（环境科学专业论文）聚氰基丙烯酸正丁酯纳米药物载体的制备及性能研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t b e c a u s eo ft h eb a da d s o r p t i o n ，g r e a ts i d ee f f e c t ，a n dp o o rs o l u b i l i t yi nw a t e r , m a n yd r u g sc a n tb eu s e di nt h ec l i n i c s os t u d y i n ga n dd e v e l o p i n gn e wd r u gd e l i v e r y s y s t e mb e c o m e st h e f i r s tt a s ko ft h em e d i c i n er e s e a r c h e r b yr e a s o no fg o o d b i o d e g r a d a t i o na n db i o c o m p a t i b i l i t y ，p o l y ( a l k y l c y a n o a c r y l a t e ) h a sb e e nw i d e l yu s e d a sd r u gc a r r i e rs i n c et h e19 9 0 s i ti so n eo ft h em o s tp r o m i s i n gn a n od r u gc a r r i e r s ， w h i c hh a sb e e na p p l i e de a r l i e ra n d m a t u r e l y ，m a k i n gs o l v et h e s ep r o b l e m sp o s s i b l e i nt h i sp a p e r , u s i n gs i z ed i s t r i b u t i o na n ds h a p ea st h em a i ni n d e x ，w ef i r s t l y c o m p a r e dt h ee m u l s i o na n di n t e r f a c i a lp o l y m e r i z a t i o n t h r o u g ho p t i m i z a t i o nd e s i g n , w ep r e l i m i n a r i l ye s t a b l i s h e dt h ep r e p a r a t i o nm e t h o do fp b c a - n e w eu s e d o n e - s t e p m e t h o dt o e n t r a p p i n gp o d o p h y l l o t o x i nb y e m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o n b e c a u s eo ft h ea v a i l a b i l i t yo fp o d o p h y l l o t o x i ni nt h ep r e p a r a t i o n m e d i u mi sl o w , w h i c hr e s u l t e df r o mt h ep o o rs o l u b i l i t yo fp o d o p h y l l o t o x i n i nw a t e r , t h ed r u gl o a d i n gw a sn o ts a t i s f a c t o r y t h e nw eu s e d1 3 - c y c l o d e x t r i nt oi m p r o v et h es o l u b i l i t yo fp o d o p h y l l o t o x i n 1 1 l e p o d o p h y l l o t o x i n - 1 3 - c y c l o d e x t r i ni n c l u s i o nw a sp r e p a r e db yl y o p h i l i z a t i o na n d c h a r a c t e r i z e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r u m ，d s c ，x r da n df t i r n a n o p a r t i c l e sw e r e p r e p a r e db yp o l y m e r i z a t i o no fb u t y l c y a n o a c r y l a t ei na w a t e rs o l u t i o no ft h ec o m p l e x a n df a r t h e rc h a r a c t e r i z e db yt e