肠源性内毒素血症及其治疗进展.doc

肠源性内毒素血症及其治疗进展杜秉权 天津公安医院 300222重症急腹症可导致全身炎症反应综合征（systemic inflammatory reaction syndrome,SIRS）甚至多器官功能不全综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）的发生，而SIRS及MODS的形成多与体内大量内毒素的生成有关。故对内毒素血症的定义、发生、发展、治疗及预后的评估在疾病治疗中处于很重要的地位，必须加以重视。一内毒素血症循环血中出现可检出的内毒素，称之为内毒素血症。其中不伴有革兰氏阴性细菌(gram-negative bacteria, G-细菌)感染者，称为肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia, IETM）。在正常人的远端小肠和结肠有大量细菌和内毒素，厌氧菌为1010， G+ 和G-需氧菌以及兼性厌氧菌分别为105108。而内毒素恰恰存在于G-细菌菌体的细胞壁内，在细菌死后细胞壁崩解时释出，活菌亦可以发疱形式将内毒素释出。其化学成分为脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），由三层组成，其内层为类脂A，介导多数生物效应，几乎所有肠道细菌的类脂A结构都是相同的。二肠屏障与内毒素移位在正常人肠道内的细菌和内毒素是如何发挥其损伤作用的呢？1979年Berg首先提出“细菌移位”（bacterial translocation）的概念，并定义为“肠道内活的细菌通过肠粘膜侵入肠道以外的部位，如肠系膜淋巴结、肝、脾、血液以至全身的感染过程”1。1990年Alexander将其内容扩展为“微生物移位”（microbial translocation），即“肠道内活的或死的细菌及其产物，包括内毒素，通过解剖学完整的肠粘膜屏障侵入肠道以外部位的过程” 2。由正常肠道微生物区系的平衡作用、机械屏障、免疫防御以及肠肝轴这四种基本因素构成肠屏障3，是机体防御肠道细菌及内毒素等移位的关键机构。（1）肠道生物屏障：Waaij首先提出“定植抗性”的概念，描述正常肠道菌群的保护作用4。现知专性厌氧菌是定植抗性的主要成分，厌氧菌数目超过肠道G-和需氧G+细菌100010000倍，并与肠道上皮紧密联系，形成一道物理屏障，限制潜在致病菌与粘膜的直接接触，使用广谱抗生素可使厌氧菌屏障丧失，使潜在致病菌容易与肠上皮接触。正常肠道微生物区系通过细菌拮抗作用维持相互之间的稳定平衡，如接触抑制、抗微生物因子以及竞争连接部位与营养。（2）肠道机械屏障包括肠道粘液层、肠蠕动和肠道上皮。小肠的正常蠕动可防止细菌在临近肠粘膜部位的长时间滞留，减少细菌穿过粘膜层到达上皮的机会。（3）肠道免疫屏障指肠道相关淋巴样组织（gut-associated lymphoid tissue, GALT）,调节对肠内可溶性和颗粒性抗原的局部免疫反应。抗原诱导的B淋巴细胞产生分泌型IgA，通过与细菌结合并阻止其与上皮细胞连接而防止细菌侵入粘膜。肝脏网状内皮细胞能有效地清除血中内毒素，只有在肝脏网状内皮系统功能严重损伤时才出现全身性内毒素血症。门脉中少量肠源性内毒素对维持网状内皮系统吞噬活性有重要作用，以增强宿主对各种损伤的抵抗力；门脉中大量内毒素则增加肝脏对某些损伤的敏感性，肝功能障碍时则清除内毒素的能力受损，对内毒素的全身抵抗力降低。故肝脏网状内皮系统的正常功能是肠屏障的必要成分。（4）肠肝轴（即化学屏障）：排泄到肠内的抗内毒素的物质胆汁酸盐(胆盐)能与肠腔内的内毒素结合，形成难以吸收的去垢剂样复合物，而阻止内毒素从肠道吸收。