（临床兽医学专业论文）mpf对精母细胞减数分裂调控作用的研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 m p f 对精母细胞减数分裂调控作用的研究 临床兽医专业硕士研究生白汝岚 指导教师张家骅教授 中文摘要 p f 即成熟促进因子( m a h m t i p 啪t 蚍缸参与了卵母细胞的减数分裂，但对于其在 精子发生过程所起的作用及机制目前还不清楚。本实验旨在研究m p f 在精母细胞减数分裂中的作 用，为精子体外发生( i i i v i 帅甲燃鲫鼯i s ，s ) ，优化体外培养条件提供依据 为了阐明m p f 在小鼠精于发生不同阶段的表达规律，本实验采用不同发育时段小鼠睾丸，经消 化离心得到细胞悬液，通过流式细胞仪分析细胞倍性，同时利用免疫组化结合m p f 活性检测，分析 了桔子生成的时相特征以及m f 活性与精子生成之间的相互关系。结果发现8 日龄、1 4 日龄小鼠 睾丸没有单倍体出现，从1 8 日龄开始小鼠生精细胞单倍体开始出现，但比例很低，而四倍体增加达 峰值。免疫组化和f 活性检测表明1 8 日龄小鼠睾丸f 两亚基表达量高，而且m p f 活性也 处于较高水平以上结果表明：1 8 日龄小鼠睾丸生精细胞大多处于即将进入减数分裂的初级精母细 胞阶段，m p f 活性最强，生精细胞发育时程与m p f 表达及活性情况一致。 为了进一步研究m p f 在精于生成中的作用，我们以1 8 d 小鼠睾丸为实验材料，采用生精细胞与 支持细胞共培养体系，通过检测细胞活性和m p f 活性，发现b li ( 丁酸内醋，b u t y m i t ci ) 抑 制m p f 活性的最佳浓度为o 6 8 “m o i ，l b 卜i 使混合培养体系中四倍体和单倍体比例下降，= 倍体 比例则有所提高，这表明m p f 对精母细胞第二次减数分裂有重要作用。 关键词：m p f 精子发生减数分裂b l i 西南大学硕士学位论文a b s 妇c t r e s e a r c ho nt h er o l eo fm p f d u r i n gm e i o s i s i n m a l eg e r mc e l l s c l i l l i c a l 、，c t 甜n a up o s t 铲a d u a t eb a ir u l a i l a d v i s e r z h a n g j i a j l u ap r o f c s s o r a b s t r a c t m p f ( 眦t i l i a 虹p r o m o t i i l gf a c t o r ) ，p a n i c i p a i ei nt i i em c i o s i so f0 0 _ c y t e s ，b u tt l l em l ea n dt h cc 0 咖i m e c h 衄i s mw c 豫n o td i s 如c t e d w ei n t d e dt or 部e a r c ht 1 1 er o l eo fm p f d u r i i i gi m i i si l l m l eg e n n c e l l sl l l o u g l lo 呱e 坤c r j 腓咄w l 正c hw o u l dp r o “d ca 他f e 啪t o s ( i n “咖印啪m t o g e m s i s ) 锄d o p t i 】n i z et l l ec 讲删o no f c l l l t i i 咒i nv i 帅 ho r d e rt om 衄【l i n g t c 血ec x p 坞鲭i o n 心g i i l a r n yi nd i f r e 埘l tm l a 端o fs p 盯m 咖踟i sj i im i ，w b a q u 硼c e ns m p c n s i o n 衄t c s t e si nd j s t i n c td c v e l 叩m e n tp h a sb yd i g e g 曲g 柚dc 锄硒如g i n g n 帅 鲫脚y 髓dc c up l o i d yb yf 1 0 wc ”o n 嵋t e i na d d i t i o na 皿l y 孺dt h c 陀l a n o 璐m p 脚i l gt h cp h a f b t u mo f g 帆e p o i e s i s ，n v i t yo fm 】p fa n dg o n 印o i e s i sb yi m m u n o h i s 妣h e i i l i c a lm e l l l o dc 鳅岫d i n gw 妯t l l c 山：t c c o no f h v i 啦t h e 鹋s i l l ts h o w e dt 1 1 a ti nr i l i c ea tt i ea 铲o f 8d a y s d1 4d a y st i i c r ew n 0h 印l o i 4 w l l i c ha p ：砌丘o m1 8 d 。