（分析化学专业论文）动力学液相色谱法.pdf

中文摘要 随着生命科学的发展，众多复杂生物样品的分析、分离与纯化为现代分离科学提出 了许多热点研究课题。色谱分离技术仍然是生物工程下游技术中的核心步骤，如何尽可 能获得良好分离效果是分离科学工作者追求的的个重要目标之一。近年来出现了一类 全新的色谱分离方法，其分离机理与传统的基于热力学理论的分离模式不同，溶质在动 力学因素，如流动相流速、填料颗粒的型状、大小的影响下具有不同的色谱保留特性， 利用动力学因素对溶质进行分离，我们将其称之为动力学色谱法。已有的工作多集中在 理论研究，实际应用多限于分离一些标准小分子和d n a 分子片段，因此该方法有待进 一步发展和开拓其用途。本文以反相液相色谱( r p l c ) 为载体，研究了溶质的动力学 色谱规律，发现了溶质普遍遵循的动力学方程式，提出了两个描述溶质动力学色谱行为 的动力学参数，并将其用于实际样品分离。 论文包括以下六个部分： 1 文献综述：简单地讨论了色谱动力学的发展、基础理论和主要内容，包括塔板理论、 速率理论、非平衡理论和质量平衡理论四部分。阐述了动力学色谱和色谱动力学的 主要区别。重点综述了两种动力学色谱，即流体动力色谱和障碍色谱的分离原理、 模型、仪器、应用和二者之间的异同点及联系。共引用文献7 5 篇。 2 以细胞色素c 肽谱为研究对象，初步研究了反相液相色谱中动力学因素对其分离效 果的影响。重点讨论了流动相流速对分离度、峰容量和溶质洗脱顺序的影响。同时 研究了溶质分子量与溶质相对保留值之间的关系、发现溶质相对保留值与流速之间 存在双对数的线性关系l o g ( r r t ) = a + 6l o g ( d ) 以及溶质分子量与方程式中二经验常 数口值和6 值之间的关系，并将该双对数的线性关系方程式与s d t 里的两组线性方 程式进行了比较。 3 探讨了小分子、多肽和大分子蛋白质在反相液相色谱中的动力学色谱行为。提出了 溶质普遍遵循的动力学色谱方程式，即l o g ( r r t ) = a + 6l o g ( v ) 。详细地探讨了该动力 学色谱方程式中的两参数a 、6 。在分离中的的意义，即参数a 的意义定义为在流动相 流速为1 o m l m i n 时溶质的相对保留值的对数值，6 值用来描述溶质相对保留值随流 速变化的趋势大小。由于口、6 均是在动力学因素流速变化的条件下描述溶质保留情 况的，因此，a 、6 是两个与热力学无关的动力学色谱参数。研究发现溶质的相对保 留值与分量之间无特定关系，也不符合s c 或t - i d c 机理。a 、b 之间具有一定的线 性关系，但其相关系数不是很好。 4 r p l c 中溶质相对保留值和流动相流速之间存在双对数线性关系，本章以l y s 中4 种较难分离的组分为研究目标，根据动力学色谱方程式中的两参数a 、b 的意义，对 该4 种组分的分离进行了动力学流速条件的优化。由动力学色谱参数a ，b 值推测了 溶质在不同流速时色谱图中的分离情况，验证了动力学参数a ，b 值所代表意义的合 理性，并预测了分离的最佳流速。 5 溶质在r p l c 中满足动力学色谱方程式l o g ( r r t ) = a + bl o g ( u ) ，实验证实小分子的 动力学参数b 值普遍地小于大分子蛋白质的b 值，因此流动相流速对小分子相对保 留值的影响趋势大于大分子蛋白，小分子在色谱柱中比大分子蛋白迁移速度的快。 本章据此提出了两种分离复杂样品的动力学色谱策略，即：a ：在流速增大到一定程 度时，小分子组分会和大分子组分在进行梯度洗脱时会快速分成两大部分，简化了 分离程序。b 小分子洗脱浓度是一个范围，而蛋白质大分子洗脱浓度很窄，可以认 为是一个点，洗脱复杂样品时，可以先进行一个适宜浓度的等度洗脱小分子，然后 进行梯度洗脱大分子。采用上述两种动力学色谱策略对蟾蜍卵子细胞组分进行了快 速分离纯化，并对高丰度多肽组分进行了去除，同时富集了低丰度蛋白组分。预计 该动力学色谱策略将为蛋白质组学从复杂样品中将高丰度组分去除同时检测低丰度 组分的提出了一个新的实用方法。 6 利用动力学色谱方程式两个动力学色谱参数a 、b 在不同热力学条件下的相对稳定性 提出了动力学色谱指纹图谱的初步构建。 关键词：动力学液相色谱法，高效液相色谱，肽谱，动力学指纹图谱，动力学色谱参数 a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n ti nl i f es c i e n c e ，al a r g e rn u m b e ro fh o tr e s e a r c h i n gt o p i c sf o r m o d e r ns e p a r a t i o ns c i e n c eh a v e b e e nr e p o r t e d c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yi ss t i l l t h ek e yp r o c e s so fd o w n s t r e a mb i o t e c h n o l o g y h o wt oo b t a i nt