肠屏障的完整是阻止细菌和内毒素移位的重要因素，但是应当了解，一定量的细菌移位是一种生理过程，对肠道和全身免疫力的形成与维持是重要的。肠道内细菌移位的第一步是移位的细菌粘附到上皮细胞表面或肠粘膜表面溃疡部位；其次，细菌通过粘膜屏障并以活菌进入粘膜固有层；第三，移位的细菌及其产物如内毒素侵入淋巴管或血流，弥漫全身。细菌易位途径主要有两条,低剂量时细菌易位以肠系膜淋巴结途径为主,高剂量时以门静脉途径为主5。三内毒素本身生物活性及介导的炎性反应内毒素本身的生物活性是：1. 发热反应：内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢，或作用于粒细胞或单核细胞使之释放内源性致热原引起发热；2. 激活血管活性物质，如缓激肽、组织胺、5-羟色胺等，导致血管舒缩功能紊乱，引起低血压和休克；3. 作用于单核巨噬细胞系统，使之释放大量细胞因子及其它炎症介质，导致肝脏与其它器官损伤；4. 损伤血管内皮，“封闭”单核巨噬细胞系统，抑制肝脏抗凝血酶III的合成，诱发弥漫性血管内凝血；5. 激活补体替代途径；6. 引起局部过敏反应；7. 导致糖代谢紊。系统研究表明，急腹症发病过程中，常见肠道细菌的内毒素移位，导致血中内毒素水平升高，使炎症细胞活化的细胞因子生成，甚至爆发“细胞因子/炎症介质风暴”，加以宿主防御作用及至防御衰竭。内毒素血症期界定如下：1）.具有相关疾病背景，如急腹症、大面积烧伤、大手术打击2）.全身性炎症反应尚未达到SIRS程度3）.循环内毒素水平增高。其中12为必备条件，内毒素血症期存在一定程度的全身性炎症反应，属SIRS的前期状态，氧自由基，NO以及内毒素是急腹症内毒素血症的部分炎性介质，应防止内毒素血症期向SIRS及MODS的发展6。细菌、内毒素移位后的生物作用及其产生的细胞因子及其它炎症介质：肠道是脓毒症和多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的原动力7，当前述肠屏障功能障碍时可发生细菌及内毒素移位。严重创伤、烧伤、危重患者、多器官衰竭(multiple organ failure, MOF)患者、威胁生命的菌血症、肠道细菌感染患者，常出现细菌移位，但无明确的感染灶。细菌移居量与损伤轻重有关。循环内毒素可正反馈的促进肠道内毒素移位8。一旦肠屏障衰竭，肝清除肠源性细菌和内毒素的能力就成为全身脓毒症和远处器官损伤是否发生的决定因素。移位的细菌和内毒素直接损害肝脏或加重已有的损伤，肠源性内毒素血症在肝纤维化发生发展中起重要作用（4），内毒素得以最终进入全身循环。体内的内毒素激活Kupffer细胞与其它吞噬细胞，释放细胞因子及其它炎症介质，导致远处器官损伤。就多器官功能衰竭和肠源性败血症状态的发生而言，肠道内毒素移位比细菌移位更具有临床意义。已经有实验证实，肠源性内毒素移位后，检测各脏器单位组织重量中内毒素含量，由高至低为肾、肺、肝、胰、肠系膜淋巴结、心脏，说明腹膜炎时易发生肾衰、呼衰与其单位组织中内毒素含量有关9。炎性介质中：生物喋呤参与了内毒素休克所致多脏器损害发病过程,早期拮抗内毒素可抑制组织生物喋呤的合成与释放10。可以观测到的IAI时血浆内毒素和TNF水平、IL-6在实验后开始升高,IL-1无显著变化11。IL-8升高在中性粒细胞的粘附、渗出及游走中起重要作用。IL-18与内毒素血症引起的肝损伤有关，但可以降低TNF-a水平12。IL-10对大鼠腹腔感染和早期脓毒症时的炎症有一定的抑制作用,提示它可能是有效的抗炎性物质之一13。