ma n dp c s t h ec h a n g eo fd r u gl o a d i n gw a s i n v e s t i g a t e d t 1 1 ea p p a r e n ts o l u b i l i t yo fp o d o p h y l l o t o x i nw a si n c r e a s e d17 一f o l da tp h 7 oi np r e s e n c eo f1 3 一c y c l o d e x t r i no w i n gt ot h ef o r m a t i o no fad r u g - c y c l o d e x t r i n c o m p l e x t h ed r u gl o a d i n gw a si n c r e a s e d4 - f o l dc o m p a r e dt on a n o p a r t i c l e sp r e p a r e d i nt h ea b s e n c eo fc y c l o d e x t r i n s ，m a k i n gt h e s en a n o s p h e r e sap r o m i s i n gs y s t e mf o r a n t i - t u m o ra p p l i c a t i o n w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no ft y r o s i na n dt r y p t o p h a nw i t l l1 3 - c y c l o d e x t r i n t h r o u g hu l t r a v i o l e ts p e c t r u m t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e yc o u l df o r mi n c l u s i o n ，a n d t h ea p p a r e n ts t a b i l i t yc o n s t a n tw a s8 0 1 ( m o l 几) - i a n d3 3 2 9 7 5 ( m o l l ) 吐r e s p e c t i v e l y i t e s t a b l i s h e dt h ef o u n d a t i o no ff u r t h e ru n d e r s t a n d i n ga n ds t u d yo ft h es u p e r m o l e c u l a r i n t e r a c t i o nb e t w e e nc y c l o d e x t r i na n dp e p t i d e s i no r d e rt od i s c u s st h eo r a l a d m i n i s t r a t i o ns y s t e mo fp e p t i d e sa n dp r o t e i n ，w e u s e dt r y p t o p h a na sam o d e ld r u g 1 1 1 ee n t r a p p i n ge f f i c i e n c ya n dd r u gl o a d i n gw e r e u s e da st h em a i ni n d e xt os t u d yt h ee f f e c to fd r u g l o a d i n gm e t h o d ，p hv a l u e ，a n d c o n c e n t r a t i o no ft r y p t o p h a n a sar e s u l t ，t h ed r u gl o a d i n ga n de n t r a p p i n ge f f i c i e n c y v a b s t r a c t b yo n e s t e pm e t h o dw a sh i g h e rt h a nb yt w o s t e pm e t h o d m o r e o v e rt h ee n t r a p p i n g e f f i c i e n c yw a sf i r s ti n c r e a s e d ，a n dt h e nd e c r e a s e d ，a l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo fr e g i o n a l c o n c e n t r a t i o no f t r y p t o p h a n t h eh i g h e s tw a s2 3 3 w h e nct r yw a s1 5 m g m 1 k e yw o r d s ：p o l y ( b u t y l c y a n o a c r y l a t e ) ，n a n o p a r t i c l e ，i $ - c y c l o d e x t r i n ，p o d o p h y l l o t o x i n ， i n c l u s i o n ，t r y p t o p h a n 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济人学关于收集、保存、使j j 学位论文的规定，同意如下各项内容：按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版， 并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文：学校有权提供目录检索以及提供本 学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文 的复印什和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容 用于学术活动。 学位论文作者签名： 翟零 妒占年l 玛，；b 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在o 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名 i t “ 学位论文作者签名 骖 矽稆年，月f g 日 a ) 闪g 年，月哆日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：盈琴 口妊1 只， 日 第章绪论 1 1 纳米载药系统 第一章绪论 近年来，人们发现，一些原本在体外实验中筛选出的很有希望的药物，大部 分在i 期临床试验，甚至是临床前的研究中被淘汰。这些药物被弃用的主要原因 有【l 】：( 1 ) 吸收差、代谢或清除迅速而导致难以达到有效血液浓度( 如肽类、蛋白 等) ；( 2 ) 副作用较大的药物在非作用组织中广泛分布；( 3 ) 药物水溶性差而无法用 于静脉给药；( 4 ) 药物在血浆中的浓度范围波动较大。因此研究和开发新型药物 传递系统在药物研发和应用过程中日益重要。近年来迅速发展的纳米药物载体具 有缓释、控释、靶向性、提高生物利用度、降低毒副作用等优点，为解决这类问 题提供了可能。它包括纳米球( n a n o p h e r e s ) 和纳米囊( n a n o c a p s u l e s ) ，结构如 图1 1 所示。活性分子( 药物、生物活性材料等) 通过溶解、包裹作用位于粒子内部， 或者通过吸附、附着作用位于粒子表面f 2 1 。 n e n o e p h e r e e 奄毋籀? 鬻轳 e 瞄驾c dn 鹰帅翻p s u 船舶s 撕o r b g e d o 图1 1 载药纳米粒的类型 f i g 1 1v a r i o u st y p e so fd r u g1 0 a d e dn a n o p a r t i c l e 研究表明，纳米药物载体具有如下突出优点： 由于尺寸足够小，粒径通常是2 0 0 n m 以下的粒子，能穿过体内生物屏障达 到病灶部位，具有组织靶向性。 能进入血液循环系统，特别是当表面经适当修饰后，能在血液中长循环 3 1 。 这对在血液中半衰期短的药物意义重大，可保护这类药物免遭生理环境破坏，使 药物在体内缓慢释放。 纳米粒表面连接上配基、抗体、酶等生物活性物质，则可达到受体、抗原、 酶底物等所在靶向位置，使定向专一给药( 主动靶向) 成为可能。 广泛的给药方式是其他任何剂型都无法比拟的。纳米载药微球可经口服、 注射( 静脉注射、肌内注射、皮下注射) 、透皮等方式进入人体血液循环系统。 目前药学中用作纳米药物载体的材料主要包括高分子聚合物、脂质体和天然 第一章绪论 高分子。相比于后两者，高分子聚合物有一定的优势：它克服了脂质体在体内稳 定性差的缺点，比天然生物高分子具有更好的生物相容性和较低的免疫原性，并 且容易通过化学或物理修饰控制其性剧4 1 。而将其中的可生物降解高分子聚合物 应用于药物缓释体系是现代药剂科学、生物科学、高分子科学相互渗透而产生的 重要边缘学科。近几十年来，这一领域的研究一直非常热门。由于具有能被人体 重新吸收的功能，与不可降解的高分子聚合物相比，它们具有以下三个优点【5 1 ： 控释速率对药物性质的依赖性较小。控释速率主要由载体的降解速率控 制，从而使得对药物包埋量和几何形状等参数的选择范围更广。 释放速率更为稳定。在扩散控释体系中，释放速率一般都会随时间而递减。 如果使用可降解材料作载体，随着材料的降解，药物的渗透率加快，可抵消扩散 速率的降低。在理想的情况下，释放速率可维持恒定。 更适于不稳定药物的释放要求。在不可降解释放体系中，药物的释放是通 过：由水扩散至载体内部一药物溶解_ 溶剂扩散这一过程来实现的。而在可降解 体系中，由于载体的可降解性，药物释放无须通过这一较长的通路来实现，使得 药物微粒在溶剂中逗留的时间较短。一些不稳定药物如多肽和蛋白质药物不致出 现分解或集聚的现象。 