微生物实验3.docx

微生物实验报告细菌的鞭毛染色及活细菌的运动性观察刘欣怡201100140057 生命科学基地班 组别：周一下午三组 同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟 实验时间：2012年10月 号一、实验目的1.了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法。2.了解鞭毛的形态特征。3.学习用压滴法观察细菌的运动性。4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术.二、实验器材1 菌种枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单细胞菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。2 溶液和试剂硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、95%的乙醇水溶液。3 仪器和其他用品酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子、试管夹、吸水纸等。三、实验目的1、鞭毛是某些细菌表面细长弯曲的丝状物，是细菌的运动器官和特殊构造。细菌鞭毛的长短、数量和生长位置是鉴别菌种的一个重要的形态学指标，也是细菌重要的抗原物质与致病因素。根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。 2、鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为1030nm,只有用电镜才能直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difo氏染色法）进行染色。本实验采用的是硝酸银染色法。3、枯草芽孢杆菌是鞭毛周生，而铜绿假单细胞菌是鞭毛端生。4、在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强细菌和周围的液体难以区分。进行悬滴法观察时，如经常难以找到样品，可在滴加液滴之后，用记号笔在液滴周围画一短线作为标记。观察时首先在低倍镜下对准记号线聚焦清楚后，再移动凹载玻片寻找液滴的位置。四、实验内容在本实验所提供的枯草芽孢杆菌和铜绿假单细胞菌中任选其中一种菌进行实验。本实验共两部分，第一部分是用压滴法观察活细菌的运动；第二部分是用硝酸银染色法观察细菌鞭毛的形态。五、实验步骤（一）压滴法观察活菌的运动1、涂片：将洗净的载玻片放置自然干燥后，用胶头滴管在载玻片中央滴一滴蒸馏水，注意水滴不要太大，滴好后放置在桌面上。在酒精灯火焰旁左手拿长有细菌的试管（斜面培养基），右手拔出试管塞，用已经在酒精灯火焰上烧灼过2遍的接种环伸入试管，在试管壁上稍稍冷却后，在菌落上蘸1到2下，取出接种环，稍稍在酒精灯上烧一下棉塞，然后塞入试管。将接种环上蘸取的细菌在载玻片上的水滴中蘸3到4下，可看到水滴略有浑浊。2、加盖玻片：如下图所示，向载玻片上放置盖玻片。然后向下缓缓放下盖玻片至盖玻片完全压在载玻片上，注意动作缓慢、轻巧不要产生气泡。3、观察：将做好的玻片放在显微镜上进行观察。操作通显微镜正确操作，调暗光，先低倍镜，再逐渐增大倍数。可以再玻片上用记号笔做一小记号，便于在显微镜视野中找到菌。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。（二）硝酸银染色法观察鞭毛1、洗片并净片：将载玻片用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，5min后取出载玻片自然干燥。使用时用镊子取出，用试管夹夹着载玻片的一个小角，在火焰上来回移动，烧去乙醇及可能残留的油迹。2、涂片:在载玻片的一边上滴一滴蒸馏水(不要太大，也不要太小)，无菌操作同上用接种环蘸取一些菌，然后在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下，会看到水滴略微变混，将载玻片倾斜竖立，会看到菌液滴向下流出一条粗线（切勿涂抹），然后用吸水纸在竖立的载玻片下端吸去多余的菌液，注意不要吸去太多使得载玻片上菌太少而易使实验不成功.