（生物化学与分子生物学专业论文）nisin发酵条件的优化及代谢调控.pdf

中文摘要 中文摘要 乳链菌肽 n i s i n 是一种天然食品防腐剂 能够抑制许多革兰氏阳性致病菌 的生长 是唯一一种允许商业化生产的天然食品防腐剂 目前 我国只有少数企 业生产n i s i i l 且产量与纯度都远低于国外同类产品 本论文旨在通过优化发酵条 件和代谢调控的手段提高n i s i n 的产量 并通过分析了解n i s i i l 代谢过程的调控机 制 本研究通过从五种乳酸菌发酵培养基中选出c m 培养基作为初始发酵培养进 行优化 在此基础上摸索出了n i s i i l 发酵生产的最适初始p h 值为7 0 最适种量为 3 最佳接种种龄为1 2 h 随后 本研究从营养调控 氨基酸代谢调控和乳酸的反馈调控三种手段对 n i s i l l 的代谢进行了调控 营养调控通过单因素的摸索 决定在c m 培养基的基础上添加玉米浆作为补 充氮源 磷酸二氢钾作为磷源进行发酵 然后利用p l a c k e n b u 册锄试验确定影响 n i s i i l 效价的三个主要因素为蔗糖 酵母膏和磷酸二氢钾的浓度 并使用 b o x b e h n k e n 试验分析方法确定了三个主要因素最佳发酵浓度分别为3 9 9 l l8 5 9 l 和2 0 5 9 l 优化后的培养基发酵生产n i s i n 的效价为16 8 7 士5 提高了 7 4 0 i i m i 氨基酸的调控通过分析得出a r g c y s 唧对n i s i l l 的生产有正调控作用 添 加1 9 l 的这三种氨基酸分别使n i s i n 的效价提高了2 2 4 士5 砌恤l 1 3 q 士5 n m i 1 1 8 士5 i u m l 而1 9 l 的p r o 对n i s 访的合成有负调控作用使n i s i n 效价降低了1 3 8 5 i u m l 三口c d c d 淞肠c 咖在延滞期大量利用游离态的氨基酸 进入对数生长期 后主要利用分解蛋白质产生的氮源 试验证明三口c f d c d c c 淞肠甜括利用的主要靠从周 围环境中吸收船 而不依赖自身合成 在n i s i n 代谢过程中精氨酸的消耗量最大 随a 唱添加量的增加n i s i n 的产量不断增加 但增加幅度降低 当精氨酸添加量高 于8 9 l 时 n i s i n 产量基本不再增长 此时效价增加了4 5 0 i u n 儿 黑龙江大学硕士学位论文 最后本试验研究了乳酸的反馈调控 计算得出发酵过程中蔗糖代谢转化为乳 酸的转化率为8 3 3 经验证 乳酸的抑制作用一方面来自于p h 值的下降 另一 方面来自于乳酸根的累积 通过流加5 mn a o h 控制发酵液p h 值为7 o 左右时 使n i s i l l 发酵产量在优化的培养基的基础上又提高4 2 0 士5 i u m l 而当发酵液中乳 酸根的含量达到7 时n i s i n 停止生产并由此推断出乳酸根的积累是补糖发酵的限 制性因素 经过以上培养条件的优化和代谢调控过程之后 n i s i i l 的效价共提高了近 1 4 l o m n 儿 约为未进行调控时的1 5 倍 关键词 n i s i n 发酵条件 代谢调控 a b s t r a c t a b s t r a c t n i s i i li sal i n do fn a t u r a lf o o dp r e s e r v a t i v en l a ti sa l l o 耽dt 0c o m m e r c i a l i z e d p r o d u c t i o n n i s i nc a i li n h a b i tm o s t0 f 恤伊锄p o s i t i v ep a m o g 商cb a c t e t i a n 盯ea r e 0 1 1 l yaf e wc o m p a n yp r o d u c en i s i ni nc t l i i l ab m t l l eo u t p u ta r l dp u r i 哆a r el o w c r 也a i l f 0 r e i g nc o 嘶e s t h ep u r p l o s co ft l l i sa n i c l ei st 0 删 亿et l l em e t a b o l i cp 帅c e s sa n d r e g u l 撕o nm e c h a 血s mo fn i s i nb y 廿l em e t h o do ff e i m e 觚l t ec o n d i t i o no p t i n l i z a t i o n c mm e d i aw a ss e l e c t e d 鹤o r i g 砌m e 击u m 五的mf i v el a c t i ca c i d eb a c t e r i a 诧舯e n t i o nm e d i 啪si n s 咖d y 0 1 1 l eb 嬲i so f t h i ss t u d y n