1 2 聚氰基丙烯酸烷酯载药系统研究进展 氰基丙烯酸烷酯( a l k y l c y a n o a c r y l a t e ，a c a ) 是1 9 5 5 年美i 垂i e a s t m a n 公司合成 的一类粘结剂，其结构简式为： h 2 c - - - c - - - c o o r i c n 聚氰基丙烯酸烷酯( p a c a ) 早在7 0 年代就已经是临床上用作组织粘结剂的 一种医用生物材料，具有良好的生物降解性和生物相容性，9 0 年代广泛用作药 物载体，是应用较早、较成熟且具有广阔前景的纳米载药材料之一( 6 1 。目前主要 用于运载抗肿瘤药物( 如多柔比星、紫杉醇) 【7 ，8 j 、核苷酸1 9 1 、多肽和蛋白类药物 ( 如胰岛素) 1 0 l 。根据制备工艺的不同，a c a 可形成纳米球和纳米囊f 1 1 1 。常用 的单体有氰基丙烯酸甲酯( m c a ) 、氰基丙烯酸乙酯( e c a ) 、氰基丙烯酸丁酯 ( b c a ) 、氰基丙烯酸异丁酯( i b c a ) 、氰基丙烯酸己酯( h c a ) 、氰基丙烯酸异己酯 f i h c a ) 等。 2 第一章绪论 1 2 1 聚氰基丙烯酸酯纳米粒( p a c a n p ) 的制备方法与比较 目前制备p a c a - n p 的方法主要有以下三种，分别可以得到纳米球和纳米囊。 1 2 1 1 乳液聚合法 将单体分散到含有表面活性剂或稳定剂的酸性水溶液中，持续搅拌3 4 h f l 2 l ， 可得均一骨架结构的纳米球，粒径在5 0 3 0 0 n m ”j 。本法适用于在酸性介质中溶 解度较大的药物。常用表面活性剂有葡聚糖、乙二醇与丙二醇的嵌段共聚物和聚 山梨酯等。影响p a c a 分子量和纳米球粒径大小的主要因素有：聚合反应介质的 p h 值、表面活性剂种类与用量等。何勤等【1 4 】研究表明当反应介质p h 小于0 5 时， 几乎无法制成p b c a 纳米球；p h 大于5 5 时，也不能成球。因此介质p h 通常控 制在1 3 5 【1 5 i 。m i t r a 等【8 1 分别用葡聚糖7 0 、聚乙烯醇、胆固醇、卵磷脂为表面活 性剂，制备紫杉醇p b c a 纳米球，结果表明加入表面活性剂后，纳米球的粒径 减小，表面电位和紫杉醇包封率得到提高，且不同的表面活性剂影响程度不同， 天然的卵磷脂和胆固醇能更好地改善纳米粒的物化性质。 1 2 1 2 界面聚合法 将油、单体、药物溶于有机溶剂中，在搅拌下缓慢加至含表面活性剂的水相 中，反应结束后蒸除溶剂，得纳米囊【l6 1 。油的选用标准是无毒、在p a c a 中溶解 度低、不易降解p a c a 、药物在其中的溶解度大【1 7 l 。常用植物油、矿物油、纯化 合物如油酸乙酯、苯甲酸苄酯等。影响纳米囊粒径和包封率的因素利1 8 j ：搅拌速 度、单体用量、p h 、溶剂和油相等。采用亲核性较低的溶剂如丙酮、乙腈，制 得的产物均为纳米囊。当油相、水相及单体密度相近时，油核位置在纳米囊的中 心，囊壁的厚度比较均匀。 1 2 1 3 界面沉积法 它是制备p a c a 纳米囊比较新的方法。将已制备的p a c a 聚合物、药物、油 溶于乙醇中，在搅拌下注入含有表面活性剂的水中【1 9 】。由于乙醇迅速穿透界面， 大大降低了界面张力，使油相自发形成纳米液滴，在水中不溶解的p a c a 逐渐向 界面迁移、沉积，最终形成纳米囊。与界面聚合法相比本法具有重复性好、药物 包裹量大、粒径均匀等优点。 总之，以上三种制备方法各具特点，其中乳液聚合法操作简便，条件容易控 制；而界面聚合法和界面沉积法可制得纳米囊，药物被包封在由聚合物膜包裹的 液体核中，从而可更好的避免药物的突释效应、与给药部位组织的直接接触、减 少贮存和给药后药物的降解，提高生物利用度。 3 第一章绪论 1 2 2p a c a n p 的纯化灭菌 由于纳米粒悬浮液中可能残留有机溶剂、表面活性剂、残余单体和聚合物团 聚体。因此p a c a 纳米粒作为药物载体使用之前，须严格纯化灭菌。 1 2 2 1 纯化 微米级的聚合物团聚体可用烧结玻璃滤器过滤去除。纳米粒纯化的常用方法 有超滤、透析、凝胶过滤、减压蒸发和超速离心等。l i m a y e m 等【2 0 】用横向流动微 滤法( c r o s s f l o wm i c r o f i l t r a t i o n ) ，首先将制得的纳米溶液在常温下通过减压浓缩 至原体积的1 5 ，然后再通过恒滤达到纯化。与前几种方法相比，它的优点在于 可用于大规模的工业纯化，同时不会改变纳米粒的粒径和载药量。 1 2 2 2 灭菌 主要通过高压、辐射和化学法灭菌。前两种灭菌方式可能导致p a c a 纳米载 体和药物物化性质的不稳定，而化学灭菌须使用甲醛、环氧乙烷等有害物质。 s o m m e r f e l d 等【2 l 研究了高压灭菌对空白p b c a 纳米粒粒径的影响，表明高压灭 菌后，纳米粒粒径明显增大，作者认为在无菌环境制备p b c a 纳米粒是保证制 剂无菌的最佳方式。 1 2 3p a c a 纳米粒的载药方式和影响因素 1 2 3 。1 载药方式 p a c a 纳米粒的载药方式主要有两种：1 ) 同时加入药物与a c a 单体，使药 物在聚合反应过程中包埋在p a c a 纳米粒内部。2 ) 通过吸附的方式将溶液中的 药物吸附到已形成的p a c a 纳米粒表面和内部。