四内毒素血症的现代医学治疗1 选择性肠道脱污染选择性肠道脱污染（selective decontamination of the digestive tract, SDD）是基于定植抗性原理设计的一种局部使用胃肠道不吸收的抗生素的给药方法，选择性抑制口咽及上消化道潜在致病微生物，而使厌氧菌群不受损伤。经过10余年的应用，目前对SDD治疗的观点不一： 有的认为 SDD能降低致病菌定植和呼吸道感染，但对死亡率、医疗费用、住ICU时间以及使用呼吸机时间等有益影响尚不肯定，甚至认为SDD不能生存率。但目前也有报道认为：SDD通过减轻肠道菌群紊乱状态,减少细菌移位,有利于预防ANP继发感染14。2 特异性抗内毒素制剂新的抗内毒素治疗包括中断内毒素合成，结合或中和其活性，防止其与宿主效应细胞相互作用，干扰内毒素介导的信号传导通路等。治疗制剂包括内毒素类似物、抗体、亚单位疫苗、多粘菌素结合柱、重组人蛋白、内毒素合成和细胞内信号传导的小分子抑制剂。(1) 抑制类脂A生物合成噬菌体产生一小段核苷酸序列，起着反义RNA作用，阻断合成LPS的细菌合成酶10。按此原理设计的抗G-细菌的药物，其作用与青霉素相似。抑制脱乙酰化酶制剂之一的L-573655，竞争性地抑制80%90%的LPS合成，4h内快速杀灭大肠杆菌(E. coli)。另一种同类制剂L-161240在E. coli攻击后立即和6小时可保护小鼠免于致死性腹内E. coli感染。3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酯胞苷转移酶（CMP-KDO合成酶，可激活KDO掺入到LPS）抑制剂15，使类脂A前体聚积，最终杀灭细菌。以该抑制剂预处理可杀死血清中的95%以上的E. coli，增强补体介导的溶菌作用，增加抗菌药物的敏感性10倍，并可降低抗菌药的用量。目前临床进行了人抗内毒素类脂A轻、重链可变区基因的克隆研究，抗体DNA在噬菌体中的重组获得了成功,为下一步的筛选、表达打下了基础16。Clone45为IgM类抗多粘菌素B(PMB)单克隆抗体。Clone 45具有模拟类脂A的表面抗原结构,可作为类脂A的替身和LPS的受体拮抗剂,阻断内毒素诱生炎症介质的致病环节,起到抗内毒素休克的作用17。(2) 抗内毒素抗体和疫苗制剂分离与各种G-致病菌有高度亲和力的抗体，制成一种嵌合的IgG1单克隆抗体SDZ219-800，对人内毒素血症有治疗作用12。可望进入扩大的期临床。抗内毒素核心糖脂单克隆抗体（抗R595单克隆抗体） 具有防治腹腔感染伴MOD时代谢紊乱的代谢调理作用18。同样，抗内毒素核心糖脂抗体(抗J5血清)能够明显改善腹腔感染伴MODS的代谢紊乱,对高分解代谢具有显著的调理作用19。主动免疫：脱毒LPS疫苗（针对LPS的核心糖脂），采用E. coli J5 galE变异株的脱乙酰化LPS与B型脑膜炎球菌的一种外膜蛋白结合。在实验动物中显示高度的免疫原性和良好的耐受性20。产生的多克隆抗体可结合到一些G-杆菌的LPS核心区，保护动物免于致死量内毒素攻击和G-细菌的侵袭性感染。（3）杀菌/通透性增加蛋白杀菌/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein ,BPI）是人的一种内源性蛋白，主要存在于嗜中性白细胞的初级颗粒中。其V形结构的分子氨基端与羧基端呈平面对称，许多氨基酸形成一疏水性的囊，容纳LPS的类脂A。BPI与内毒素呈高度亲和性地结合。并有效地清除循环中的内毒素。重组BPI蛋白和23Kda的氨基端部分对内毒素攻击的健康志愿者和G-细菌攻击的动物均有效。BPI能增加G-细菌外膜的通透性而具抗菌性质21。但重组BPI血清t1/2短(24min)，需要大剂量连续静脉注射给药。