b u tv e r yf e w w h e nt e 唧i o i di n c 他鹊e dt op e a i c i i l g ，i i la d d i 6 t i i ee 砩嘴s s i o n o f t h e t w os 血础a n dm c b v i t yo f m p fw e f ea t t i i eh 讪l e v e l o nm cw h o l e m “a t t i i e8 9 eo f l 8 幽y s ，m 傩to f 叩慑m 砷明胃f l i cc e l l sw e r ep r i m a ys p c 删t o c y t e s t 1 1 e 踮石v i t yo f m p f w 越碡1 l i g i i t 瞄ta l l d t l l c 蛐no f d w c l 叩l m n tp l 粥c so f s p e 咖a t o g e n i c l l sc o i i d c dw i t t it l l ee x p 嗌s i 伽a n d d v i t y 坤s u l t o f m p f f o r a 托hi l l er o l eo fm p fi i is p e 忸t o g c n 髓i s ，w ed i s c o v e 阳dt 1 1 eb e s tb li ( b u t y m i 孔t o e i ) c 蚰c e n t r a t i o nt oi i l l l i b i t 越6 “t yo fm p fi so 6 8 p m o l ，l ，w 油m es u b j e c to f1 8 出y sm i c e ，妫协b i i i s h 崦 o o c u l n l r es y s 咖a n da m l y z i n gt h e 神b v i t i e so f c e l l s 卸dm p f a tm a tc 彻c e n 订习血o n ，b lic 卸s c dt l l em l e d c c 佗器访go ft e 扛谢o i d 锄dh a p l o i d ，o nm ec o n 仃a r yt h er a t eo fd i p i o i di n c r e 鹞c d ，w h i c hi n d i c a t e d 咿fi s e s 阳n a it om e c o n dm c i o s i so f s p c r m a 协c y t e 1 “yw o r d s ：m p fs p e r m a t o g e n s i sm e i o s i sb l i n 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中引用他人已经 发表或出版过的研究成果，文中己加了特别标注对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、 朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢 学位论文作者：j 讨奴磬 签字日期：叉k 年多月1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书， 本论文：口不保密，口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：t 沿氙 签字日期：0 越年月1 日 导师鲐办坼 签字日期：俩年；月，日 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献绋述 动物精子发生( 印m 【t o 鲫$ i s ) 是生命周期中的一个重要环节也是一个既有有丝分裂又有减 数分裂的高度复杂而有序的特殊细胞分化过程。辅子发生过程中减数分裂调节的分子机制已成为生 物学领域中一个重要的研究课题。从分子水平上研究初级精母细胞减数分裂能力的获得及减数分裂 调节机制不仅可以丰富发育生物学、生殖生理和遗传学的理论基础而且对于实现精子体外发生( 加 v 曲v 叩即n a i o g c s i s s ) 、优化体外培养条件具有潜在的指导意义。m p f 作为细胞增殖重要的调 控因子，是探求初级精母细胞减数分裂调节机制钓重要环节，因此本文将阐述精于发生及m p f 的研 究现状，分析各研究取得的进步及存在的不足，希望对相关领域研究提供一些参考。 l 精子发生的研究 1 1 精子体外培养的进展 1 9 2 0 年首次报道用血浆培养睾丸组织研究体外精子发生以来随着对睾丸组织结构、各种细胞 的功能和精子体内发生过程的逐步认识以及体外培养技术的发展，睾丸未成熟生精细胞的体外培养 方法和技术也有了很大改进 1 1 1 早期研究成果 2 0 世纪2 0 年代至6 0 年代末取得了四方面成就：所设计的组织培养系能使生殖细胞进入减 数分裂前期：初级精母细胞能从细线前期向粗线期分化。在器官培养方面甩原始未分化的生殖 腺体外培养能产生性分化。 在含5 c 0 2 ( v ，) 的空气、p h 值7 2 0 2 、温度3 2 3 5 培养条件下， 改变培养基营养成分应用丙酮酸作为培养基能量底物，加入胎牛血清、氨基酸及维生素等类物质， 雄性生殖细胞体外培养结果较好【啦渤。