生物信息学论文Doc1.docx

对欧洲油菜中假定的17.9负责二级热休克蛋白的研究进行生物信息学分析黄玉霞(201007010105)(周口师范学院生命科学系，河南周口，466001)摘要：采用生物信息学方法，对其编码的蛋白从理化性质、二级结构、细胞定位、信号肽预测，磷酸化位点，跨膜结构域及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明，该欧洲油菜假定的17.9负责二级热休克蛋白为154个氨基酸，该蛋白二级结构中以-螺旋（37.01%）和扩展束（19.48%）-转角（7.14%）和无规则卷曲(36.36%)为主，不存在跨膜区，N端不存在信号肽序列，亚细胞定位于细胞质中；存在3个不稳定区，不形成球形蛋白域。该研究结果为进一步研究提供了理论基础。关键词：芸苔属植物籽（欧洲油菜）；热休克蛋白；生物信息学引言：热休克蛋白（Heat shock proteins，又称热激蛋白，简称为HSP）是一类功能性相关蛋白质，当细胞受到升高温度或其他压力时它们的表达就会增长1。这种表达的增长是受到转录调控的。热休克蛋白戏剧性地上调控是热休克反应的关键部分并且主要由热休克因子引导2。并且它是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子热休克蛋白 small Heat Shock Proteins (sHSPs)( Kyeong et al., 1998)。绝大部分生物细胞生成的HSP分子量都在80110kD、6874kD和1830kD之间。不同分子量的HSP，在细胞内的分布也有所不同，例如，在酵母菌中发现的分子量为89kD的HSP是一种可溶性的细胞浆蛋白质，而分子量为68kD、70kD、110kD的HSP却主要分布于核或核仁区域。总的来说，HSP的诱导和调节的机制迄今还不清楚，只有一些推测。HSP可提高细胞的应激能力，特别是耐热能力，HSP还可调节Na+-K+-ATP酶的活性，有人通过四膜虫属细胞热休克的研究，发现有些HSP具有促进细胞内糖原异生和糖原生成的作用，使细胞内糖原贮量增多，从而提高应激能力。此外，有人还报道，热、乙醇、亚砷酸钠的预处理不仅能使某些细胞产生热耐受，还能使细胞对阿霉素（adriamycin）的耐受性增强，提示HSP可以增强对各种损伤的抵抗力。至于在人类的应激中，HSP究竟起什么作用，目前还知之甚少。植物在热激35min内HSPmRNA的含量增加。在20分钟内可以检测到新合成的HSP。如果植物一直处于热激状态，HSP合成可以持续几个小时。HSP广泛存在于植物细胞膜、细胞质、叶绿体线粒体等组织中。目前已发现的众多HSP，它们的主要功能是参与新生肽的折叠以及蛋白质变性后的复性、降解，维持胞内环境的稳定3。因此热激蛋白的研究将是植物抗逆境胁迫的重要领域。植物细胞在受胁迫时HSPs能合成 ，而且不同的细胞中存在不同类型的，这些结果表明:在基本的生命过程中起一定的作用 。因此胁迫下产生的HSPs与未受胁迫时HSPs之间的关系也是一个非常值得探讨的问题。从目前研究来看，还没有任何有关转基因植株中HSPs表达量增加或减少的报道，更没有HSPs量的增加可使转基因植株抗逆性能力提高的报道。如果转HSPs基因植株中HSPs量增加后确实可以提高其耐热、抗旱能力，那么就可以断定HSPs具有增强植株的耐热、抗旱等功能。 目前已经获得了一些HSPs的抗体以及HSPs的cDNA探针，有实验表明在豌豆、大豆和玉米中能克隆出叶绿体smHSPs的cDNA，这些将可能有助于上述问题的解决。分子伴侣是当今国际上蛋白质研究的一个热点，其作用的分子机理已有一些假说，但还需进一步深入研究 搞清楚分子伴侣的作用机理对于揭示植物细胞抗逆性的本质无疑是十分重要的 此外，对HSPs生物学特性及交叉保护的研究也将会是未来的研究热点。因此，只有在彻底弄清楚HSPs诱导机理以及各种HSPs的功能之后才有可能有目的地利用HSPs改良蔬菜，为农业生产服务。此外，油菜对干旱以及其它逆境胁迫的研究不能仅限于搞清楚一两个蛋白或通过转移一两个基因来提高其抗性，而应当结合其它相关研究（如植物抗逆性调控基因或植物信号感受系统），综合地进行研究，这样才能对植物的抗旱机理有更深的认识，实现培育新的抗性品种的突破相信随着人们对耐旱分子机制研究的不断深入、植物蛋白质组学研究方法和技术的改善，基因操作技术也将日趋完善，将抗旱基因转移到无抗旱性的油菜组织中，以增强油菜抗旱性，也是很有可能的4-6.。