a b o u b a k a r 2 2 j 和k u o t 2 3 】分别利用 这两种方法制备了胰岛素p i b c a 和司他呋啶p b c a 纳米粒，前者所得纳米粒的 包封率和载药量更高。 1 2 3 2 影响载药量和包封率的因素 ( 1 ) 单体和药物的性质 p a c a 的烷基侧链越长，疏水性越强，吸附脂溶性药物的量就越多。文献【”】 中用吸附等温线研究了p m c a 纳米粒对两种抗肿瘤药物放线菌素d 和甲氨蝶呤 表面吸附量，结果表明，p m c a 纳米粒对甲氨蝶呤的载药量低于对放线菌素d ， 说明药物性质对载药量也有影响。 ( 2 ) 单体和药物浓度 r a d w a n l 2 4 研究表明，增加单体的浓度可提高纳米粒的载药量。一般，随着 4 第一章绪论 药物浓度的提高，载药量也随之增加，包封率降低。当药物浓度过高时，部分药 物积聚于油水界面，会阻碍单体的聚合作用，导致纳米粒包裹率下降，载药量也 无法进一步提耐2 5 1 。 表面活性剂和稳定剂的种类也会影响纳米粒载药量和包封率【7 1 。 1 2 4p a c a 纳米粒的表面修饰 p a c a 纳米粒易被网状内皮系统( r e s ) 吞噬，在血液中的清除速度较快， 主要靶向于：肝、脾、骨髓等【2 6 1 。表面修饰不仅能增强p a c a 纳米粒的亲水性， 减少肝脏巨噬细胞吞噬，延长体内循环时间，增加对细胞膜的粘附能力等，还可 实现对非r e s 器官的主动靶向。 1 2 4 1 聚7 , - - 醇( p e g ) p e g 是应用最广泛的表面修饰材料，具有与水分子结合力极强、柔性大、毒 性和免疫原性极低等特性。常通过预先与a c a 单体共聚得到p a c a c o p e g 聚合 物，再制各纳米划2 7 】；或直接将p e g 溶于酸性水溶液中用乳液聚合法制备【2 8 1 。修 饰后的纳米粒抗蛋白吸附能力不仅与p e g 链的密度和长度有关，同时也与溶液中 聚合物的构型和构象有关。纳米粒表面p e g 的密度越大，抗蛋白吸附能力越强； 另外，p e g p a c a 纳米粒与m e p e g p a c a 纳米粒相比，抗蛋白吸附能力更强， 前者在纳米粒的表面形成了一层云状物质，能有效阻止蛋白的靠近1 2 3 】。f o n t a n a 等1 2 9 】分别用分子量为6 0 0 、2 0 0 0 、4 0 0 0 的p e g 为表面修饰剂制备p e c a 纳米粒，结 果表明随p e g 分子量的增大，纳米粒的粒径减小、表面荷电量降低、静脉注射后 避开单核吞噬细胞吞噬的能力增强。 1 2 4 2 表面活性剂 许多药物，如亮啡肽类药d a l a r g i n 、洛哌丁胺、筒箭毒碱等不能穿透血脑屏 障，进入中枢，从而不能发挥应有的疗效。聚山梨酯等表面活性剂可增加药物对 血脑屏障的渗透。r a m g e 等1 3 0 1 将上述这些药物包封在经吐温8 0 表面修饰过的 p b c a 纳米粒中，用人和牛的脑微血管内皮细胞作为体外试验模型、r h o d a m i n e 6 g 作标记，通过荧光显微术分析发现大脑内皮细胞对修饰后纳米粒的摄取速度比未 经修饰过的更迅速，且摄入量高2 0 倍。 1 2 4 3 多糖类 多糖化合物除可延长纳米粒体内循环时间和减少巨噬细胞捕获外，特别是环 糊精还可增加药物包封率和载药量f 3 i l 。壳聚糖与器官、组织、细胞具有良好的生 物相容性，结构中含有活泼的氨基，易引入功能基剧3 2 1 。y a n g 等【3 3 1 以壳聚糖作 5 第章绪论 表面修饰剂，通过乳液聚合法制备了表面带正电荷的p b c a 纳米粒，能吸附到表 面带负电荷的肿瘤细胞表面，达到药物靶向目的。 1 2 5p a c a - n p 的电化学特性 电位是评价纳米给药系统性能的项重要参数。表面电位越高，则纳米粒的 聚集趋势就越小，纳米粒胶体溶液越稳定。般当纳米粒表面电位绝对值大于 3 0 m v 时，纳米粒悬浮液就很稳定【1 7 】。另外，当离子型药物与纳米粒性质相反荷 电时，纳米粒的表面电位越高，则载药量越高。因此提高纳米粒的表面电位是有 益的。 张强等【3 4 】用u 型管电泳法研究了p b c a 纳米粒的电化学特性，结果表明，纳 米粒表面荷负电；表面电位与稳定剂浓度和p h 呈正相关；和b c a 的加入量呈负 相关：稳定剂和表面活性剂种类对表面电位有影响；离子强度的影响呈非线性关 系；实验条件下电解质的影响不明显。因此，若要提高p a c a 纳米粒的表面电位， 在制备时，宜使p h 值近中性，控制较低的单体浓度和适当的药物浓度。 1 2 6p a c a - n p 的降解与毒性研究 关于氰基丙烯酸烷基酯聚合物的降解，一般认为有两条途径，其一是生成甲 醛；其二是酯酶作用下降解为烷基醇。l e n a e r t s 掣3 5 】通过测定降解过程中甲醛及 异丁醇的量，研究了聚氰基丙烯酸异丁酯毫微粒( p i b c a - n p ) 的降解，在p h = 7 o 及p h = 1 2 0 的介质中，2 4 h 1 勾生成的甲醛分别只有理论量的5 和7 ( 假设只按甲 醛途径降解) ，而在碱性条件下，生成异丁醇的量为理论量的8 5 。这一研究证 明了两种降解途径的存在，以及在碱性条件下，酯的水解是主要降解途径。