i s i l lp r o d u 0 no f 也e b e s ti n j t i a p h 砌u eo f7 0 t h e0 p 血 l 蛐锄0 u n to fi 1 1 0 c u l a t i o ni s 3 t h eb e s t i n o c m a t i o na g e 细1 2 hw e r ee x p l o r e d s u b s e q u e n t l y n i s i nm o 乞l b l i s mw a sc o m o l l e db yt l l em e t l l o do fn u t r i t i o n a l m 撕p u l a t i o n 锄i n oa c i dm e 例b o l i cr e g l l l a t i o n 锄d1 a c t i ca c i df e e d b a c kr e g u l a t i o n b y n u t r i t i o n a lm 枷p u l a t i o nm e t l l o d m a i z el i q 试dw a ss e l e c ta si l i 仃d g e ns o u r c e 锄d k h 2 p 0 4a sp h o s p h o n 峪s o u r c et o 佗彻e n t a t i o n 1 1 1 e nb yp l a c k e n b u 咖a nt e s t s t h r e c m a i nf a c t o r sm l p a c to fn i s i l lt i t e ri ss u c r o s e y e a s te x t r a c t 趾dt 1 1 ec o n c e n t r a t i o no f k h 2 p 0 4 b yb o x b e l l l l l e nt e s ta 1 1 a l y s i s 也eb e s tc o n c e i l 们t i o no f 也en e em a i nf a c t o r s f o rf e n n e n t a t i o n e r e3 9 9 l l8 5 9 la n d2 0 5 9 l o p t i 面z a t i o no ft l l em e d j 啪a f i e r f e 肌e m a t i o nn i s i ne 伍c i e n c ya t16 8 7 士5 i u i i l c r e a s e d7 4 0i u n l l 1 1 啪u 曲t 1 1 er e g u l a t i o no f 锄i n oa c i d s a 唱 c y sa 1 1 d1 却h a v ep o s i t i v er e g u l a t i o n o nn i s i l l w h e na d d e d1g la 唱 c y s 锄d1 砷 t l l ep o t e n c yw 嬲i n c r e a s e db y2 2 4 士 5 i u m l 1 3 0 士5 i u 珈 la i l d1 18 士5 砌 札 a n dlg lo fp r on i s i np l a yan e g a t i v er o l e i i lr e g u l a t i o nt 0n i s i np o t e n c y w l l i c hm a k ei tr e d u c eb yl38 士5 i u m i l a l c t o c o c c u s l a c t i si i le 殖e r l s i o no fd e m u l t a g e 疔e eu s eo fal a r g em m l b e ro f 枷n oa c i d s 硫ot 1 1 e 黟o w i i l gn u m b e ro fd e c o m p o s i t i o 玛t 1 1 ei l i t r o g e ns o u r c eo fd e c o m p o s e dp r o t e i i lw a s m a i l l l yu s e d l a c t o c o c c u sl a c t i s t e s t sp r o v e dt l l a tt l l eu s eo fr e l y i n gm a j i l l yo nt 1 1 e s u r r o u n d i n ge n v i r o 舯e n t 丘d mt l l ea b s o 叩t i o ni 1 1t 1 1 ea 唱 r a t h e rm 锄s e l f s y n t h e s i z i n g i i i 黑龙江大学硕士学位论文 c o n s u i i l l 炬o no fa 哂血1 ew 嬲t h el a r g e s ti i lt 1 1 ep r o c e s so fn i s