本文利用生物信息学相关软件对其进行综合预测分析，为进一步研究其在油菜发育过程中的调节作用提供理论基础。1.油菜热休克蛋白的生物信息学分析1.1利用Protparam（/proteomics）工具预测蛋白质的基本理化性质，利用SOPMA工具预测蛋白质的二级结构，利用NetPhos 2.0 Server 预测磷酸化作用位点，在/proteomics上利用TMPred工具分析蛋白质的跨膜区和跨膜方向，利用TargetP 1.1 Server预测氨基酸前导肽的细胞定位。2 结果与分析2.1对欧洲油菜中假定的17.9负责二级热休克蛋白序列分析利用NCBI得到的欧洲油菜中假定的17.9负责二级热休克蛋白序列为：gi|397787610|gb|AFO66516.1| putative 17.9 kDa class II heat shock protein Brassica napusMDFGRFPIISILEDMLEVPEEHSEKGRSNPSRAYVRDQKAMAATPADVIEQPDAYAFVVDMPGIKGDEIKVQVESDNVLVVSGERKRESKENEGVKYVRMERRMGKFMRKFQLPENADLEKISASCNDGVLKVTVGKLPPPEPKKPKTIQVQVA图1欧洲油菜克休克蛋白保守结构域2.2对欧洲油菜中假定的17.9负责二级热休克蛋白进行理化性质分析利用Protparam（/proteomics）工具预测蛋白质的基本理化性质,表明该蛋白分子式为C758H1234N212O233S8，分子量为17301.9，理论等电点（PI）为5.97。含有19种基本氨基酸，其中含量最高的是Val (V)（11.0%），含量最低的是Cys（0.6%）、His (H) （0.6%）；其中带负电荷的氨基酸残基（(Asp + Glu): 26个，带正电荷的氨基酸残基(Arg + Lys): 25个。其水溶液在280nm处的消光系数（Extinction coefficients）为4470。该蛋白的不稳定系数（Instability index）为42.22，为不稳定蛋白，脂肪系数（Aliphatic index）是76.49；平均亲水系数（Grand average of hydropathicity）为-0.587。其氨基酸组成如表：表1 该油菜17.9负责二级热休克蛋白氨基酸组成氨基酸比例氨基酸比例氨基酸比例氨基酸比例氨基酸比例Ala (A)6.5%Gln (Q)3.9%Leu (L)4.5%Ser (S)5.8%Pyl (O)0.0%Arg (R)6.5%Glu (E)10.4%Lys (K)9.7%Thr (T)1.9%Sec (U)0.0%Asn (N)3.2%Gly (G)5.8%Met (M)4.5%Trp (W)0.0%Asx (B)0.0%Asp (D)6.5%His (H)0.6%Phe (F)3.2%Tyr (Y)1.9%Glx (Z)0.0%Cys (C)0.6%Ile (I)5.2%Pro (P)7.8%Val (V)11.0%Xaa(X)0.0%2.3对该蛋白质进行二级结构、蛋白紊乱区、球蛋白区预测：利用软件SOPMA对该蛋白二级结构进行预测，结果表明，该蛋白质序列中-螺旋占37.01%，扩展束占19.48%，-转角占7.14%，无规则卷曲占36.36%。利用GlobPlot软件（http:/globplot.embl. de/）对欧洲油菜17.9负责二级热休克蛋白序列中的紊乱区、球蛋白区进行预测，结果(图4)显示该蛋白存在3个较小的不稳定区，分别位于1-10，23-30，132-147氨基酸位置，在2-131位处形成一个较大的潜在球形蛋白区。图2 欧洲油菜17.9负责二级热休克蛋白进行二级结构预测图3欧洲油菜17.9负责二级热休克蛋白紊乱区、球蛋白区预测2.4对该蛋白质进行细胞定位分析：利用TargetP 1.1 Server 软件对该蛋白质进行细胞定位分析则可知：该蛋白主要分布于细胞质（RC = 2），表明可靠度可以。