用h 3 ( 氚) 胸腺嘧啶脱氧核苷m 3 皿r ) 作为放射性标记物， 跟踪生殖细胞的分化过程为检测生殖细胞的体外分化阶段提供客观依据。这些早期研究成果为后 来的研究者提供了可靠的方法即使在现阶段仍具有重要意义 1 1 27 0 年代以后共培养( 。u l t u 旧的发展 2 0 世纪7 0 年代以后创立了模拟体内微环境的体外培养方法，即雄性生殖细胞和支持细胞的体 外共培养。共培养按其对支持细胞的营养供给方法分为非渗透性和渗透性支持物共培养两种；按其 共培养的细胞种类分为同种支持细胞和异种非洲绿猴肾上皮细胞( v e 细胞) 共培养两种。另外，对 生殖细胞分化的检测方法也有很大改进。非渗透性支持物培养是将支持细胞置于非渗透性支持物上， 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 如塑料、玻璃培养皿等，培养成细胞单层后，再将生殖细胞直接种植在这一单层上共同培养。1 9 8 1 年，聒盯m n b a u m 等”】用此托培养方法研究支持细胞和生殖细胞间的相互作用，观察到细线前期初 级精母细胞分化至粗线后期初级精母细胞。m a g l l c r 镐b a 出s t o l l j 等1 5 l 用成年大鼠睾丸粗线期初级精 母细胞与2 0 d 龄大鼠的支持细胞共培养7 d ，约有l o 的粗线期初级精母细胞能发育成精子细胞。渗 透性支持物培养也称双室培养在普通培养皿内放置一个套皿套皿底部装有微孔滤膜或生物材料 构成的渗透性薄膜使培养皿分隔为上下两小室，培养液置于下室，当上室培养的支持细胞形成细 胞单层后，再将生殖细胞置于支持细胞单层上共培养。1 9 9 2 年，1 h s 等【6 1 改进了双室培养的渗透膜， 用透明的细胞外基质( 胶原酶及粘多搪) 构成的聚合体作为渗透膜，可以在体外培养过程中观察细胞的 形态变化。他们用此方法观察到精原细胞扩增并分化至减数分裂前期；初级精母细胞发生减数分裂 分化；圆形精子细胞形成长形精子细胞，有结构正常的顶体、可活动的鞭毛。现代取室培养系的渗 透性薄膜采用聚乙烯对苯二酸o o l y 甜l y l e t c r 印h 1 a l a i c ，p e l r ) 膜，操作简便培养的效果更为稳定、 可靠。：f o 细胞是异种的非整倍体细胞可分泌甘氨酸、丙氨酸、乳酸盐、生长因子、可溶性因子 ( 如促有丝分裂因子) 等促进生殖细胞的发育、分化；同时去除培养环境中对生殖细胞发育不利的物质， 如重金属二价暇i 离子、次黄嘌呤、代谢抑制因子等1 7 。l ，还能分泌体内精子发生所需的部分生长因子 与白介素。 1 1 3 细胞在体外存活及分化 c m d e s 等h 1 将人圆形精子细胞置于v c r o 细胞条件培养基中共培养5 d ，能使这些细胞进一步 发育成熟为长形精于细胞。s n 等【9 1 用非梗阻性无精子症患者睾丸活检的组织分离、纯化。获得初、 次级精母细胞与支持细胞，置于细胞条件培养基上共培养2 3 周，结果初、次级精母细胞经减 数分裂分化成圆形精子细胞这些圆形精子细胞进一步发育成熟为具有正常形态的跃形精于细胞 他们将这些接近成熟的长形精于细胞通过卵胞浆内单精子注射术( i c s i ) 注入人卵内，结果有囊胚形 成。这些精子细胞的受精率约3 1 3 8 ，但大多数已受精的胚胎未能发育到桑椹胚阶段且伴有性 染色体异常。w e i s s 等m 川双室培养取得比较好结果的同时，改进了生殖细胞发育的检测方法：用 5 一溴_ 2 - 脱氧尿茁( b r d u ) 替代h 3 - t d r 作为胸苷类似物标记，跟踪观察生殖细胞的分化；应用p c r 技术检测培养细胞特异性基冈表达的变化：编码磷蛋白1 9 ( p 1 9 ) 和睾丸特异性组蛋白2 b ( t h 2 b ) 的 i i l r n a 特异性表达丁粗线期初级精母细胞编码过渡蛋白1 f r p l ) 和过渡蛋白2 ( t p 2 ) 的m r n a 特异 性表达于圆形精子细胞在培养过程中定期检测培养细胞中p 1 9 、t h 2 b 、t p l 、t p 2 的水平，观察 p 1 9 ，r p l 、t h 2 b ，r p 2 的变化从而确定培养细胞分化、发育情况。这样既可避免放射线对细胞发育 的影响，义能更准确地确定细胞分化的各个阶段。 2 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 4 器官培养和组织培养的发展 用器官和组织培养的方法研究雄性生殖细胞体外成熟过程的优点是保持睾丸原有的正常腔室结 构和生殖细胞与体细胞的相互联系。器官培养是研究精原细胞分裂及其进入减数分裂前期调控机制 的很好的培养模型用。1 9 8 3 年，p a r v i n 等用透视微分离技术他d l l l i q u f 缸硼s i l l u m i m a 豁i s t 酣 l i l i 廿0 d i s s e c t i 彻汾离出某特定阶段的生精小管片段，培养2 d 后大多数初级精母细胞完成了2 次减 数分裂，分化成精子细胞。2 0 0 0 年s k i u b 等【l w 进一步改进了组织培养的方法，将生精小管用酶消 化后得到的小管碎片置于双室培养系中经3 周培养，细线期初级精母细胞分化为圆形精子细胞。 