目前国内亦有报道BPI对腹腔感染脓毒症大鼠有明显的治疗作用,其机制与其拮抗内毒素活性有关21。BPI模拟肽对LPS所致小鼠死亡有明显的保护作用及预防作用,并有一定的量效关系及时效关系。所以，BPI模拟肽,不仅保留了BPI特异性和LPS的特性,而且对LPS攻击小鼠具有更强的保护作用22。(4) 重建高密度脂蛋白高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）有结合细菌内毒素的高度亲和力，HDL-LPS复合物相当稳定。通过LPS结合蛋白或可溶性CD14的短程穿梭输运到HDL。一旦LPS吸附到HDL微粒上就可以通过肝廓清机制被有效地从循环中清除，故HDL可作为内源性LPS清除系统。以血液供体重建的HDL作期临床实验，注射重组HDL能有效地阻断LPS促炎症细胞因子合成与限制其血液学毒性23。多粘菌素B结合柱（PMX-F）：多粘菌素B（polymyxin B， PMX）能中和内毒素，将PMX固定于不溶性纤维上形成PMX-F，用作直接血液灌注（direct haemoperfusion, DHP）的主要成分，既能防止PMX（有中性神经系统及肾毒性）进入全身循环又能结合内毒素。动物实验及期临床研究均有较好效果24。(5) LPS拮抗剂E-5531是根据荚膜红细菌（一种无毒的细菌）的类脂A结构而合成的一种内毒素拮抗剂，可抑制其它G-细菌诱导的细胞因子产生。E-5531在细胞表面受体水平上拮抗LPS的活性，其与细胞表面的亲和力大于大肠杆菌的类脂A，该抑制作用是类脂A特异性的诱导细胞激活。E-5531在体内、体外能有效而特异地拮抗LPS诱导的固定的和循环中的细胞释放介质25。E-5531与杀菌型的抗菌素合用可抵消后者所致细胞壁裂解后释出的内毒素，用于治疗G-细菌引起的脓毒症有效。(6) 抗CD14抗体CD14在单核巨噬细胞信号传导中有极为重要的作用。由于作为LPS在细胞膜上的结合位点的抗原决定基与可溶性CD14 是同一物质，故研制一种单克隆抗体阻断LPS结合到CD14并传递免疫效应细胞活化的信号26。抗CD14抗体用于脓毒性休克的治疗正在进行临床前评价。(7) LPS信号转导抑制剂酪氨酸激酶和丝裂原激活蛋白激酶与LPS细胞信号转导有关。抑制酪氨酸激酶可保护G-细菌性脓毒症时的腹膜炎犬27。TYR，一种酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制巨噬细胞中介的炎性产物来治疗LPS和G细胞引起的内毒素性休克28。（8）LF-33，一种乳铁传递蛋白起源的缩氨酸，可以中和体内的存在的内毒素，降低LPS浓度，是一种有发展前景的药物29。（9）抗内毒素单链抗体构建抗内毒素(LPS)单链抗体基因,并尝试其在E,coli中的表达。目前已经成功地构建了鼠抗LPS ScFv基因,并在E.coliJM109中表达了GST-ScFv融合蛋白30。3其它（1）胆盐（胆汁酸盐）（bile salt）,能直接结合内毒素，阻止其吸收，抑制G-细菌生长。口服胆盐能降低肠源性内毒素血症31。另外消胆胺、乳果糖、果胶、白陶土，山莨菪碱等也能降低肠源性内毒素血症32。（2）牛磺酸（taurine）,是动物体内含量最丰富的氨基酸。牛磺酸对肠上皮细胞具有膜稳定作用，对内毒素血症小鼠具有保护作用，能抑制内毒素血症大鼠肠道内毒素移位的增加，拮抗内皮素促进的肠道内毒素移位6。（3）甘氨酸，甘氨酸拮抗内毒素的机制可能是通过其带正电荷的NH+3与内毒素脂质A上的PO-4结合,干扰了内毒素的正常结构,从而达到拮抗内毒素生物活性的效果。