h eb e s tl cr e s o l u t i o nh a sb e e n a l l i m p o r t a n ti n v e s t i g a t e dh o tp o i n t i nr e c e n ty e a r s , an o v e lc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n m e t h o db a s i n go nh y d r o d y 7 n a m i cf a c t o r s ，s u c ha sm o b i l ef l o wr a t e ，t h es h a p ea n ds i z eo f p a c k i n gb e i n gd i f f e r e n tf r o mt h et r a d i t i o n a le q u i l i b r i u mt h e r m o d y n a m i c sw a se x p l o r e d a p a r t i c u l a rf e a t u r eo ft h i sc h r o m a t o g r a p h yi sf i r s t l yn a m e da sd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y m a n y c o r r e l a t i v ep u b l i c a t i o n sh a v e b e e nc o n c e n t r a t e di nt h e o r e t i c a lr e s e a r c h , t h e p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n sa r eo f t e nl i m i t e dt ot h es e p a r a t i o no fs o m es t a n d a r ds m a l lm o l e c u l e sa n dd n a m o l e c u l a rf r a g m e n t s , s om o r ej o b ss h o u l db en e e dt op r o m o t ei t sf u r t h e rd e v e l o p m e n ta n d e x p a n di t sa p p l i c a t i o n i nt h i sp a p e r , t h er u l eo fs o l u t er e t e n t i o nb yd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y i nr e v e r s ep h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) h a sb e e ns t u d i e d a ne q u a t i o nt h a ti so b e y e d u n i v e r s a l l yb y s o l u t e si sf o u n da n dt w op a r a m e t e r su s e dt od e s c r i b et h e d y n a m i c c h r o m a t o g r a p h yb e h a v i o ra r ef i r s t l yp r o p o s e d i nt h ee n d ，t h em e t h o di su s e df o rt h e s e p a r a t i o no ft h ea c t u a ls a m p l e s p a p e r si n c l u d et h ef o l l o w i n gs i xp a r t s ： 1 l i t e r a t u r er e v i e w ：ab r i e fd i s c u s s i o na b o u tt h ed e v e l o p m e n t ，b a s i ct h e o r ya n dt h em a i n c o n t e n t so fc h r o m a t o g r a p h i cd y n a m i c si si n t r o d u c e d i ti n c l u d e st h ep l a t et h e o r y , r a t et h e o r y , n o n e q u i l i b r i u mt h e o r y a n dm a s sb a l a n c et h e o r y t h em a i nd i f f e r e n c eb e t w e e n c h r o m a t o g r a p h i cd y n a m i c sa n