图3欧洲油菜17.9负责二级热休克蛋白进行细胞定位分析2.5对该蛋白质进行信号肽预测：利用SignalP 4.0 Server软件对该蛋白质进行信号肽预测，结果表明，该蛋白N端序列不存在任何信号肽序列。图4 欧洲油菜17.9负责二级热休克蛋白信号肽预测2.6对该蛋白质进行磷酸化位点预测：利用NetPhos 2.0 Server对该蛋白质进行磷酸化预测结果（图1）表明，该蛋白具有多个不同的磷酸化位点，其中有5个丝氨酸磷酸化作用位点（Ser: 5）、1个苏氨酸磷酸化作用位点（Thr:1）和2个酪氨酸磷酸化作用位点（Tyr:2），表明该蛋白质磷酸化以丝氨酸磷酸化为主，兼有苏氨酸和酪氨酸磷酸化。图 5 欧洲油菜17.9负责二级热休克蛋白进行磷酸化位点预测2.7 对该蛋白进行跨膜分析在/proteomics上利用TMHMM工具分析蛋白质的跨膜区和跨膜方向，可得到该蛋白不存在跨摸区，结果如下图：图6欧洲油菜中假定的17.9负责二级热休克蛋白跨膜结果预测2.8欧洲油菜、拟南芥等植物同源蛋白的比较和同源进化树的构建欧洲油菜热休克蛋白的氨基酸序列分别与拟南芥琴（Arabidopsis lyrata subsp. lyrata）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、温州蜜柑（Citrus unshiu）、可可树（Theobroma cacao），同源蛋白的氨基酸序列比对结果显示，其序列相似性分别达到89%、77%、74%和70%，表明十字花科植物籽类蛋白氨基酸序列总体上比较保守，预期形成稳定的球型蛋白结构执行其功能。运用DNAman软件对以上几种禾本科植物该蛋白氨基酸序列进行进化树构建（图7），结果表明，欧洲油菜热休克蛋白与拟南芥琴亲缘关系最近，首先聚为一类，然后与拟南芥归为一类,他们与温州蜜柑和可可树亲缘关系相对较远。图7几种植物热休克蛋白蛋白的氨基酸序列比较图8几种植物F-box 蛋白序列的进化树3 讨论与结论：植物HSPs是一类在逆境条件和特定发育阶段表达的小分子蛋白，是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用，有机体在受到逆境胁迫后，体内变性蛋白急剧增加，热激蛋白可以与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态。此油菜中的热休克蛋白很不稳定，因此在研究中应特别注意。热休克蛋白（HSPs）也是植物体内最大的酶家族之一,是目前国际研究的热点之一，不同领域的科学家正在从不同领域揭示其本质。在植物体内，植物HSPs作为关键物质主要参与植物的抗逆性，因此，研究植物HSPs对揭示植物抗逆性及其过程具有重要理论价值。本实验用生物信息方法学对其编码的蛋白序列，进行了理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位，功能域分析，初步获得了该蛋白的一些特性。并对其与其作物同源热休克蛋白蛋白的氨基酸序列进行比对分析，获得了其进化相关的信息。可得知不同植物间，热休克蛋白的同源性不同，本次试验中可得知这几种植物的同源性比较大，可能与其mRNA有关7。并且HSPs的高度保守性说明它们在生物生命活动中具有重要的作用。因此可根据该基因序列设计引物，研究其在油菜发育的不同时期在各器官或组织中的表达情况，以探索其具体功能。4参考文献：1. De Maio A. Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams. Shock (Augusta, Ga.). 1999.January, 11 (1): 112. doi:10.1097/00024382-199901000-00001. PMID 9921710. 2. Wu C. Heat shock transcription factors: structure and regulation. Annual review of cell and developmental biology. 1995, 11: 44169. doi:10.1146/annurev.cb.11.110195