i nm e t a b 0 1 i s m 谢t l lt h e i i l c r e a s eo f 孤翟j 血n e o u t p u t 锄o u n to fn i s i ni 1 1 c r e a s e d b u tt h em t eo fm c r e a s ew a s1 0 矾 w 1 1 e nt l l e 锄 咖o f 盯g i l l i n ew a s8g l p r o d u c t i o no f n i s i l ln ol o n g e ri i l c r e a s e d f i n a l l yf e e d b a c kc o n 昀lo fi a 嘶ca c i d v 嬲s t i l d i e di i lt 1 1 ea n i c l e b yc a l c u l a t h l g c o n v 贫s i o nr a t eo fp r o c e s ss a c c h a r o s e 硫ol a c t i ca c i dm e t a b o l i s mi i lf e m e n 嘶o n 弱 8 3 3 h l et 0t l l ed e c l i l l eo fp h 锄dl a c t i ca c i da c c u m u l a t i o n i i b i t i o n0 c c u r e d f e d e d b y5mn a o h b r o t hp h 啷c o n 仃o la r o u l l d7 0 0 n 也eb a s i so fo p t i i n i 蒯o n f e m e n t 嘶0 n p r o d u c t i o no fn i s i i li 1 1t h em e d i u mr a i s e d4 2 0 士5 i i7 西i m e nc o n t e n to f l a c t i ca c i d 咖ti i lf e r i n e n t a t i o n i 嬲7 p r o d u c t i o no fn i s i i l v a s 咖p p e d 锄di tw a s c o n c l u d e d 也a t 廿l et l l ea c c 啪u l a t i o no fl a c t i ca c i dr o o l tw a st h el i i l l i tf k t o rf o r e q 砌i z h 坞一s u g a rf e 锄e 1 1 t a t i o i l a r e ro 汹i z a t i o nc o n d i t i o n s i l l c r e 鹪e dn e a d y14lo i u m l a b o u t1 5t 油e sf o rn o n r e g u l 撕o n 锄dc o n 仃0 1 1 e yw o r d s n i s i i l f e 衄e m a t i o nc o n d i t i o n m o t a b o l i s hr e 刚a t i o n l v 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得墨蕉婆太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料 学位论文作者签名 二声名况影 签字日期 x 即亨晕 a 2 黾 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑太堂有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本 人授权墨蕉堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存 汇编本学位论文 1 靴做储摊 例聊鹤 穆她 j 7 弋 签字日期 彩庐多月 一2 日签字日期 切口8 年6 月f 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 第1 章前言 1 1nisin 的简介 1 1 1nisin 的发现 第1 章前言 乳酸链球菌素 n i s i n 是从乳品发酵微生物三口c 幻 淞胁m 譬墨驴肠c 出发酵产 物提取制备的一类小分子多肽化合物 这种微生物过去称为勋印肋 卯螂 口c 廊 r o g e r s 和w h i t t i e r 1 9 2 8 最先发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳 性菌的生长 蚴 m a t t i c k 和h i r s c h 1 9 4 4 发现血清学n 群中的一些乳酸链球菌能 产生蛋白类抑菌物质 命名为n i l l h i b i t o 巧s u b s t a i l c e 即n 群抑菌物质 简称为n i s i n 3 1 n i s i l l 