dd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y i s e x p l a i n e d t w od y n a m i c c h r o m a t o g r a p h i e s ，h y d r o d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y ( s d c ) a n ds l a l o mc h r o m a t o g r a p h y ( s c ) w e r ei n t r o d u c e da n dr e v i e w e di nt h i sp a p e r , m a i n l yf o rt h er e c e n td e v e l o p m e n to fs e p a r a t i o n p r i n c i p l e ，t h e o r e t i c a lm o d e l ，a p p l i c a t i o n sa n d 7 5r e f e r e n c e sa r ec i t e d 2 b yt a k i n gt h ep e p t i d em a p p i n go fc y t o c h r o m e - ca sa ne x a m p l e ，t h ee f f e c to fd y n a m i c f a c t o r si nr p l ci si n v e s t i g a t e d i ti sm a i n l yf o rt h ee f f e c to nt h er e s o l u t i o n ，p e a kc a p a c i t ya n d s o l u t ee l u t i o no r d e rt os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ea n d r e t e n t i o n s ，w ef o u n dt h el o g a r i t h mo ft h er e l a t i v er e t e n t i o nt i m e ( r r t ) o fp e p t i d e st ob e t t t p r o p o r t i o n a lt ot h el o g a r i t h mo f t h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s e 加) ，巴 l o g ( r r t ) = a + bl o g ( u ) ( 1 ) t h e t w ol i n e a rp a r a m e t e r sw e r ea l s of o u n dt oo b e yt h ee q u a t i o n ： 口= c + db w h e r e ，钆ba r ee m p i r i c a lc o n s t a n t s ( 2 ) t h es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c e so fl o g l o gl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h et w ol i n e a re q u a t i o n s i ns t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y ( s d t ) a r ea l s oc o m p a r e d 3 t h ed y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ro fs m a l ls o l u t e s ，p e p t i d e sa n dt h ep r o t e i n si n r p l ci sa l s os t u d i e d t h ee q ( 1 ) i sa l s ot e s t e da n df o u n di tt ob eu n i v e r s a la n dd i s c u s s e di n d e t a i l b o t h 口ba g et h et w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i sp a r a m e t e r st h a th a v en o ta n y t h e r m o d y n a m i c sm e a n i n g as p e c i f i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em o l e c u l a rm a s so fp e p t i d e s a n dr e t e n t i o nv a l u e si sn o tf o u n da n dt h es