s c h e r e r 等【3 6 j 研究了酶对聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒( p b c a - n p ) 降解的影响，在无酶存在 的缓冲液中p b c a - n p 可降解，加入酯酶后，速率加快，而加入淀粉酶、胃蛋白 酶等则无明显作用。m u l l e r 等t 3 7 1 的研究表i 韭 p a c a 的降解速率随烷基碳原子数的 增加而降低，p m c a - n p p e c a - n p p i b c a - n p p i h c a - n p 。 关于p a c a - n p 的毒性，k a n t e 等嘲做了较为全面和深入的研究，慢性毒性实 验结果表旺 p b c a n p 及其代谢物对鼠伤寒杆菌的诱变性试验无致突变作用，对 肝细胞无任何损伤，p m c a n p 可使肝细胞膜有一定程度改变。急性毒性实验发 现只有在 1 0 0 p , g m l 的较高浓度时才可观察到p a c a - n p 肝细胞毒性。同在1 0 0 1 t g 砌的浓度，p b c a 。n p 对k u p f r e r 细胞无毒性作用。构效关系方面研究发现， p a c a - n p 的细胞毒性与其烷基侧链的长度呈负相关。g i p p s 等f 3 9 】观察了反复注 射p a c a - n p 的裸鼠的肝、脾、肺，发现没有明显的组织学改变。 6 第一章绪论 1 3 本研究的目的及整体构想 p b c a 是p a c a 材料中的一种，烷基链较长，具有适宜的降解周期，且毒性 较低，因而引起广泛的兴趣。国内外学者制备了装载有抗癌药、基因药物、蛋白 大分子类药物、抗生素等各类药物的p b c a - n p ，均证明其有良好靶向性、保持 药物活性、提高透膜能力，提高生物利用度等特点。我们首次采用p b c a 为载体 材料，以鬼臼毒素为模型药物通过乳液聚合法制备鬼臼毒素p b c a - n p ，以期达 到降低鬼臼毒性，提高生物利用度的目的。 选用的模型药物一鬼臼毒素是具有显著细胞毒性的天然活性物质，分子结构 如下所示： n h 分子量为4 1 4 4 1 ，微溶于水，溶于乙醇，氯仿，丙酮，热苯和冰醋酸；具有很好 的抗肿瘤活性，但其毒副作用较大，故不能广泛应用于临床。 本论文中我们首先初步确立了p b c a - n p 载鬼臼毒素的制各工艺，在此基础 上，对如何提高载药量作了较为深入的研究与探讨，而国内外尚无此类报道。 用于预防和治疗疾病的蛋白质和多肽药物，具有疗效好、副作用低等突出的 优点。但它们也有易引起机体的免疫反应，体内半衰期短，口服过程中会被胃肠 道中的蛋白分解酶分解破坏，易于失活、变性，不易储藏等缺点。所以在本论文 中我们以色氨酸为药物模型，从制备工艺、色氨酸浓度等因素探讨了多肽、蛋白 质类药物的口服给药系统，为以后进一步的研究打下一定的基础。 综上所述，我们确立了“聚氰基丙烯酸丁酯纳米载药体系的制备及性能研究 这一课题。 本课题得到了国家自然科学基金( 5 0 5 7 2 0 7 4 ) 的资助。 7 第二章鬼臼毒素p b c a - n p 的制备工艺研究 2 1 引言 第二章鬼臼毒素p b c a n p 的制备工艺研究 小蘖科植物鬼臼自古以来就是有名的药用植物，在我国古代医书中早有记载 和应用，主要应用于治疗蛇咬伤、痈疖肿痛、跌打风湿筋骨痛及气管炎。美洲鬼 臼( p o d o p h y i l i o np e l t a t u m ) 的根和根茎很早就用作缓泻、催吐、利胆和驱虫剂1 4 0 1 。 鬼臼脂素及其树脂在民间疗法中用于治疗癌症已有1 0 0 0 多年的历史了。从美洲鬼 臼、桃儿七等植物中提取的木脂类化合物鬼臼毒素( p o d o p h y l l o t o x i n ) 发现它能治 疗淋巴结核、梅毒、淋病、尖锐湿疵【4 1 j 等疾病。经过一系列的医学、生物学和化 学的研究证明了鬼臼毒素的抗癌活性，但其毒副作用较大，不适于直接在临床上 应用i 柏4 2 1 。自2 0 世纪5 0 年代初开始，国外很多研究机构就开始对鬼臼毒素进行了很 多结构改造工作，以期得到毒副作用小，但能保留鬼臼毒素的抗肿瘤活性的化合 物 4 3 , 4 4 1 。其中的糖苷衍生物鬼臼乙叉甙( e t o p o s i d e ，v p1 6 ，又名依托泊苷) 和鬼臼 噻吩甙( t e n i p o s i d e ，v m2 6 ，又名特尼泊苷) 的临床效果优越，是治疗淋巴癌、胰腺 癌、乳腺癌、白血病等的重要药物。体外实验还证明v p1 6 能增强抗癌药物对黑 色素瘤的疗效。目前，这两种药物已被美国f d a 批准上市，并具有较大市场潜 力。但它们仍存在以下不足：水溶性差，抗瘤谱窄，经代谢易失活，易形成耐药 性和较严重的骨髓抑制等毒性作用，从而限制了其广泛应用于临床。因此，进一 步对鬼臼毒素母体进行结构改造和药理筛选，或找寻新的鬼臼毒素给药剂型，以 期得到高效低毒的抗癌药物已成为生物医学领域研究的重要课题。 载药p b c a - n p 的制备通常有两种方法，即乳化聚合法和界面聚合法。