如下图所示：（液滴沿着竖立的玻片向下流）3、自然干燥：涂好的载玻片水平放置自然风干，至载玻片上的长条菌液痕迹全部干燥好，即细菌在载玻片上固定好4、用A液染色：在自然干燥好的载玻片上，用胶头滴管向载玻片滴加A液，让A液把菌都覆盖上，载玻片水平放置，染色3到5分钟，为了实验能成功，本次试验A液染色时间为5分钟。5、水洗： 将A液染色好的载玻片翻转过来，用较缓的小水流冲洗载玻片没有细菌的那一面，水洗至流出的水无色为止。6、用B液染色：水洗好的载玻片，不用干燥，直接用B液先冲洗，冲去多余的水分，然后让B液覆盖所有菌染色30秒到一分钟，染色过程中稍微加热一下，可以在酒精灯火焰上来回过3到4下。7、水洗： 将B液染色好的载玻片翻转过来，用较缓的小水流冲洗载玻片没有细菌的那一面，水洗至流出的水无色为止。8、自然干燥： 将水洗好的载玻片（有菌一面朝上）放置自然干燥，不要用嘴吹干，更不要用火烧干。9、镜检：将制好的玻片放在显微镜下观察，可以直接在载玻片上滴加香柏油即直接用油镜进行观察（因为鞭毛太小，在非油镜的光学显微镜中观察不到），也可以先用非油镜的光学显微镜进行观察，找到枯草芽孢杆菌个体后，再滴加香柏油换为油镜观察，这样容易找到目标。观察鞭毛时，可以调暗视野背景光，这样更容易看到鞭毛。六、实验现象及结果1、压滴法观察活菌运动的实验的观察结果：用压滴法观察枯草杆菌的运动性，由于自己的载玻片上滴加的蒸馏水有点多，盖上盖玻片立即观察时，盖玻片下里液体流动较明显，菌体随水流运动，运动方向较统一且呈运动路径多直线。待用吸水纸稍稍吸去多余的蒸馏水后，在盖玻片下液体充分但不流动时观察，眼睛盯着视野看一会儿会发现有几个细菌朝不同的方向运动，它们运动过程中可转弯；很多细菌在原地不动；有的细菌会在原地左右小幅度晃动，应该是布朗运动。 如果吸去的水分太多，菌又都不动了。2、硝酸银染色法观察细菌鞭毛表1、染色后观察到的实验结果菌种鞭毛着生位置枯草芽孢杆菌周生铜绿假单胞菌端生3、实验观察结果记录照片(全班内的)枯草芽孢杆菌观察图（图中能看到一条鞭毛，其放大图如下），但遗憾的是，在视野中没有枯草芽孢杆菌的鞭毛，图中的鞭毛是铜绿假单细胞菌的鞭毛。（图中是枯草芽孢杆菌的观察视野，图片中有一根长长的鞭毛，在一个体型较小的细菌一端长出，应为铜绿假单细胞菌，这是照片放大后的截图）（该图为鞭毛染色观察实验中铜绿假单细胞菌的观察视野，可以看到图片中央有一根长长的鞭毛。）补充：枯草芽孢杆菌鞭毛观察图（资料中获得）七、实验结果分析1、观察活细菌的运动有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个有鞭毛细菌之间出现明显的相对位移才算是活细菌在运动，要与布朗运动或随水流动相区别，两个活细菌一起向同一方向近似直线运动不是细菌真正的运动。不具有运动能力的细菌仅能进行布朗运动或随水流动，两个细胞间的位置相对恒定。铜绿假单细胞菌因为个体比较小，盖上盖玻片直接观察时，在观察视野中是随水流运动，它们的运动方向较统一且呈直线状；当液体充分但不流动时（用吸水纸吸去适量多余的水分），细菌的运动有一定方向，且能较容易的观察到它们的运动（相对运动）。当水分丧失后，菌体就不再运动。2、硝酸银染色法观察鞭毛A、经硝酸银染色法染色的有鞭毛细菌菌体呈深褐色，它们的鞭毛呈浅褐色且通常呈波浪形，弯弯曲曲。B、有的鞭毛从细菌上断下来，会观察到细菌上有些较短的毛状物，这些毛状物是鞭毛断落下后留在细菌上的一部分，这一部分会比鞭毛稍粗一些，会容易观察到。C、细菌鞭毛染色要求非常小心细致，鞭毛染色成功的关键主要在于：(a)细菌蘸取、接种等动作要轻缓，不能剧烈振荡、涂抹菌液；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c)制片过程中所涉及的固定和干燥步骤均不能加热和用热风吹干，否则鞭毛易脱落。（d)载玻片要求清洁、光滑、无油污，否则菌液不能散开，造成菌体堆积，鞭毛相互纠缠而难以看清楚，而且染色后背景脏乱。（e）硝酸银染液B液染色时间的掌握很关键。八、实验注意事项1、观察活细菌的运动实验中制片时蒸馏水不可加得太多，过多的话，菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内会见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。