o l u t ee l u t i o no r d e rd o e sn o to b e yt h em e c h a n i s mo f s co rh d c b o t haa n dbh a v eal i t t l el i n e a rr e l a t i o n s h i p ，b u tt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti sn o t v e r yg o o d 4 i nt h i sc h a p t e r , t h eo p t i m i z a t i o nf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ef o rt h es e p a r a t i o no ff o u r c o m p o n e n t so fl y sp e p t i d em a p p i n gi si n v e s t i g a t e da n df o u n dt h a ti ti sd i f f i c u l tt os e p a r a t e u s i n gc o m m o nm e t h o d h o w e v e r , t h es e p a r a t i o no fs o l u t e sa td i f f e r e n tf l o wr a t e so fm o b i l e p h a s ei sp r e d i c t e df r o mt h et w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r s ，aa n db t h e o p t i m i z a t i o nf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ew a sa l s op r e d i c t e da n di tv e r i f yt h em e a n i n ga b o u ta ， bi ns e p a r a t i o n 5 t h ee x p e r i m e n tc o n f i r m e dt h a tt h ebv a l u eo fi sg e n e r a ls m a l l e rt h a nt h a to fp r o t e i n m a c r o m o l e c u l e s t h e r e f o r e ，t h es m a l lm o l e c u l e s r r tc h a n g ei sg r e a t e rt h a nt h a to f m a c r o m o l e c u l a rp r o t e i n sa st h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ec h a n g e d t h em o v ev e l o c i t yo f s m a l lm o l e c u l e si sg r e a t e rt h a nt h a to fm a c r o m o l e c u l a rp r o t e i n si nc o l u m n a c c o r d i n gt ot h i s p r i n c i p l e ，t w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g i e sf o rt h es e p a r a t i o no fc o m p l e xs a m p l e sa r e p r e s e n t e d t h eo n ei st h a tt h ec o m p l e xs a m p l e sw i l lb eq u i c k l yd i v i d e di n t ot w om a j o r c o m p o n e n t s ，t h es m a l lm o l e c u l e sg r o u pa n dt h em a c r o m o l e c u l e sg r o u p ，w h e nt h ef l o wr a t eo f m o b i l ep h a s ei si n c r e a s eu pt oac e r t a i nv a l u ed u r i n gg r a d i e n te l u t i o na n dt h et w og r o u p sw i l l s i m p l i f yt h es e p a r a t e d t h es m a l lm o l e c u l e sh a saw i d t he l u t i o nc o n c e n t r a t i o nr a n g eb u tt h a t o fm a c