本章 工作对两者进行了比较，确立了用乳液聚合法制备载鬼臼毒素p b c a - n p 体系， 并通过单因素考察，对其进行了优化设计。 2 2 仪器和试剂 2 2 1 仪器 s - 2 1 2 恒速搅拌器( 上海申胜生物技术有限公司) 紫外可见分光光度计( v a r i a nc a r y 5 0 ) 激光粒度分析仪( b e c k m a nc o u l t e rl s 2 3 0 ) g 第二章鬼臼毒素p b c a n p 的制备工艺研究 透射电子显微镜( j e o l1 2 3 0 ) r e2 0 0 0 b 型旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) p h 计( m e t t l e rt o l e d od e l t a 3 2 0 ) 电子天平( m e t t l e rt o l e d oa l 2 0 4 ) 冷冻干燥机( l a b c o n e o ) 冷冻离心机( e p p e n d o r f ) m i l l i p o r e 纯水系统 2 2 2 试剂 b c a ( 北京瞬康医用胶有限公司) p o l o x a m e r1 8 8 ( 上海昌为医药辅料技术有限公司) p e ( 3 3 0 0 0 ( s i g m a ) 海藻糖( 上海昌为医药辅料技术有限公司) 葡萄糖( 中国医药集团上海化学试剂公司) 鬼臼毒素( 中国科技大学结构中心提供) 其他试剂均为分析纯； 2 3 实验方法和步骤 2 3 1 鬼臼毒素的溶解能力测定 2 3 1 1 鬼臼毒素水溶液标准曲线制备 精密称取鬼臼毒素2 0m g ，用无水乙醇溶解并定容至1 0m l ，精密吸取该溶液 1l i l l ，用m i l l i p o r e 超纯水稀释并定容至1 0 m l ，配成0 2 m e d m l 鬼臼毒素储备液。 精密吸取上述储备液0 2 ，0 3 ，0 4 ，0 5 ，0 6 m l ，用p h = 2 0 的h c l 溶液稀释并 定容至1 0m l ，配成浓度为4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ，1 2 0 9 9 m l 标准溶液，平行配f f i j 3 份。标准溶液在2 9 0 n m 波长下测定u v 吸收值，以平均吸收值a 对相应鬼臼毒素浓 度c 线性回归，制备标准曲线。 2 3 1 2 鬼臼毒素饱和溶液配制和浓度测定 称取过量鬼臼毒素两份，分别用l om lp h i - 2 0 的h c l 溶解，室温下超声助溶 1 h ，过滤，取续滤液l m l 稀释到1 0 m l ，在2 9 0i l n l 波长下测定u v 吸收值，代入标准 曲线计算浓度，考察鬼臼毒素在p h = 2 0 的酸性水溶液中的溶解能力。 第二章鬼臼毒素p b c a - n p 的制备工艺研究 2 3 2p b c a n p 的制备 2 3 2 1 空白p b c a n p 的制备 a 乳液聚合法 将2 ( w v ) p o l o x a m e r1 8 8 溶解在p h2 0 的h c l 溶液中，在7 5 0 r p m 磁力搅拌 下缓缓向上述溶液中滴 j n b c a ，搅拌3 5 h 后用0 i m 的n a o h 调节p h 至7 。0 ( 士0 5 ) ， 6 0 0 0 r p m 离一i l , 1 0 m i n ，取上层液体，即得空白p b c a n p - 孚l 液。 b 界面聚合法 制备参考文献f 4 5 1 中的方法，即将0 4m l 三油酸甘油酯以及0 1 m l 的单体b c a 溶 解于2 0m l 丙酮中，构成有机相；水相由4 0m l 蒸馏水和0 5 ( w v ) 非离子性表面 活性剂吐温2 0 和1 p o l o x a m e r l 8 8 组成，并用h c l 调节p n 为5 4 ( 4 - 0 1 ) 。室温磁力 搅拌下，将有机相缓慢滴加入水相中，4 5 i i l i n 内滴加完，搅拌速度为1 0 0 0 r p m ， 滴加完毕后继续搅拌3 h 。旋转蒸发至原体积的1 3 。 2 3 2 2 鬼臼毒素p b c a n p 的制备 将过量鬼臼毒素溶于p h = 2 0 的h c i 水溶液中，超声1 h 助溶，过滤得饱和 溶液。将2 ( w v ) p o l o x a m e r l 8 8 溶于其中，在7 5 0 r p m 搅拌下缓缓向上述溶液 中滴加b c a 单体，搅拌3 5 h 后用n a o h 调节p h 至7 0 ( 士0 5 ) ，6 0 0 0 r p m 离心 l o m i n ，取上层液体，即得载药p b c a o n p 乳液。 2 3 3 纳米粒形态观察和粒径测定 2 3 3 1 电镜法分析 取适量p b c a n p 溶液滴至铺有碳膜的铜网上，静置5 m i n ，用滤纸吸干悬液， 再滴 j 1 1 2 ( w v ) 磷钨酸钠负染1 0 r a i n ，于透射电子显微镜( 加速电压为1 0 0 k v ) 下观察纳米粒的形态。 