从而完成了完整的减数分裂阶段的分化。同时，他们除用b r d u 标记和检测培养细胞的特异性基因 t p l 、t p 2 外，还用光、电镜观察培养细胞的超微结构变化，用流式细胞仪分析培养细胞的倍体变化 发现培养得到的耩子细胞发生时程和形态与体内相应生理情况下一致。 1 1 5 未成熟生精细胞体外培养的研究在辅助生殖上的应用 男性不育症患者中约l 由无精子症引起。非梗阻性无精子症的病因主要是发生在减数分裂阶 段的初级精母细胞发育阻滞，以往临床对这类患者缺乏有效治疗方法。近年来。i c s i 、圆形精子细 胞注射术u i l ds p e m 撕d 蜘e c t i o n ，r o s i ) 、长形精子细胞注射术( c l g a t c ds p e m t i d 嘶t i o n ，e l s d 已获得成功( 1 4 f 6 】。1 e 谩等用阻滞于初级精母细胞阶段的生精细胞在体外培养为精子细胞，显微 注射人卵子内，获妊娠成功产卜，发育正常的双胞胎婴儿。为无精子症和弱精于症患者的治疗提供 了新的方法。 1 1 6 存在的问题与展望 虽然近年来已有精母细胞实现体外完成两次减数分裂的报道”。但目前整个成功率还很低 i i ，”，如体外培养初情期前w i s i a r 人鼠睾丸精曲小管片段3 d ，只有6 2 的减数分裂前期的初级精 母细胞在体外完成两次减数分裂到达精细胞阶段1 2 ”。也有研究表明，体外精于发生的速度比体内快 得多，产生的配子在形态上也有异常2 ”。而要提高体外精子培养的成功率，还有赖丁从分子水平上 深入了解精子发生尤其是减数分裂完成的调控机制。 1 2 精子发生的调控元件 哺乳动物配子发生是研究细胞周期调牡的重要平台。哺乳动物生殖细胞周期包括有丝分裂及减 数分裂，关于其调控基因现已被证明，包括激酶复合物、磷酸酶、调解蛋白及相应的底物。作为生 命周期的重要环节，雄性精子发生过程的分子调控机制近年来已成为生物学领域中一个重要的研究 课题。因此以卜就雄性哺乳动物细胞周期几种关键调控因子进行综述。 西南大学硕+ 学位论文第一章文献综述 哺乳动物配子发生是个十分复杂的过程，既包括有丝分裂义含有减数分裂，因而是研究细胞周 期调节的重要对象。已有的研究表明， m 期促进因子( m p h a p 埘n o t i n gf k t o f ，m p 即是有丝分裂和 减数分裂的关键控制因子1 9 7 1 年m 酗u i ，m a r k c n 首次在青蛙中发现，m p f 作为激活剂引起卵母 细胞g v b d ( g e n 曲lv e s i c l eb r e a l 【d o w n ) 并恢复减数分裂【“，是由催化业基丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶 c d k l ( 周期蛋白依赖性激酶l c ”l i n _ d e p e n d e n tk i n e b 1 ) 以及调节亚基c ”l i nb l ( 周期蛋白b 1 ) 构成的异源二聚体【2 4 l ，物种问具有高度保守性。高等真核生物细胞周期的控制位点在简单有机体中 不存在且细胞的发育及组织起源也有差异。例如，哺乳动物卵母细胞存在唯一的细胞周期控制点： 进入减数分裂的信号与酵母不同，且在减数分裂双线期及mi i 期有停滞。精母细胞也有些相似的控 制位点，只是没有明显的停滞，因此这些控制位点很可能存在与迄今研究的酵母不同的特殊基因调 控因子。 1 2 1 有丝分裂调控位点及调控元件 哺乳动物有丝分裂细胞周期根据转换顺序可以分为四个阶段，包括d n a 合成的s 期、完成有 丝分裂的m 期及两个间期g l 和g 2 期。这些阶段的进行是一系列酶的作用结果，而这些酶的激活 也是被高度控制的。g 1 ，s 及g 2 ，m 转换期的调控位点确保了这些阶段的适时发生。促进有丝分裂进 程的主要酶包括调节弧基周期蛋白c ”l i n 及催化亚基周期依赖蛋白激酶c d l ( ( c y c l i n d 印e n d e m k i l l 髂e ) 。从酵母到人类的多种有机体中c ”l i m 的氨基酸具有同源性，与酵母细胞周期蛋白突变体的 功能互补。高等脊椎动物的c y c l i n s 至少可以分为八个等级，即c ”l i r a c y c l i n h 【”l 。哺乳动物系统 的复杂性不仅是由于c y c l i n s 的等级多，而且a 一、b 及d 型c y c l i i i 家族成员也很复杂。尽管它们在 哺乳动物生殖细胞发育中功能的研究还刚刚开始但是一些实验结果发现在雄性、雌性动物生殖细 胞及去势动物体细胞层中各种c ”1 i n s 表现了不同的表达模式，如1 9 9 6 年c h a p m a n 和w o l g e m u 廿1 实验证明，处于减数分裂期的生殖细胞与未分化的体细胞区别来源丁两种b 删c y c l i m ( c ”l i n b l ，c y c i i n b 2 两r n a 表达时间的筹异怛“。 c d k 是丝氨酸，苏氨酸激酶家旅的成员这些成员具有相同的保守催化区及磷酸化位点。