r o m o l e c u l e si sv e r yn a r r o wt h a tc a nb es i m p l yr e g a r d e da s “ap o i n t ”，s ot h eo t h e r d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g yc a nb ea d a p t e d ：as u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n f o ri s o c r a t i c e l u t i o nt oe l u t es m a l lm o l e c u l e sf i r s t l y , a n ds u b s e q u e n t l yag r a d i e n te l u t i o nt os e p a r a t e m a c r o m o l e c u l e s c o m p o n e n t so fh o p t o a do v u mc e l lw e r er a p i d l ys e p a r a t e da n dp u r i f i e db y t h i sw a y h i g ha b u n d a n c eo fp e p t i d ec o m p o n e n t sw e r er e m o v e dw i t ht h el o w - e n r i c h e d p r o t e i n s i tw o u l db ee x p e c t e dt h a tt h et w od y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g i e sw i l lb ea n e w p r a c t i c a lm e t h o du s e df o rp r o t e o m i c s 6 t h et w od y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r s 口 bh a s m o r es t a b i l ec h a r a c t e ri n d i f f e r e n tt h e r m o d y n a m i cc o n d i t i o n s ad y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e rc h r o m a t o g r a m w a sc o n c e i v e ds i m p l y k e yw o r d s ：d y n a m i cl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ，p e p t i d e m a p p i n g , d y n a m i c c h r o m a t o g r a p h yf i n g e rc h r o m a t o g r a m , d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h yp a r a m e t e r v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：笸建荟指导教师签名：i 佥鳋芰堕 八_ 、1 撕7 年多月，9 日 年6 月io 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：唐壹聋 两7 年6 月10 日 西北大学博士学位论文 1 1 前言 第一章文献综述 随着生命科学的发展，众多复杂生物样品的分析、分离与纯化为现代分离科学提 出了众多热点研究课题。如何实现对细胞、组织或体液所包含的成千上万种组分的有效 分离，是现代分离科学研究所要解决的首要问题，同时也是难点问题。理想的分离方法 首先应具备高分辨率，能够快速将复杂组分同时分离并与后续的鉴定技术有效衔接。高 效液相色谱( 玎p l c ) 作为目前最为有效的分离方法之一，在蛋白质的多级纯化过程中， 发挥着至关重要的作用。 如何尽可能获得高的色谱分离度是分离科学工作者追求的的一个重要目标之一。色 谱的分离过程，受热力学因素和动力学因素的同时控制。为了得到满意的分离效果，首 先应考虑填料的性质及其与溶质相互作用的强弱，这主要表现在色谱柱和色谱模式的选 择上。同时由于流动相的种类与使用条件既影响动力学因素，又影响热力学因素，故必 须正确地选择并优化色谱分离条件。上述这些问题，都涉及到色谱的基本理论。 色谱技术的理论基础可以大致归纳为色谱热力学和色谱动力学两大部分。色谱热力 学的问题，众多色谱工作者研究的很多。这里，拟简单地讨论色谱动力学的几个问题， 主要讨论一种新的色谱模式一动力学色谱。 1 2 色谱动力学 色谱过程动力学理论研究是色谱分析实现高效、快速的理论基础。色谱动力学理论 主要研究在色谱过程中物质在柱内的输运现象【。