2 3 3 2 激光粒度分析 取所制备的p b c a 纳米乳液适量，用水稀释后在激光粒度分析仪上进行粒 径分析，记录测定结果，并以粒径跨距( s p a n ) 值评价粒径分布，s p a n = ( d 9 0 一d , o ) d s o ， ( d n 表示有毗微粒的粒径小于该值所显示的粒径的大小) 。 2 3 。4 载药纳米粒包封率和载药量测定 取一定量制备的载鬼臼毒素纳米溶液，4 c ，1 4 0 0 0 r p m 超速离，d 2h ，将上清 l o 第二章鬼臼毒素p b c a - n p 的制备工艺研究 液完全取出，沉淀用m i l l i p o r e 纯水清洗两次，将所得到的沉淀用同体积的t h f 溶 解后，空白纳米粒t h f 溶液作空白，稀释一定的倍数后用紫外可见分光光度计 按标准曲线，测定相应的浓度。 载药量按以下公式计算： 载药量= 沉淀中药物含量( p g ) 纳米乳液体积( m 1 )( 2 1 ) 包封率= 沉淀中药物的含量( 肛g ) 力入的药物总量( h g )( 2 2 ) 2 3 5 冷冻干燥条件对纳米粒形态和粒径的影响 2 3 5 1 保护剂的选择 为保证冻干粉末中固形物能保持原体积，不塌陷，不皱缩，再分散性良好， 需要加入适当的保护剂。以冻干针剂的外观、色泽、和再分散性为指标，分别以 葡萄糖和海藻糖为保护剂。 2 3 5 2 实验方法 将制备得到的纳米乳液分成三组，第一组作为空白对照，二、三两组分别加 入1 0 的海藻糖和1 0 的葡萄糖作为冻干保护剂。将准备好的样品用液氮预冻之 后，再进行冷冻干燥。 2 3 5 3 评价指标 外观：以可维持原体积，不塌陷，不皱缩，表面光洁，可整块脱落但不散碎 为佳。 j 色泽：以色泽均匀，无花斑，质地细腻者为佳。 再分散性：取各组冻干品适量，加入纯水2 m l ，振摇后能很快分散得均匀的 乳白色胶体溶液者为佳。 2 4 结果与讨论 2 4 1 鬼臼毒素的溶解能力测定 由于制备载药n p 时，通常将鬼臼毒素与p o l o x a m e r1 8 8 或p e g 共同溶解在酸 性介质中，但经实验证明这两种表面活性剂对鬼臼毒素不存在明显的增溶或助溶 效应，因此在测定时未用h c i p o l o x a m e r l 8 8 或h c i p e g 3 0 0 0 溶液溶解鬼臼毒素， 而是直接采用鬼臼毒素的盐酸饱和溶液。鬼臼毒素溶液标准曲线如图2 1 所示。 第二章鬼臼毒素- p b c a - n p 的制备工艺研究 0 1 4 0 1 2 o 1 0 o 0 0 8 0 0 6 0 0 4 4681 01 2 t h ec o n c e n t r a t i o no fp o d o p h y l l o t o x i n ( p g m l l 图2 1 鬼臼毒素酸性水溶液紫外标准曲线 f i g 2 1t h es t a n d a r dc u r v eo fp o d o p h y q l o t o x i ni np h 2 0 回归方程：a = 0 0 1 0 2 5 c + 0 0 0 0 8 ( r 2 - - o 9 9 9 2 ) 线性范围：2 0 1 2 o ，t g m l 2 4 2 鬼臼毒素酸性饱和溶液浓度测定 利用标准曲线测得两份鬼臼毒素h c i 饱和溶液的浓度分别为：c 1 = 7 8 p g m l ， c 2 = 7 7 p g m l 。 结论：根据平均值和稀释倍数算得鬼臼毒素在1m lp h = 2 0h c l 溶液中超声 15m i n 可溶解7 7 5 p g 。 2 4 3p b c a n p 制备方法 2 4 3 1 制备方法的筛选 图2 2 分别为乳液聚合法( a ) 和界面聚合法( b ) 制备的p b c a - n p 透射电镜图， 从中可以看出，乳液聚合法制得的p b c a - n p 分散比较均一，外形多为圆球；而 界面聚合法制得的粒子大小不均，粒径较前者大，形貌也不是很规整，其中既有 纳米球也有纳米囊。 从外观观察，乳液聚合法制备的p b c a - n p 是泛有蓝色乳光的胶体溶液，放 置三个月后仍然澄清透明：而界面聚合法制得的p b c a n p 呈乳白色，放置数天， 发现底部有沉积物；说明通过乳液聚合法制备的p b c a - n p 能够长期稳定保存， 为实现工业化提供了基础。 1 2 第二章嵬臼毒素- p b c a n p 的制备丁二艺研究 f i g22 t e m p h o t o so f p b c a - n p ( a ) e m u l s i o np o l y m e r i z a t i o n , m a g n i f i e db y5 0 k 这主要是因为b c a 单体的聚合属于阴离子聚合，其反应机理如图2 3 所示 0 h - 姜一一。一f 一。一：一i 。， “，”i i e 占一r 蛊，2 一乞” n ( 1 )pf n 百器“2 一l ：”l f i g23 m e c h a n i s mo f p o l y m e r i z a t i o no f b c a m o n o r n e r 该反应属于阴离子聚合单体在亲核试剂作用下发生链引发、链增长。在用 界面聚合法制各p b c a - n p 时，发现将b c a 单体加到乙醇中，立刻出现白色浑