在哺乳 动物细胞中的c d k 最少有9 种，并与不同的c ”l i n 配对。对c y c l i n 的选择可能影响复合物的酶活 性及作f i 底物口”。 有丝分裂细胞周期中，激活信号传导途径的d n a 一旦籀生结构损坏、复制错误或折营错误均可 引起细胞g l s 、g 2 m 及中后期阻滞。日 i 研究发现延长o l s 转变期有两个细胞周期调控点这 两个调控点也作用于c d l ( 2 的活化。晟初是由于c d c 2 5 a 的降解引起c d l c 2 的抑制2 ”。而p 2 1 的p ”依 赖产物则使该转变j l l 继续拖延该产物可结台并阻i pc d l 【2 ，c y c “n e 复合物的活化【。g 2 ，m 期阻滞 是由于阻碍了m p f ( c d k l ，c y c l i n b l ) 的去磷酸化阻i r 蛋白激酶c 1 1 l 【l 的活化可引起c d c 2 5 c 的抑制， 在酵母及人体中都证明c l l i c l 是m p f 抑制的土要机制”m ”j 。纺锤体控制位点的活化发生在中后转变 期，在该点微管接触着丝点并拉伸使染色体适当排列t | 亓才允许细胞进入后期。在缺乏控制位点活化 4 两南人学硕十学位论文第一章文献综述 和蛋白降解的情况f ，纺锤体控制位点的组成部分抑制a p c 活化可使姐妹染色单体分离结求有丝分 裂o ”。 1 2 2 减数分裂的调控 一些实验结果证明减数分裂细胞周期也存在着控制点但这些研究主要是在酵母中进行的。酵 母由于染色体联会不完全及重组而在减数分裂前期的粗线期发生停滞p ”。实验发现减数分裂前期一 旦发生缺陷后细胞将不能进入mi 期，据此可推测哺乳动物可能存在相似的控制点。缺乏重组基因、 d 1 q a 修复基因或细胞周期调控因子基因的雄性小鼠出现前期染色体联会或重组缺陷，最后与酵母结 果不同的是这直接导致了细胞凋亡。而细胞停滞在前期的不同阶段也说明控制点不止一个。1 9 9 9 年 s c h w a r t zd ，g o l d f m g 日n 等通过低水平辐射使初级精母细胞表现为g 2 期延迟而缺乏p ”的初级精 母细胞却没有发生，证明了p ”延迟g 2 期的作用1 3 ”。果蝇实验证明纺锤体控制点可能也在初级精母 细胞减数分裂中活化。用秋水仙素处理或含有不对称同源染色体的初级精母细胞会延迟进入后期p ”。 由于两性配子发生过程存在差异，所以人们推断雄性哺乳动物细胞周期存在特殊的调控物质。 哺乳动物存在两种a 型c y c “m c y c l i n a l 儿乎只存在于雄性动物生殖细胞中而c y c i i i i a 2 却广泛 表达p q 。实验证明c y c l i i l a 2 可以促进g l s 、g 2 ，l 期转变，c y c l i n a 2 缺乏小鼠导致甲期胚胎死亡。 通过c y c l i n a l 基因突变实验证明其对精母细胞进入m l 期有重要作h j 。 通过原位杂交分析及免疫组织化学分析法人们发现，c y c h na l 的m r n a 及蛋白质表达在粗线 期后期急剧升高，而当第一次减数分裂结束时义降低到儿乎消失。所以可推测c y c l i n a l 的表达可能 调控细胞周期p 1 。而c y c l i na 2 的m r n a 与蛋白质表达水平的高峰则出现在处于有丝分裂阶段的生 殖千细胞、精原细胞、前细线期精母细胞及减数分裂前d n a 合成期的细胞p 6 l ，此外c y c l i na 2 还在 s e r l o l i 细胞中表达。在卵巢和卵母细胞中均朱发现c y c l j n a l 的i i l r n a ，不过在成年9 日巢、体细胞及 生殖细胞中发现了c y c l i n a 2 的表达。似乎可以证明c y c l i n a l 在雄性生殖细胞中的特异性表达。 1 9 9 8 年“u n 等将c y c l m a l 基冈定向突变得到c y c i i n a l 缺失小鼠，该鼠精子发生过程停滞住 第一次减数分裂前期而导致不育，且生殖细胞凋亡数趋增多细胞联会消失或畸形c d l 【l 及c ”i i nb l 水平正常，但m p f 明显减少p ”。从而证明了c ”l i n a l 对精母细胞进入第一次减数分裂的重要性。 l i u n 等对c y c i i n a l 缺失小鼠使川o a 结果m p f 恢复活性细胞染色体浓缩并进入减数分裂期， c d c 2 5 蛋白高度磷酸化证明c ”l ma l 是m p f 活化的前提。相反通过钒酸盐抑制0 a ，从而进一步 抑制减数分裂恢复。c d c 2 5 a 及c d c 2 5 c 的表达高峰出现在减数分裂前期蛋白激酶复合物包括c v c l i n a l 及c d k l 或c d k 2 可以使c e c 2 5 a 和c d c 2 5 c 发生磷酸化。上述实验证明在正常的雄性生殖细胞中 c y c l i na 1 参与调控其它蛋白激酶或磷酸酯酶使细胞完成g 2 m 期转变，此外还可能通过激活c d c 2 5 磷酸酶而直接与m p f 扩增相芙联。 5 西南人学硕十学位论文第一章文献综述 2m p f 的研究 2 1m p f 的研究进展 m p f 。