其研究的主要目的是解释穿透曲线的 形状，探求影响色谱峰扩张的原因和机理，为获得高效能色谱柱系统提供理论指导，为 选择色谱分离条件奠定理论基础。在物料平衡原理的基础上，根据物质在柱内的传输、 分配状况，可以推导出溶质迁移必须遵守的规律，即色谱动力学方程。求解动力学方程 可以获知色谱流出曲线的形状。进而研究柱效率、峰形与各种参数之间的关系。 色谱动力学理论可分成塔板理论【2 1 ，速率理论，非平衡理论【3 1 和质量平衡理论四部 分。塔板理论中引出的塔板数和塔板高度的概念在表征柱效时是很有用的参数，但塔板 理论不能把柱效与色谱参数定量地关联起来。速率理论和非平衡理论分别从微观和宏观 1 第一苹文献综述 的基点出发研究色谱分离动力学过程，而且能把柱效与色谱参数关联起来，这对改善色 谱柱结构，提高柱效是有指导意义的，但不能给出色谱流出曲线形状。质量平衡理论能 从物理意义上描述各种机理的色谱分离过程，也能有效地给出色谱柱效与参数的关系和 色谱流出曲线的信息，但是其数学推导和求解特别复杂。 1 2 1 塔板理论( p l a t et h e o r yo f c h r o m a t o g r a p h y ) 塔板理论是m a r t i n 和s y n g e 于1 9 41 年首先提出的，是对色谱过程进行描述的初次 尝试。在m a r t i n 之后，s a i d 等学者也对这一理论做了补充和完善，使塔板理论为色谱 界所接受。塔板理论将一根色谱柱看作是一根精馏柱，它由许多单级蒸馏的小塔板和小 短柱组成，每一个单级蒸馏的小塔板或小短柱很小，但允许溶质在其中有足够的时间达 到两相间的平衡。就像在精馏塔内进行精馏一样，这种假想的踏板或小短柱越小或越短， 就意味着在一个精馏塔或分离柱上允许进行反复平衡的次数就越多，即具有更高的分离 效率。 塔板理论基于以下几个基本假设：l 、色谱柱内径和柱内填料填充均匀，色谱柱由 若干小段组成，每一小段的高度为h ，这样一小段称为一个理论塔板。2 、溶质分子在 塔板内固定相和流动相之间的分配瞬间达到平衡，且纵向分子扩散可以忽略。3 、溶质 在各塔板上的分配系数是一个常数，与溶质在每个塔板上的量无关，即呈线性分布等温 线。4 、流动相通过色谱柱是不连续的，而是脉冲式的间歇过程。5 、溶质开始时加载色 谱柱零块塔板上。 塔板理论将色谱过程看作是一个平衡分配的不连续过程，这是一种理想的极限状 态。实际的色谱过程是一个动态过程，很难实现真正的平衡。塔板理论忽略了色谱过程 中分子扩散等因素，其理论假设不能全面反映色谱分离本质，色谱过程不仅与分配平衡 有关，而且与分子扩散、传质，即分子速率有关。 1 2 2 速率理论( r a t et h e o r yo fc h r o m a t o g r a p h y ) 鉴于塔板理论的局限性，v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年在前人工作的基础上，研究了扩散、 传质等于色谱过程物料平衡或质量平衡的关系，根据物料平衡方程，考察溶质通过色谱 体系总的浓度变化，导出速率理论方程。其后g i d d i n g s 将色谱过程看作分子无规则运 动的随机过程，用随机行走( r a n d o m w a l k ) 模型来描述它，根据随机理论导出速率理 论方程。 速率理论运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩张的因素。总结起来包括 2 西北大学博士学位论文 两大部分：柱外谱带展宽效应和柱内谱带展宽效应，而柱内谱带展宽效应主要有4 种， 即多路径效应( m u l t i p a t he f f e c t ) 、纵向扩散( 1 0 n g i t u d i n a ld i f f u s i o n ) 、流动相中的传质阻 力( t h er e s i s t a n c et om a s st r a n s f e ri nt h em o b i l ep h a s e ) 以及固定相中的传质阻力( t h e r e s i s t a n c et om a s st r a n s f e ri nt h es t a t i o n a r yp h a s e ) 。 在总结了上述各种引起峰展宽的效应的基础上，v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年提出了填充 气相色谱柱内总理论塔板高度的方程，即 一2 d p + 孕+ 警 ) 其中 五= 砉志 ( 1 2 ) 根据这一表达式，可以比较精确地预测给定的色谱柱在优化的流动相速度下的柱效 率，以及各种因素对总理论塔板高度的影响。这对于色谱柱的优化设计是十分重要的。 从v a nd e e m t e r 方程中可以得到一个最佳流速。 v a n d e e m t e r 方程虽然比较满意地描述和解释了发生于色谱过程中的谱带展宽过程。 但是，在实际应用中发现有时试验值偏离公式。