗小鼠抗体反应或超敏反应, 一方面降低了单抗的效价, 另一方面又会给病人带来严重的后果。因此, 对鼠源性单抗进行改进以及人源性单抗的研制成为单抗研究的主要方向。为了克服传统的鼠源性单抗存在的弊端, 随着分子生物学和细胞生物学的快速发展, 单克隆抗体的制备技术取得了比较大的进展, 包括对鼠源性单抗的改造、人源性单抗的研制及对抗体分子结构和功能的改造, 尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因转染色体小鼠技术为代表的人源性单抗制备技术的研制最为瞩目。1） 人鼠嵌合抗体和重构型抗体指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。1984 年报道研究出了人-鼠杂交瘤的构建方法, 并在1987年进行了第1次临床试验。 临床研究表明,嵌合抗体的副反应轻，产生人抗鼠抗体(HAMAs)反应率较鼠源性单抗低，而且在体内的半衰期也比相应的鼠单抗长68倍。 现已制备出大量抗结肠癌、乳癌、B 及T细胞恶性肿瘤的嵌合抗体，主要是针对肿瘤相关抗原。 1997 年Rituxan 和Herceptin在美国相继获准用于临床肿瘤治疗，Rituxan是以B细胞的CD20分子为靶点的人鼠嵌合抗体，对非霍奇金B 细胞淋巴瘤有疗效。 Herceptin是抗HER-2 /neu癌基因编码蛋白的单抗，临床研究表明对乳腺癌有效，与化疗药物联合则有更显著的疗效。表皮细胞生长因子受体( EGFr)在人鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达，因此抗EGFr的人鼠嵌合抗体也进入临床研究阶段 110。重构型抗体进一步减少了鼠源蛋白在嵌合抗体内的含量。 2） 抗体分子片段(小分子抗体或抗体衍生物) 完整的抗体分子很难用基因工程生产，且应用时不易进入病变组织，所以利用DNA重组技术制备抗体片段成为研究重点。 主要的抗体片段包括Fab片段和Fv片段。 Fab片段保留了亲本抗体的抗原结合活性，可进行基因工程生产，具有良好的应用前景。 单抗Fv片段与绿脓杆菌外毒素片段( PE40 ) 构成的免疫毒素(相对分子质量67 000)与用完整嵌合抗体构成的免疫毒素(相对分子质量190 000)比较，前者可使在裸鼠移植的人体肿瘤完全消退， 而后者仅使肿瘤部分缩小。 因此分子的小型化无疑是抗体工程中研制高效单抗药物的一条重要途径。抗体分子VL 与VH之间仅靠较弱的非共价键连接，在生理温度下不够稳定。 单链抗体( singlechain variable fragment ScFv)是将VH、VL 用一段连接肽基因连接起来的重组抗体片段，可提高Fv片段的稳定性。 其大小为完整抗体的1/6，且不易产生HAMA，体内蓄积极少，不易与非靶细胞结合，定位成像时清晰，易于基因操作和利用基因工程大量生产， 其应用主要是抗病毒和抗肿瘤。3） 双功能抗体和双特异抗体双功能抗体是将抗体或抗体片段与其它功能分子偶联后生成的一类抗体杂合分子。 功能分子部分是能够起到细胞毒作用或介导其他免疫细胞发挥效应的毒素、细胞因子、酶等，赋予了抗体新的功能。 1989年Chaudhary VK等人将抗卵巢癌的单链抗体基因ScFv与毒素基因PE40相连，在大肠杆菌( E. coli)中表达获得具有抗原结合活性和细胞毒作用的重组单链免疫毒素，治疗裸鼠体内的移植瘤，可使肿瘤完全消退。将抗体与药物代谢酶相连可用于前体药物治疗(又称“自杀基因”疗法)。 这种疗法将肿瘤细胞特异的调控元件或转录元件与自杀基因相结合，可使“自杀基因”特异地在肿瘤细胞表达，从而选择性地杀伤肿瘤细胞。双特异抗体是将抗体分子改造后生成的具有2种不同抗原结合特异性的抗体分子，它的一个臂针对靶细胞的表面抗原，另一个臂则针对免疫活性细胞表面的特征性分子，从而将抗体的靶向性与激活免疫细胞的杀伤功能结合起来，在生物医药领域有着广泛的应用前景。4） 噬菌体显示技术制备人源性抗体基于噬菌体可把抗体片段表达在外膜的能力而建立一系列的抗体文库，然后用目的抗原来筛选文库中相应的抗体片段，再经体外加工可形成有功能的完全人抗体。用此方法可制备针对简单或复杂抗原的单抗，并得到中等亲和力的抗体，但该方法需用高通量筛选。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。1985年. Smith将外源基因插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白质基因区。使目的基因编码的多肽在噬菌体表面表达，从而建立了噬菌体表面表达技术。现有一些已进入临床II/III期研究，如Cambridge Antibody Technology（CAT）的D2E7和CAT-152，分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。噬菌体展示技术简单易行,筛选容量大，可在短期内筛选出100万1亿个克隆,可获得高亲和力的人源化抗体。它直接从未经免疫的小鼠或人的淋巴细胞中得到抗体基因，可以获得完全人源化的抗体，克服了杂交瘤细胞的不稳定性的缺点。但该技术也存在一定的局限性，如库容量的有限性,密码子的偏爱性，氨基酸的修饰受宿主限制等,而且该技术依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的分子很难得到有效的表达。5） 人源化抗体利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。