才正式命名 1 9 6 9 年 随着第一批商品在英国面世 f a o o 食品添 加剂联合专家委员会批准n i s i n 作为一种生物型防腐剂应用于食品工业 1 9 8 8 年美 国食品和药物管理局 f a d 也正式批准将n i s i n 应用于食品中 1 9 9 0 年3 月2 9 日中国卫生部在g b 2 7 6 卜8 6 中批准n i s i n 可用于罐藏食品 植物蛋白食品 乳制 品 肉制品中 4 迄今为止 n i s i l l 已在全世界约6 0 多个国家和地区被用作防腐 剂 表1 1 n i s i n 在不同国家的使用状况 t h eu s eo fn i s i ni nd i f i e r e n tc o n t r y f o o d i n 讷赫t i 王暑i n p 帅删 j 主m 哪k 砌i i 蚴 r 弘睢l 舶 a u s 姚目囊 眦蜮u m c m 瓜 e u f n 硼t e i 嘶 知k 撕 p r o c e s 3 e dc h e c 基e c h 纪蛹诤牦c e s 枣dd 犍e 姥拉 机e d 啪鼬 档 c b e 髓 e f l c 蛳i o 喇d 话矗鼻臼蒯垤翻擞i 瞌3 4 荫 跏姗嘲e d 薯勺咖嘲弦睁e 哺f 妒 p 眦曩剃d 雠 c h 蹙砖 n b 辆l s 僻m i 鼬d l f 垤 o o n o 酗喝黏 l n o h 憎秘 1 v 酗e a 旺o i d l i bbp 帕如d 疆一即鼎胁b 日弛塘 n o l 蛔k 知日 5 0 0 注 来自a p i i n 和b a r r e t t 公司 f r o ma p l i na n db a r r e t tc o m p a n y 黑龙江大学硕士学位论文 1 1 2nisin 的结构 成熟的n i s i n 分子由3 4 个氨基酸残基组成 分子式为c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 1 5 j 分子 量为3 5 1 0 其n i s i n 分子结构中包含5 种稀有氨基酸即a b a 氨基丁酸 d h a 脱氢丙氨酸 d h b b 一甲基脱氢丙氨酸 a l a s 一刖墉 羊毛硫氨酸 和 a l a s a b a b 一甲基羊毛硫氨酸 它们通过硫醚键形成五个内环 除了这五个 环外 在台联的c 端和n 端的顶端区都有一定的弯曲性 分子高级立体结构中a b c 环在一边 d 和e 环在另一边 形成 绞链区 其活性分子常为二聚体或 四聚体 二聚体分子量为7 0 0 0 四聚体分子量为1 4 0 0 0 n i s i n 的前体肽由5 7 个氨 基酸组成 其中n 端2 3 个残基构成信号肽 信号肽在在细胞表面被太没水解去除 后 释放除成熟的 有生物活性的n i s i l l 经过几十年的研究 人们己发现n i s i n 分子有6 种类型 它们分别是a b c d e f 其中以n i s 姒和n i s i i 亿两种 类型的研究最为活跃 两者的差异仅在于氨基酸顺序上第2 7 位氨基酸的种类不同 州s i i 认是组氨酸 瑚s 而n i s i n z 是天门冬酰胺 a s n n i s i n z 是n s i n a 的天然 变异体 它与n i s i i 认有相同的抗菌活性 但比n i s 姒有更好的扩散性 在p h 值 高于6 的溶液中有更好的溶解度 5 7 1 图l l 乳酸菌素的结构嗍 f i g l ls t 瑚c t u r eo f n i s i n m n 脱氢丙氨酸 d b 一甲基脱氢丙氨酸 a l a 母a i a 羊毛硫氨酸 a i a 母a b a b 一甲基羊毛硫氨酸 1 1 3nisin 形成的分子机制 乳链菌肽生物合成十分复杂 涉及1 1 个基因 9 1 以证s z n i s b 试s t i l i s c 2 第1 章前言 1 1 i s i 1 1 i s p i l i s r i l i s k i l i s f i l i s e 和n i s g 的顺序成簇排列在乳链菌肽 蔗糖转座子左端约1 4 k b 的d n a 片段上 图1 2 其中i l i s z 是编码乳链菌肽前 体的结构基因 1 1 i s i i l i s f l l i s e 和i l i s g 与菌体自身免疫有关 n i s r 和n i s k 是 双组分调节基因 其余是与乳链菌肽成熟有关的基因 依据n i s i i l 生物合成基因的 遗传分析的结果 勾画出了n i s i n 生物合成的模型 l l i s p 将前导序列切除 释放有 活性的n i s i l l 分子 图1 3 n i s i n 的生物合成 首先由胞外的信号激活位于膜上 的组氨酸激酶 由i l i s k 编码 i l i s k 基因自身磷酸化作用之后 转移磷酸基到相 关的调节因子 1 1 i s r n i s r 将前肽分子调节到位于膜上的修饰复合蛋白质 n i s b 和i l i s c 进行修饰 修饰肽与转运蛋白 n i s t 相结合 将修饰肽通过膜的转运 