即成熟促进因子( n 壕t u 随t i o np m m 嘶n gf a c i o r ) 或m 期促进因子( m p h a 辩p m m o t i l l g 丘i c t 盯) ， 或细胞促分裂因子( 嘶t o s i s _ p m m n n g f h c i o r ) 。m p f 晟早发现并被命名于2 0 世纪7 0 年代初期。近期的 工作不仅逐步鉴定了m p f 的构成，同时也证明了其在细胞周期调控中的重要作用。 1 9 7 0 年，j o h n s o n 和r 将h e l a 细胞同步化，然后将m 期细胞与其他间期细胞在仙台病毒介导下 融合，并继续培养。他们发现，与m 期细胞融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝集。并称之 为染色体超前凝集0 m t i l r ec t i m m o m ec o n d e m a t i o n ，p c c ) 。此种染色体则称为超前凝集染色体。 不同时期的间期细胞与m 期细胞融合，产生的p c c 的形态各不相同。g l 期p c c 为单线状s 期p c c 为 粉末状，g 2 期p c c 为双线染色体状。p c c 的这种形态变化可能与d n a 复制状态有关。染色体超前凝 集在其它细胞中也被证明。m 期细胞可以诱导p c c ，提示在m 期细胞中可能存在一种诱导染色体凝集 的因子，称为细胞促分裂因子p ”。 1 9 7 1 年，m a i 和m a r k e r t 用非洲爪蟾卵做试验，明确提出了m p f 这一概念。非洲爪蟾卵细胞发 育过程可以分为6 个阶段，即第1 、i l 、i i l 、v 和期。第1 至第期为卵母细胞生成和生长阶 段。第期卵母细胞达到一定体积，停j 卜生长，等待成熟。此时的卵母细胞处于第一次减数分裂期 前期阶段，含有一个体积较大的细胞核，称为( g e m i m lv e s i d e ，g v ) 。卵母细胞成熟需要雌性激素孕 酮的刺激。在孕酮作用卜- ，卵母细胞向v 和期转化。生发泡破裂( g vb m k d o w n ，g v b d ) ，染色 体凝集，进行第一次减数分裂；然后立即进行第二次减数分裂并停留在分裂中期，即成熟的卵细 胞( 第期卵细胞) 。卵母细胞受精厉形成受精卵。很快便开始卵裂。m a s u 谛i m a r i 【e nj ；i 解剖方法 分离第期卵母细胞，并_ i j 孕酮进行体外刺激诱导卵母细胞成熟形成卵细胞，再将目日细胞的细 胞质注射到其它卵母细胞中，可以诱导后者成熟：再将日q 被诱导成熟的卵母细胞的少量细胞质注射 到另一些新的卵母细胞中，仍然可以诱导卵母细胞成熟。因而他们认为在成熟卵母细胞的细胞质 中，必然有一种物质可以诱导卵母细胞成熟。他们将这种物质称作促成熟因子即m pf l 。 进一步研究发现仆j 孕酮诱导卵母细胞成熟卵母细胞需要进行一定群度的蛋白质合成。在有 蛋白质合成抑制荆存在的情况f ，孕酮不能诱导目目母细胞成熟。成熟卵母细胞的细胞质诱导卵母细 胞成熟，则不需要蛋向质合成：在蚩n 质合成抑制中m p f 已经存住，只是处】：1 f 活性状态，被称 为前体m p f ( p m p f ) 。1 f 活性态的前体m p f 通过翻译后修饰，可以转化为活性态的m p f 【”】。 m p f 被发现以后不少学者便着手m p f 的纯化j = 作，但一直进展缓慢，直到1 9 8 8 年，才取得突 破性进展。1 9 8 8 年，m a i l e r 实验室的l o h k a 等人以非洲爪蟾为材料，分离获得了微克级的纯化m p 一”1 井证明其主要含有c d l c l ( 周期蛋白依赖性激酶1 ) 手c y c l i nb l ( 周期蛋白b 1 ) 两种蛋白。这两种蛋 白结合后可以使多种蚩向质底物磷酸化毕现蛋白激酶活性。 6 两南大学硕十学位论文第一章文献综述 土1 1 细胞周期蛋白c y c s 的特点及作用 细胞周期蛋白( c y d l i n s ) 的特点包括：周期蛋白具有一段相当保守的氨基酸序列介导周期蛋 白与c d k 结合，称为周期蛋白框；m 期周期蛋向近n 端含有一个由9 个氨基酸构成的特殊序列，参 与泛素介导的周期蛋白a 和b 的降解，称为破坏框 l g l 期周期蛋白不含破坏框，但其c 端有一段特 殊序列与g l 期周期蛋白更新有关；不同的周期蛋白框识别不同的c d k ，形成不同的c y c l j l l s d k 复合物，表现出不同的c d k 活性；周期蛋白浓度随细胞周期进程变化而变化。周期蛋白的作用包 括：激活c d k ，引导c d k 作用丁不同底物：不同的周期蛋白在细胞周期的不同时期表达，并与 不同的c d k 结合，调节不同的c d k 的活性。 2 1 2 细胞周期蛋白依赣性激酶c d k 的结构特点及作用 细胞周期蛋白依赖性激酶( c y c l i n _ d e p d tp r o l e i nk i n m ，c d k ) 的结构特点有；靠近蛋白质n 端 的氨基酸序列为a r p 结合所需，其后是一小段p s l ai r e 结构域( 根据氨基酸单字母代码命名) ，该结构 域参与结合细胞周期蛋白称为周期蛋白结合结构域：具有柔性结构域也称t 环。