2、检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动3、若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一滴，而且盖玻片厚度不能超过0.17mm，在操作中应该十分小心仔细，以免压碎盖玻片，损坏镜头。4、取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。5、取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；否则鞭毛易脱落，造成染色失败。6、鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。7、A、 B染液染完后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。8、加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，染色效果较不加热为好。9、染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。10、加热时，使用载玻片夹子或者试管夹，以免烫伤。11、使用染料时注意避免沾到衣服上。12、实验后洗手。13、将载玻片竖起使菌液滴向下流形成菌带时，用吸水纸吸去多余的菌液，要注意不要吸取太多，使得载玻片上菌量很少。14、硝酸银染色剂的A液和B液在使用前需要振荡混合均匀。15、观察活菌运动实验中，放置盖玻片要小心仔细，以防产生气泡。16、鞭毛染色实验中的载玻片在用去污粉清洗干净后，需要放置在95%酒精溶液中5分钟，再取出进行试验。17、用硝酸银A、B液染色时，染色要覆盖所有菌面，并且注意掌握染色时间。九、实验思考题1、除鞭毛染色法外，还有什么方法能观察到鞭毛？答：用电子显微镜直接观察。2、鞭毛与菌体脱离的原因是什么？答：选用的菌种可能为老龄菌种，鞭毛易脱落。在向载玻片上的液滴中沾菌的时候时动作幅度太大，使鞭毛脱落。鞭毛染色时，应该自然干燥的步骤直接煽风吹干或者加热干燥，使鞭毛脱落。3、鞭毛染色的菌种为什么要连续传种几代，并且要采用幼龄菌种？答：因为菌龄较老的细菌容易失落鞭毛4、鞭毛染色的注意事项有哪些？答：取菌后的接种环在蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。鞭毛染色的载玻片只能自然干燥，不能加热，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。5、视野中难以找到鞭毛的原因有哪些？答：a.片子中杂质多，杂质和菌体在视野中都是深色物质。 b.用显微镜观察时，需要不断调节微调，鞭毛很细，很容易因看不清而认为没有。6、在用B液进行染色时为什么稍稍加热一下效果会更好？ 答：稍稍加热，可以试管夹夹住载玻片，在用B液覆盖时，在酒精灯火焰上来回过三到四次即可，这样可以使染色剂固定。6、硝酸应染色法观察鞭毛形态实验中，载玻片上有一条菌带，一般在菌带的哪里更容易观察到鞭毛？答：对于载玻片上的菌带，液滴起始处一般菌量最大，但也因为菌太多而不易观察到细菌的鞭毛；随着液滴滑落的方向，菌带中的菌量应是逐渐减少，到菌带另一个尽头菌量最少，菌太少就易导致不容易在视野中观察到细菌，细菌太稀疏，所以一般是在菌带的中间较容易找到生有鞭毛的细菌。7、鞭毛染色观察实验中要求玻片很干净，洗净标准是什么 答：在洗净的玻片上滴上水滴后，水滴能均匀散开十、实验小结本次实验主要学习了鞭毛染色法和压滴法，观察了鞭毛的着生位置及数量，对鞭毛这一菌体的运动器官有了更好的理解。但是此次实验结果并不理想，没能在本组制作的玻片中观察到细菌上的鞭毛，在观察活细菌的运动时大部分细菌都不运动。不好的几处如下：1. 在涂片中，动作太大，取菌后的接种环在蒸馏水中用力太猛，鞭毛可能脱离菌体；2. 自己用硝酸银染色法制作好的载玻片在用油镜观察时，可以清楚看到视野中的枯草芽孢杆菌，但是观察了半天都没有鞭毛，一小组都没能有一张片子观察到鞭毛。3. 压滴法观察活菌运动实验中，自己的载玻片上滴的蒸馏水有点多，盖上盖玻片后直接观察，发现细菌基本上都是朝着同一个方向近似呈直线运动，也就是应为随水流动，非自身因鞭毛引起的运动。4. 压滴法中，自己的液滴中接种的菌量不是很多，