于是，后续学者继续对其进行了广泛而 深入的研究，并提出了一些修正的v a nd e e m t e r 方程，如g i d d i n g s 方程、h u b e r 方程、 h o r v a t h l i n 方程、k n o x 方程和描述开管柱的g o l a y 方程。 1 2 3 质量平衡理论( m a s sb a l a n c em o d e l ) 质量平衡理论能从物理意义上描述各种机理的色谱分离过程，可以有效地给出色谱 柱效与参数的关系和色谱流出曲线的信息。许多色谱工作者【5 1 对该理论的发展和应用 做了大量的工作。但他们的工作都仅仅考虑了色谱柱内的动力学过程。邹汉法【2 】等人在 前人的工作基础上，考虑到柱外效应的影响，建立了整个液相色谱系统的质量平衡模型， 导出了色谱流出曲线的一级矩和二、三级中心矩的表达式，并给以了一定的讨论。 1 2 4 色谱动力学模型( c h r o m a t o g r a p h yd y n a m i cm o d l e ) 色谱分离过程的动力学研究可用来分析流出曲线的形状，探求引起色谱峰区域宽度 扩张的众多因素和机理，可以建立适宜的色谱模型来对某分离单元的分离过程进行数 学模拟。色谱技术和计算机的发展为动力学色谱模型的建立提供了便利，目前研究者们 已经提出了许多色谱模型用于色谱分离过程动力学的研究。其中最常用的几种模型包括 普遍化速率模型( a r ) 、集总孔扩散模型( p o r ) 、平衡扩散模型( e d ) 和传递扩散模型( t d ) 第一章文献综述 1 3 动力学色谱( d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y ) 近年来出现了一类新的色谱分离方法，其分离机理与传统的基于热力学理论的分离 模式不同，溶质在动力学因素，如流动相流速、填料颗粒的型状、大小的影响下具有不 同的色谱特性，利用动力学因素等对溶质进行分离。这种方法最大的特点就是溶质的分 离是依靠于流体力学现象而非传统的热力学中的溶质在固定相和流动相之间的化学平 衡，显著影响溶质保留值的是各种流体力学因素，如固定相颗粒的大小、流动相的流速、 温度和黏度以及溶质的空间构型，而化学因素，如固定相颗粒的化学性质、孔径和溶剂 的疏水性并不是影响分离的关键因素。其主要研究内容是研究动力学因素对溶质的保留 值、分离度、峰容量等色谱行为的影响。 1 4 动力学色谱和色谱动力学 色谱动力学研究的主要目的是解释穿透曲线的形状，探求影响色谱峰扩散的原因和 机理，为获得高效能色谱柱系统提供理论指导，为选择色谱分离条件奠定理论基础，并 在物料平衡原理的基础上，根据物质在柱内的传输、分配状况，推导出物质输运必须遵 守的规律，即色谱动力学方程。求解动力学方程可以获知色谱流出曲线的形状。进而研 究柱效率、峰形与各种参数之间的关系。 动力学色谱研究的主要内容是研究动力学因素对溶质色谱迁移行为的影响，探求溶 质在动力学因素影响下的相关迁移规律，建立溶质分离的动力学模型，为选择最佳的色 谱分离的动力学条件奠定理论基础。 1 5 两种动力学色谱( h d c 、s c ) 的发展和应用 液相色谱的分类依据溶质与固定相之间的作用特征，可分为离子交换色谱，疏水相 互作用色谱和反相色谱，亲合色谱及尺寸排阻色谱等。近年来出现的两种色谱模式，即 流体动力色谱( h y d r o d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y , h d c ) 和障碍色谱( s l a l o m c h r o m a t o g r a p h y , s o ) ，其溶质均与固定相之间的作用特征无关，或关系甚小，而主要是 与流动相的流动特征有关，或是基于动力学因素发展起来的两种新的色谱方法，二者通 称为动力学液相色谱法。目前已经在测定和分离聚合物、多肽、d n a 和生物大分子方 面有广泛的应用。耿信笃曾经在一篇综述中，从与s e c 做比较的角度简要地介绍了 4 西北大学博士学位论文 t s i h d c 和s c 的分离原理及二者之间的不同点，下文详细并系统地说明了h d c 和s c 的分离原理、模型、理论发展、仪器设备和最新应用，也探讨了h d c 与s c 之间的联 系及相互转化。 1 5 1 流体动力色谱( 皿c ) h d c 是s m a l l 等在7 0 年代初就己开发的一种可同时测定聚合物或胶体乳胶粒的 直径及其分布的方法【1 9 m 】。他们采用了无孔刚性固体颗粒填充色谱柱，待分离乳液在高 压下通过色谱柱时，由于不同大小的溶质所受到的水动力效应的不同，其乳液在流动相 中的移动速度也不同，因此实现了聚合物或胶体悬浮液的分离。m o i l 2 2 l 等研究者进一 步发展和完善了h d c ，并将其引伸到某些天然高分子的分离。后来科学家发现在一根直 径为几百微米的毛细管中同样也可实现不同粒径混合物的分离【2 3 , 2 4 l 。这种采用毛细管， 而不是填充柱作为分离柱的分离方法拓宽了h i ) c 的应用范围，这在理论研究和实际应 用上都有着非常重要的意义。e l i e 和r e h a u d 曾利用管径为1 5 m m 的毛细管成功地对 纸纤维悬浮液中的纤维颗粒进行了分离【2 5 1 。