目前有报道甘氨酸 与PMB联合应用，其机理为 (1)内毒素脂质A上磷酸基团及相连的氨基葡萄糖双糖结构在甘氨酸、PMB作用下发生了变化,从而失去了对鲎试剂中C因子的激活作用,并且甘氨酸、PMB联合应用比单独使用效果要好;(2)提示甘氨酸和BMP可能是分别作用在内毒素分子的不同结构部位。（4）Y-39041，可以通过同时抑制TNF-a和刺激IL-10产物增加来治疗内毒素血症33。（5）次黄（嘌呤核）苷，可以通过抑制转录后细胞炎性产生的机制来拮抗内毒素血症，由于它的低毒性可以广泛应用于炎性/缺血性疾病导致的内毒素血症34。（6）穿心莲：穿心莲在体外可通过直接破坏内毒素结构和抑制其所介导释放的大量炎性细胞因子活性起到拮抗内毒素的作用35。（7）四倍体菘蓝毛状根：发根农杆菌诱导四倍体植物产生的毛状根有可能成为传统中药材的一种代用品36。（8）厌氧灵、锦红片、黄芩甙、绞股蓝总皂苷、黄连解毒汤、热毒清、青蒿提取物、解毒固本冲剂等亦分别通过提高机体免疫力，逆转内毒素休克表现，改变血流动力学，减少内毒素血症的炎性产物，对内毒素的直接中和来发挥治疗内毒素血症的作用37。综上所述，现代医学抗内毒素制剂目前多数仍处于实验研究阶段，投入临床应用特别是国人能承受者尚有一定距离。由于肠道不断地产生大量内毒素，抗G-细菌抗生素引起细菌释放的内毒素，大量内毒素对机体的影响是复杂的，因此抗内毒素制剂临床疗效的可靠性和持久性有待进一步证实。五祖国传统医学对内毒素血症的治疗：大承气汤有直接灭活内毒素、抗肠道G-杆菌，防止肠道内毒素及细菌移位，促进肠道内毒素排出体外，增强血浆及胆汁灭活内毒素的能力，减轻肠、肝、肺、肾等的病理改变，降低细胞因子、内皮素-1水平及脂质过氧化作用等，从而保护肠屏障，减轻全身炎症反应，促进机体恢复。上述作用的一个突出特点是通里攻下、荡涤肠胃、使肠道细菌和内毒素等排出体外，减少内毒素吸收，降低循环内毒素诱发肠道内毒素等移位及由此而引起的继发反应，影响了MOF的原动力，这些是通里攻下法的最大优势及其获效的关键环节，为其它诸法所不及。其他方法还包括泻热汤，瘀通腑合剂，热解毒、活血化瘀中药复方，神农33号注射液，热毒清注射液，丹参注射液，中药大黄、乌梅煎液灌肠等。综上所述，以大承气汤及其制剂为代表的通里攻下法有保护肠屏障，促进内毒素及细菌等从大便中排出体外，防止肠道内毒素及细菌移位，减轻内毒素、细胞因子及其它炎症介质与胃肠肽类激素(如ET-1)所致损伤，对体内、体外实验以及多种病理模型与患者均有有效防治作用，是防治肠源性内毒素血症使用频率最高的治法和方剂，或加用清热解毒或活血化瘀中药。从肠源性内毒素血症的发病机制与实验及临床研究结果来看，通里攻下法是首选治法40，这也符合西药发挥杀菌作用与中药清热活血,消除细菌内毒素作用“菌毒并治39”的中西医结合理论，有广阔的发展的前景。参考文献1Berg 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Garlingtor AW. Translocation of certain indigenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric lymph modes and other organs in a gnotobiotic mouse model. Infect Immun，1979，23：4034112. Alexander JW，Boyce ST，Babcock GF，et al. The process of microbial translocation. Ann Surg，1990，212：496-5123. Deitch EA. Microbial gastrointestinal transl