成功的例子： Herceptin：Genentech公司的抗HER2/neu抗体，用于治疗乳腺癌。Synsgis：Medimmune公司的抗F抗体，用于治疗呼吸道病毒感染。Zenapax：Protein Design Labs（PDL）/Roche的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。h-R3：古巴分子免疫学中心的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，用于治疗头颈癌。6） 核糖体展示技术最初称为多聚核糖体展示,是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的新技术。1997 年，Hanes和Plckthun等在此基础上加以发展和完善，建立了核糖体展示技术。它的基本原理是通过PCR扩增目的基因的DNA文库，同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译系统中孵育，是目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面，并形成“mRNA - 蛋白质- 核糖体”三元复合体，最后通过常规的免疫学检测方法，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT - PCR 扩增，经过多次循环过程,最终筛选出高亲和力的目标分子。该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术(如噬菌体展示)的局限性，如：需转化细菌或真核细胞，因效率不高而降低库容，减少抗体多样性等，并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降，同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于该技术是在体外翻译，体外筛选的特点，大大缩短了试验周期，省时省力，方便快速。2 单克隆抗体在医学中的应用单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为医学检验试剂，单抗可以充分发挥其优势。单抗的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。2.1 单克隆抗体在检测中的应用1） 诊断各类病原体 这是单克隆抗体应用最多的领域，已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点。尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。2） 肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，但对肿瘤相关抗原（例如甲胎蛋白和癌胚抗原）的单克隆抗体早已用于临床检验。近年来，有人利用单克隆抗体进行肿瘤分型，对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单克隆抗体主要用于体内诊断，结合X线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。3） 检测淋巴细胞的表面标志用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意义。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原是移植免疫学的重要内容，而应用单克隆抗体对HLA进行位点检查与配型可得到更可信的结果。4） 机体微量成分的测定应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，如诸多酶类、激素、维生素、药物等；对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均具有实际意义。2.2 单克隆抗体在疾病治疗中的应用目前利用单抗对疾病进行治疗已取得了很大的成果，主要是将单抗同药物耦联，再与病原体或肿瘤的特异抗原结合后发挥作用。1） 抗细胞表面分子单抗 可抑制同种免疫反应，主要用于移植排斥反应的防治。莫罗单抗(muromonab - CD3，Orthoclone OKT3)是FDA批准用于肾移植病人防止异体排斥反应的第一只鼠源型单克隆抗体119 。2） 抗细胞因子单抗可抑制自身免疫反应，主要用于自身免疫性疾病的治疗。单克隆抗体通过清除激活的细胞、阻滞其功能、或将升高的促炎细胞因子水平降至正常而抑制过度的免疫病理学反应。如TNF阻滞剂，用于治疗类风湿性关节炎和节段性回肠炎取得了较好的效果。阿达木单抗(Adalimumab)是继伊那西普( etanercept)和英夫利昔单抗( infliximab)之后第三代TNF -拮抗剂，法国生产的，是最新研制的用于治疗类风湿性关节炎的单克隆抗体。3） 抗肿瘤单抗可用于肿瘤的导向治疗。第一个获准用于癌症治疗的嵌合型IgG-1单克隆抗体是rituximab (Mabthera) ,其作用标靶为CD20 (即在前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的跨膜蛋白) 。多中心临床研究显示,本品能有效治疗复发的低度滤泡型非何杰金淋巴瘤。4） 抗血小板治疗糖蛋白II b /a受体拈抗剂能阻滞血小板活化和聚集的最后共同途径,