它可阻挡蚩白质 底物结合位点，抑制蛋白激酶活性也可移到一边暴露底物结合位点使底物磷酸化。只有t 环中某一 特定的苏氨酸残基磷酸化以后周期蛋白激酶才能保持活性状态。有活性的c d k 唯一的功能是使其 他蛋白磷酸化即起到蛋白激酶的作_ j 。 2 1 3 细胞周期蛋白依赖性激酶c d k 活性的调节 c d k 的活性状态直接影响刨细胞刷期的进程，因此影响其活性的冈素对细胞周期运转有1 f 常重 要的影响。 2 1 3 1 细胞周期蛋白的浓度 细胞周期的不同时相中，彳不同的细胞周期蛋白基因被转录。当细胞周期蛋白存在丁胞内时， 它与c d k 结合，导致催化弧基构象发生重人变化。各种c y c l i n s - c d k 复合体的x 射线晶体衍射结构显 示当细胞周期蛋白结合剑c d k 上时，c d k 多肽链易弯曲的环( t i o o p ) 远离酶活性位点的入口，使 c d k 可以活化其它蛋白底物。 2 1 3 2 细胞周期蛋白依赖性激酶的磷酸化状态 细胞周期蛋白与c d k 的结台对c d k 的激活是必需的。但c d k 砸基上关键的苏氨酸残基也必须被 磷酸化，才能虽终激活c d k 。该磷酸化过样需要另一蛋向激酶参与，c d k 激活激酶( c a k ) 。在裂殖酵 两南大学硕 一学位论文第一章文献综述 母细胞中c d k 即c d c 2 分子中1 1 i r l 6 l 的磷酸化使c d c 2 被激活，而1 1 5 残基的磷酸化却抑制该酶的活 性。同时，w e e l 激酶和c d c 2 5 磷酸酶参与此调节过程。w e e l 激酶通过加强抑制磷酸基团使c d c 2 失活。 c d c 2 酶一直保持失活，直到g 2 期末，由c d c 2 5 磷酸酶切除1 1 l r l 5 残基上的磷酸基，使c d c 2 恢复活性。驱动 酵母细胞进入有丝分裂。w 曲l 和c d c 2 5 活性之间的平衡由其他激酶和磷酸酶调控。一系列酶参与调节 c d k 的激活和抑制，可以提供许多靶点，以便来自细胞内外的信息能改变细胞周期的进程。 2 1 3 3 细胞周期蛋白依赣性激酶抑制因子 c d k 的活性可以由各种抑制因子阻断例如在芽殖酵母中，一种称为s i c l 的蛋白作为g l 期c d k 抑制因子。s i c l 的降解使细胞中的c y c y i n s c d k 起动d n a 复制。 2 1 3 4 受调控的蛋白水解 细胞周期蛋白的浓度在每一细胞周期中起伏变化并因此导致c d k 的活性变化。而在细胞周期的 不同时刻，细胞周期蛋白和其它重要蛋白的浓度的变化，是细胞通过调节各种蛋白的合成或分解速 率来完成的。细胞周期中有两类多基复台体参与蛋白质的降解一类为s 1 ( p l - c u l li n f 盒蛋白 ( s c f ) 复合体，另一类是后期促进复合体( a p c ) 。s c f 复台体可能作_ i 于整个细胞周期，介导0 l 期 细胞周期蛋白、c d k 抑制因子和其它周期蛋自的降解。这些需要降解的蛋白首先被调节细胞周期的 激酶磷酸化，为s c f 的结合提供靶点，使s c f 结合而降解蛋白质。s c f 的突变可抑制s c f 介导重要蛋 白降解使细胞周期不能正常进行。如g l 细胞周期蛋白和上述的s i c l 抑制因子若不能水解，则阻l t 细胞复制d n a 。a p c 复合体即后期促进复合体，在有丝分裂期即m 期中起作用，降解许多重要的有 丝分裂蛋白如有丝分裂细胞周期蛋白，使细胞脱离有丝分裂，进入新的细胞周期。此外，泛素蚩白 一蛋白酶体途径( u p p ) 也是调节细胞周期蛋白的土要环竹。首先，泛素是u p p 中介导蛋白质水解的物质， 是一个由7 6 个氨基酸构成的保守蛋向。参与蛋白质多泛素化的酶土要有三种：e l 称作泛素蛋白活化 酶，作川是将泛素蛋白的羧基端与e l 的t 胱氪酸残基通过硫脂键相连激活泛素蛋白。e 2 称为泛素蛋 向缀合酶，作用是将泛素蛋白从e l 转至e 2 。e 3 称作泛素蛋白连接酶也称促后期复合物( a p c ) 作 _ f 是与e 2 一起将泛素蚩白连接剑需要降解的周期蛋白上。使周期蛋白多泛素化，进而被蛋白酶快速 降解。其次a p c 激发e 2 泛素蛋向复合物与有丝分裂细胞周期蛋白n 端的破坏框结合。然后激发泛素 蛋向质同破坏框c 端的赖氨酸残基结合，此过程不断循环使细胞周期蛋白多泛素化。通过基因操作构 建了不含破坏框的细胞周期蛋白结聚这些蛋白质不能降解，说明蛋闩质的泛素化对蛋白质的降解 是必要的。由于a p c 的作用，m 剐周l l j 】蛋白被降解，使细胞退出有丝分裂，进入卜一个周期。与细 胞周期相关的许多蛋白质都是通过泛素调节的过程降解使其浓度出现周期性变化，保证在正确的 时间和空间上执行功能，使细胞周期止常地运转。 西南人学硕十学位论文第一章文献综述 2 2m p f 对卵母细胞减数分裂调控作用的研究 卵母细胞成熟的调控机制是近年来国内外科学工作者研究较多的问题，随着现代分子生物学基 础理论和技术的发展，对于卵母细胞成熟调控机制的研究逐步深入，取得了许多重大成果和突破性 进展。 m p f 对卵母细胞周期的调节机制在无脊椎动物如海星和低等脊椎动物如爪蟾中报道较多，而 在哺乳动物中研究较少。