附在膜外表面的1 1 i s p 将前导序列切除 释放有活性的n i s i n 分子 i l 仉1 4 喃 箍西曩卜l 螂i 赫 m 岫t k 啪 一 娃硇鼓 一 虞柚畸 7 坼枷4 粥嗷搿椭猫2 4 j2 由认 膏冀叠 膏鱼魔鼍自 蕾囊爱 图1 2n i s 矗基因簇的结构示意图1 1 习 f i 9 1 2s c h e m a n c 他p 懈蚰t a 6 0 no f t h eo r g a i 翻t i 仰o ft h en i s i ng e n ed u s t 盯 一一 一一v i 工蹬1 3 等引 之目蹬l 一二 r v 酉 p r e p c p l i d c r 图l 3n i s i n 的生物合成模型1 1 5 l f i g l 3b i o s y n t h 髂i sm o d e lo fn i s i 黑龙江大学硕士学位论文 1 1 4nisin 的性质 1 1 4 1nisin 抑菌性 n i s i n 主要抑制大部分g 菌 特别是细菌的芽孢 n i s i n 能抑制葡萄球菌属 链 球菌属 小球菌属和乳杆菌属的某些菌种 抑制大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢 1 6 1 例如能有效抑制肉毒梭状芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 溶血性链球菌 枯草 芽孢杆菌 嗜热脂肪芽孢杆菌等引起的食品腐败 早期的研究认为 n i s i i l 一般对 霉菌 酵母菌和g 一菌是无效的 但近期的研究表明 在一定条件下 如冷冻 加 热 降低p h 和e d t a 处理 一些旷菌 如沙门氏菌 大肠杆菌 假单胞菌等 对n i s i i l 敏感 表l 2 n i s i n 的抑菌谱0 1 7 l t a m e 1 2a n 6 b a c t e r i a is p 钾t r u mo fn i s i n 试验菌株 i d i c a t o rs t r a i n s n i s i n 抑菌圈直径 m m d i a m e t e ro fi n b i b i t i o nz o n e b a c i i l u ss u b t i l i sd b l 0 4 b a c 1 1 u sp u m i l u sa s l 9 4 0 b a c i l l u ss l r a r o t h e m o p h 钉u sc u 2l m i c r o c o c c u sf l a v u sn i c b 816 6 c o d r n e b a 咖耐啪g l u t 锄i c u n 出9 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a 兀 1 1 1a s1 5 5 5 7 l a c t o c o c c u sc a s e ia s1 5 3 9 l a c t o c o c c u sl a c t i sm gl614 i a c t o c o c c u sl a c t i sa t c c l l 4 5 4 l a c t o c o c c u sl a c t i s7 9 6 2 e s c h e r i c h i ac o l id h 5a s a h n o n e l l ae n t e r i l d i sl t 2 s a c c h a r o m y c e sc c r e v i s i a ea s 2l8 2 g e o t r i c h u mc a n d i d u ma s2 10 8 0 抑茵直径d i a m e t e r o f i n b i b i t i o n 趵n e m m 1 0 o 1 5 o 1 5 1 2 0 0 卅 2 0 o 没有抑茸作用 什 卅 一 卅 什 卅 第1 苹前言 n i s i n 对g 菌营养细胞和芽孢有不同的抗菌机理 对营养细胞的抗菌机理的看 法有两种 一种观点认为 n i s i l l 吸附于细胞膜上 可以抑制细胞壁中肽聚糖的生 物合成 使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻 导致细胞内物质外泄 引起细胞裂 解 另一观点认为n i s i n 的抗菌机理与d h a 和d h b 密切相关 1 8 1 因为n i s i l l 中的 d h a 和d 皿能够与敏感菌株细胞膜中某些酶的巯基发生作用 释放细胞质 造 成敏感细胞裂解 n i s i n 对芽孢的作用是在其萌发前期及膨胀期破坏其膜 以抑制 其发芽过程 1 1 4 2n i s i n 的溶解性与稳定性 n i s i n 是一种白色易流动的粉末 使用时需溶于水或液体中 n i s i i l 的溶解度主 要取决于溶液的p h 值 在p h 值较低的情况下 溶解性较好 其溶解度随p h 值的 降低而升高 p h 5 0 时溶解度为4 0 9 