minRNA检测方法.doc

microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为2024nt。成熟的miRNA 5端有一个磷酸基团，3端为羟基，由具有发夹状结构的约7090nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。 最近有研究指出，miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA。 目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵（microarray）分析和实时定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。1、Northern印迹分析（Northern Analysis） Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。不足之处：1）Northern分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA功能机理的实验中，Northern印迹分析还是能够满足研究需要的。2）Northern印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA分子每细胞。另外，由于Northern印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a和let-7b之间仅有一个碱基的差异，导致Northern印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern印迹实验的重复性较弱。3）Northern印迹耗时，耗量。进行一次miRNA检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern印迹大概需要5到10微克的总RNA量上样量才能成功检测出miRNA，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。2、微点阵（Microarray）分析 微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA，它通过测定特定过程中miRNA的表达水平，来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。不足之处：1）微点阵仍然需要足够的RNA初始样本，大约为每个微点阵5微克。2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的miRNA。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA和成熟的活性miRNA。3、定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR） 定量实时PCR技术通过扩增技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。定量实时PCR中TaqMan (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特异性分析依赖于两个PCR引物和一个序列特异的TaqMan探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR的检测，从而使得对PCR后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。 尽管定量实时PCR相比Northern分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA时还是遇到了挑战。由于成熟miRNA长度较短，难以设计成熟miRNA的有效的特异引物和探针，于是很多研究者对较长的前体miRNA分子进行定量实时PCR检测，利用前体miRNA的水平作为成熟的活性miRNA的替代标记。然而细胞内存在的前体miRNA的水平不能有效的指示相应的成熟miRNA水平，因此这种方法无法达到预想中的效果。 目前已有新的定量实时PCR的方法被用来解决检测miRNA中遇到的这些问题。这种新方法利用一种茎环（stem-loop）状引物进行miRNA的反转录，然后再进行定量实时PCR。这个茎环状结构对成熟的miRNA 3 端具有特异性，能够将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3 引物位点进行实时PCR。这种茎环状结构也被认为可以形成一种空间的阻碍以防止对前体miRNA进行PCR引导。然后就可以利用实时PCR进行高特异性的定量检测miRNA的表达水平。这种实时PCR的优点是：1）可以在起始样本量很小的情况下进行（RNA总量在1到10ng之间）。2）动态范围达到了7个数量级，因此可以检测大量或者少量的miRNA。3）这种方法可以区分只有一个碱基差别的miRNA。4）和传统的定量实时PCR检测相比，在实验室中生产这些新的茎环状结构是很快并且很简单的。三种检测方法的比较Northern印迹微点阵定量实时PCR初始样本量510微克大约5微克110纳克敏感度低中等高特异性低中等高动态范围2 logs4 logs7 logs通量低高中等、高实验时间几天几天几小时区分前体与成熟miRNA的可靠性是（miRNA数目少时无法区分）否（需要额外的区分大小的步骤）是能否区分序列差别少的miRNA不能不能能参考文献：1Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 248624942Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。问题目的研究方法应用有哪些miRNA表达？miRNA表达情况深度测序&生物信息学分析生物信息学分析预测可能的miRNA，进一步验证发现新的候选miRNAmiRNA何时表达？在哪里表达？表达差异？miRNA表达特征miRNA芯片，磁珠流式细胞miRNA表达谱qPCR对hit miRNA进行验证，Northern Blot，原位杂交等发现差异miRNA，为进一步功能研究、诊断，预后判断，疗效检测等奠定基础miRNA控制哪些基因？这些基因功能？所在信号通路？miRNA功能分析生物信息学分析qPCR对hit mRNA进行验证，Western Blot等方法检测蛋白表达水平转入miRNA mimics观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况）转入miRNA antagomirs观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况）机理研究，功能研究miRNA如何控制靶miRNA确定结合位点生物信息学分析miRNA结合靶mRNA 3UTR的可能序列构建包含miRNA结合位点（3UTR）以及位点突变的萤光素酶报告载体进行验证机理研究miRNA功能（与特定疾病、表型的关系）miRNA功能分析细胞水平：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化动物模型：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化临床组织样本，检测miRNA表达情况与疾病相关性功能研究miRNA应用于诊断诊断选择疾病相关的一个或一组miRNA，或结合其它基因水平变化，进行q-RCR等检测诊断，预后判断，疗效检测miRNA应用于治疗治疗转入合成的小分子miRNA模拟物（miRNA低表达情况）或拮抗剂（miRNAG高表达情况）治疗miRNA主要研究技术深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。(欧易生物为您提供以上项目的优质服务，详情请关注：)Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA之后，找到位于3-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。miRNA的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA表达谱，Northern Blot或核酸原位杂交检测miRNA的表达，miRNA克隆、测序等等。另外，在miRNA研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具-生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。miRNA研究中常用的软件和数据库资源以下是常用的microRNA靶标数据库和软件资源列表，希望对microRNA的研究者有所帮助。（1）miRbase：众所周知的microRNA基因注释数据库。目前miRBase只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。 网址：/index.shtml（2）starBase：一个高通量实验数据CLIP-Seq（或称为HITS-CLIP）和mRNA降解组测序数据支持的microRNA靶标数据库，整合和构建多个流行的靶标预测软件的交集和调控关系。网址：/（3）Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。网址：http:/microrna.gr/tarbase/（4）miRecords：一个整合的microRNA靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址：/（5）targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。而且是microRNA领域大牛Bartel实验室开发的。网址：/（6）PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA领域大牛Rajewsky实验室开发的。该文章位列miRNA相关文章引用Top5。网址：http:/pictar.mdc-berlin.de/（7）PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility）和自由能预测microRNA的靶标。是著名的生物信息学家Segal实验室开发的。网址：http:/genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html（8）RNA22：基于序列特征预测microRNA的结合位点。是几个流行的microRNA靶标预测软件的其中一个。IBM公司的研究团队开发的。网址：/rna22.html（9）miRanda和microRNA.org：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中心的研究人员开发的软件和数据库。miRanda的最新版本又叫mirSVR。网址：/microrna/home.do（10）MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 实验室开发的microRNA靶标数据库。网址：http:/www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/（11）miRTarBase：整合实验证实的microRNA靶标的数据库。网址：.tw/index.html（12）miRGator v2.0：整合microRNA表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址：http:/mirgator