用内径小于1 0 “m 的毛细管，称其为微毛 细管，其分离机理与内径大于1 0 岬的毛细管略有不同，s i l e b i t 2 6 l 和d o s r a m o s 2 7 1 以及 t i j s s e n 2 8 1 和b o s 2 9 】对微毛细管h d c 进行了详细的理论探讨和应用研究。 1 5 1 1 皿c 的原理 1 5 1 1 1h d c 柱 毛细管h d c 和填充柱h d c 所需色谱装置大体相同。二者的不同之处在于毛细管 h d c 采用管径不同的毛细管作为分离色谱柱，而填充柱h d c 则使用无孔刚性固体颗 粒填充的色谱柱。相对于毛细管h d c ，填充柱h d c 的设备相对简单，操作也更为简便， 尤其是检测手段的简化，使用一般的紫外检测器便能满足要求。而毛细管h d c 受到进 样量和检测浓度的限制，要求检测器较为灵敏，通常使用高灵敏度紫外检测器或其它手 段，如电位分析、激光激发荧光法及激光光散射法等f 3 们。 1 5 1 1 2h d c 分离模型 尽管h d c 包括了前述的两种主要模式，毛细管t t d c 和填充柱h d c ，而大部分有 关h d c 的理论都以前者为主【3 1 , 3 2 l ，由于可将填充h d c 颗粒间的间隙视为毛细管体系， 故填充h d c 有与毛细管h d c 相同的分离模型。 h d c 的分离机理可描述为：当流动相从填料颗粒间经过时，由于水动力效应的存 在使其流型为层流抛物面型，溶质在这种情况下的分离主要是借助于靠近填料颗粒表面 第一苹文献综述 的低流速区域所产生的排斥效应，大的溶质分子由于受到的排斥效应大于小的溶质分 子，更容易远离填料颗粒表面而进入高流速区域，这样大分子溶质的移动速度大于小分 子溶质，从而先于小分子被洗脱出来。有多个模型描述了溶质在h d c 中的保留行为， 最简单的仅考虑了几何学效应，而常用的模型是d i m a r z i o 和g u t t m a n l 3 3 3 4 及b r e n n e r 和 g a y d o s l 3 2 1 依据几何学原理而提出的保留时间和溶质大小的关系，如图1 1 所示，溶质分 子在毛细管内的迁移可用方程( 1 3 ) 来表示： r = ( 1 卅执一c ”。1 ( 1 3 ) 式中，r = t m t o 为溶质的保留值与无限小的标记物的保留值之比，也称之为相对 保留值；x - - d e ，以为溶质的有效直径，是毛细管的直径。占和c 均为与几何学 有关的常数；c 值介于0 5 5 之间【3 5 l ，在填充柱里c 值介于2 7 - 2 8 之间。 从式( 1 3 ) 看出，对于粒径不同的颗粒来说，其相对停留时间是不同的，这样具有 不同大小颗粒的溶质便可用皿c 法进行分离。由于大分子先于小分子被洗脱出来，因 此，虽然它所用分离原理与常讲的尺寸排阻色谱( s e c ) 不同，但其洗脱顺序却与s e c 相同。 然而这里需要指出的是，在式( 1 3 ) 的推导过程中假定被测粒子作为刚性的不旋 转微球来处理，而实际上对于流动体系中的粒子来说，其上下所受的力是不平衡的，在 力矩的作用下将发生旋转，反过来将会影响其流动速度。这个现象最早由d i m a r z i o 和 g u t t m a n l 3 1 1 以及b r e n n e r 和g a y d o s 3 2 l 论及。 图1 1 大溶质分子移动快于小分子的h d c 分离原理示意图 f i g u r e l - lp r i n c i p l eo fh d cs e p a r a t i o n l a r g e ra n a l y t e sc a n n o ts a m p l el o wf l u i dv e l o c i t i e sn e a rt h e c h a n n e lw a l la n dt h e r e f o r em o v ef a s t e r 1 5 1 2h d c 的发展和应用 用h d c 分离时要求溶质分子的大小与流经管道直径的比值不是太小，应大于 o o l ，一般介于0 0 1 0 3 5 之洲3 们。在t - d c 提出的初期，人们使用小孔径的毛细管( i d 5 0 - 5 0 0 p m ) ，或者使用填充1 0 2 0 1 m a 填料的填充柱，其内部管道相对较大，因此它们仅 6 西北大学博士学位论文 局限于分析较大的一些溶质，如纤维和固体颗粒【2 1 , 3 7 , 3 引。一般来说，采用小内径的毛细 管，或非常小的粒径均匀的微球作为填料时可显著提高h d c 柱的柱效，因此后来人们 使用内径更小的( - 5 i u n ) 的毛细管和更小颗粒的填料( 1 1 5 9 m ) 3 5 , 3 9 】来提高h d c 的 分离度，如，s t e g e m a n 等 4 0 , 4 1 】利用粒径范围在( 1 4 2 7 ) g r n 单分散s i 0 2 微球为填料分 离聚苯乙烯颗粒、胶体s i 0 2 颗粒和蛋白质等，取得了良好的分离效果。考虑到r d c 的 分离机理在体积排除色谱( s e c ) q 口同样存在，故可将h d c 与s e c 结合，从而拓宽所分 离溶质分子量的范围。c h e n g 4 2 j