将猪和牛的c o c s ( c u m u l u s 0 0 c y t ec 叩1 e x e s ) 细胞培养于t c m l 9 9 培养基 中，牛卵母细胞共培养2 4 h ，猪卵母细胞共培养4 8 h ，每隔l h 从培养基中取出部分卵母细胞做m p f 和 m a p k 活性检测。m p f 的活性水平通过测定组蛋白h l 激酶的活性来确定，m a p k 的活性水平通过髓 鞘碱性蛋白( m y c l i n b a s i c p r o t e i n ) 来确定。结果是两种卵母细胞在培养过程中m p f 均出现两次高峰， 这两次活性高峰是与两次分裂中期( m e t a p h e s ) 相对应的。猪卵母细胞m p f 活性高峰出现在培养后 2 7 3 2 h 之间和4 6 h 之后牛卵母细胞m p f 活性高峰出现在b 9 h 之间和2 2 h 之后。猪卵母细胞在3 3 - 3 s h 之间、牛卵母细胞在1 9 h 之后出现了短暂的m p f 活性降低，这与后期i ( a p h a i ) 和末期i ( t e l 印l l a i ) 相对应。m a p k 的活性在整个培养过程中逐渐升高，猪卵母细胞在培养4 7 h 后m a p k 活 性达到晟高水平，牛卵母细胞中m a p k 活性晟高值出现在培养2 2 h 后i 蚰l 。郭泽坤等人通过w b s c 锄杂 交检测了小鼠卵母细胞体外成熟过程中c d l c l 磷酸化的变化。h j 抗c d l c l 的c 末端抗体杂交结果显示小 鼠卵母细胞体外成熟过程中c d l 【1 表现为上、中、- 卜二条带，其中中带在4 h 出现井持续增加直到培 养1 6 h ，在2 0 h 有一个下降趋势并在培养2 4 h 义i 亓i 升。用特异性识别c d l c l 去磷酸化的t y r - 1 5 和n * 1 4 的抗c d l c l n 末端抗体杂交，结果证明其中带为c 血l 在b - 1 5 和1 1 * 1 4 上去磷酸化的形式1 4 “。牛卵母细胞 m p f 澈活和m a p k 的激活几乎与g v b d 的同时发生。而在猪的卵母细胞中m a p k 的激活出现在m p f 激活和g v b d 之前l 帅) 。培养朱成年和成年羊卵母细胞，发育至mi j 的卵母细胞比例相似，但未成年 羊发育至m i i 期的卵母细胞由于m p f 水平低不能诱发其它f 日母细胞发生g v b d ，而成年羊则可以1 4 “。 通常认为c y c l i nb l 降解是m p f 失活的直接原闪，但近年来的研究结果对此义提出了一些异议。小鼠 卵母细胞中m p f 的失活以致丁i 发生第一次胚胎有缝分裂不仅仪是w 为细胞周期蛋白b 1 的降解，同 时也受c d k l 去磷酸化的调控【4 ”。卵母细胞离开m 期进入间期的影响冈素很多，近期发现c a m p - p i ( a 通路在周蚶j 蛋白? 降解和向间期转变中发挥着重要作圳一l 。 2 3m p f 对精母细胞减数分裂调控作用的研究 在精子发生过程过程中m p f 的两个程基是细胞生k 的重要调控闪子。2 0 0 0 年g 0 d c t 等通过实 验发现，小鼠睾丸细胞减数分裂g 2 ，m 期的转换与高水平的c y c l i nb l 和c d k l 出现，并进步导致 i | i 的m p f 活性直接相关”。2 0 0 3 年m u r i e l l eg o d e t ，a m ed a m e s f o y 通过使用一种m p f 有效抑制剂 m s c o v i t i n e 第一次实验证明了c d k 与雄性生殖细胞第二次减数分裂的相天性l 拍l 。上述实验说明生 精细胞减数分裂的全过程都离不开m p f 的活化。不过剑现在为l r 还没有证据证明直接抑制m p f 9 西南人学硕士学位论文第一章文献综述 活化会阻断精原细胞g 2 ，m 的转变，囚此不能排除有其他信号通路存在的可能性。 2 4 卵母细胞及精母细胞成熟过程中m p f 与m a p k 的相互关系 除c y c l i 和c d k 之外，还有其它途径同样对细胞周期调控起重要作用，如m a p k ( m 砧g e n a c t i v a t e dp m t e i i ik i n a ，促分裂原活化蛋白激酶) 。自从1 9 9 3 年关于其参与哺乳动物卵母细 胞功能性调节的第一篇报道问世以来，越来越多的人把实验重点放到了m a p k 对动物生殖细胞的调 控作用上。研究证实，m a p k 在卵母细胞成熟、m i i 期停滞、受精后精核转化及原核形成等方面均发 挥重要的作用。在调节微管组装p 去组装和核膜破裂p 重建方面的作用尤为重要即】。一般认为卵母细胞 成熟过程中微管和染色体的行为是由m a p k 而不是m p f 调节的。在小鼠、大鼠和山羊卵母细胞中 m a p k 的激活要比m p f 的激活晚2 个小时，它不参与减数分裂启动，只与微管和染色体的组织变化 有关。而对于一些人动物如猪、牛、马等，m a p k 在g v b d 时被磷酸化而被激活，证明m a p k 在卵母 细胞成熟启动时起着极重要的作用。以前