6 p h 为2 5 时溶解度为1 2 1 9 1 n i s i n 在中 性和碱性条件下几乎不溶解 所以在应用时 一般先用0 0 2 m 盐酸溶解 再加入 到食品中 n i s 证的稳定性主要取决于温度 p h 值 基质等因素 n i s i n 在酸性条件下呈 现最大的稳定性 随着p h 的升高其稳定性大大降低 在p h 为2 o 或更低的稀盐 酸中 经1 1 5 6 高压灭菌 仍能稳定存在 在p h 为5 时 其活力损失4 0 在p h 为9 8 时其活力损失超过9 0 在一定温度范围内 随着温度的升高 它的活性丧 失增加 当n i s i i l 加入到食品中 则受到介质的保护 一些大分子食物如牛奶 肉 汤等可使其稳定性大大增强 另外 n i s i n 的稳定性还与热处理时间 食品保藏的 温度及时间等有关 2 0 1 1 4 3n is i n 的安全性 n i s i n 对蛋白酶特别敏感 在消化道中很快被旺一胰凝乳蛋白酶分解 它对人体 基本无毒性 也不与医用抗生素产生交叉抗药性 能在肠道中无害的降解 对n i s i n 的毒性 致癌性 存活性 再生性 血液化学 肾功能 应激反应以及动物器官 病毒学等生物学研究证明 n i s i n 是安全的 2 1 9 9 4 年 f a o 阳o 规定其最大 耐受值为3 3 0 0 0 i l j 瓜g 半致死计量为7 9 l g 黑龙江大学硕士学位论文 1 1 4 4nisin 的作用模式 n i s 血抑菌作用机理尚未完全清楚 唯一可以肯定的是n i s i n 的作用位点是敏 感菌株的细胞膜 目前最为合理的学说是 孔道形成模型 该学说认为n i s h l 孔道的形成有 桶板 和 楔入 两种模式 两种模式都认为n i s i n 最初通过一定 程度的经典相互作用于靶细胞膜结合 质子动势的成分增强插入作用 桶板模式 或作为引起插入作用的没接 楔入模式 在两种模式中多个n i s i l l 分子排列在孔 道的周围 n i s i l l 的疏水的侧面朝向脂质双层膜 n i s i l l 的亲水侧面军朝向孔道的内 腔 桶板 模式认为n i s i n 属于通过 桶一板 机制起作用的细胞通道形成蛋白 n i s i n 通过与膜磷脂的静电作用在膜表面聚集 n i s i i l 的出现引起该区域磷脂局部移 位 导致细胞膜明显变薄 n i s i l l 分子以电势依赖方式插入脂质膜 通过多个分子 与膜作用聚集而形成孔道 有直接证据表明n i s i l l 的c 末端插入脂质双层膜的疏 水核心 这与n i s i n 物理化学性质的推论吻合 也有研究认为主要是n i s i n 分子的 c 末端插入脂相 而c 末端部分是造成n i s i n 与目标膜结合的原因 楔入 模式认为n i s i n 担当阴离子载体 1 0 n o p h o r e 孔道的形成是山于与 n i s i l l 分子相结合的脂质双层膜的局部扰动引起的 然后n i s i n 通过p 姗的成分被 引入膜内 形成多n i s i l l 分子的楔形孔 n i s i l l 分子相对于脂质头部基团的方位小 变 因而n i s i n 不与膜的疏水核心相连接 而是n i s i i l 的疏水残基浅浅地插入脂质 体双层膜的外叶 在 楔一孔 模式中 带正电的n i s i n 分子与目标细胞膜上阴性 磷脂间最初的静电相互作用 膜结合和孔道形成所需的相互作用等仍末研究清楚 1 2nisin 的应用 n i s i n 不但在乳制品 灌装食品 酒精饮料中大量应用 在肉制品中的应用也 日趋广泛 引起肉制品腐败的细菌相当多 而且这些细菌多属于耐热性病原菌 普通的加热方式难以将他们杀死 残余的细菌常引起肉制品的腐败 造成肉制品 腐败的大多数细菌 n i s i n 皆能有效抑制 故可用于肉类 鱼类制品的防腐保鲜 延长食品的货架期 与其他盐 鳌合剂 防腐剂复配效果更佳 3 l j 6 第l 章前言 1 2 1 在肉制品中的应用 传统的火腿 熏肉和香肠产生中 普遍使用亚硝酸盐 硝酸盐等发色剂来产 生典型的腌制红色和腌制风味 并抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长 但这些添加剂 同时对人体具有潜在的致癌危险 n i s i i l 能有效控制肉制品中微生物的生长 尤其 是抑制产生毒素的肉毒梭状芽孢杆菌的活性 并且n i s i i l 本身呈酸性 能降低周围 介质的p h 值 因而能降低残留的亚硝酸盐的含量 减少亚硝胺的形成恻 n i s i i l 可作为一种有效的替代物 减少火腿中发色剂的用量 另外 在加工过程中 过 分的热处理会明显改变肉制品的质地及外观 加入n i s i n 后仅需4 5 的热处理即可 延长其贮存期 孔保华等 1 9 9 7 将n i s i n 添加于红肠中可显著降低细菌总数 并 延长产品保存期 3 2 1 袁秋萍 1 9 9 8 等研究表明 在香肠中n i s 洫添加量为0 3 9 k g 绝大多数的革兰氏阳性菌受到抑制 而且产品色 香 味不受影响 猪肉丝中添加 o 4 8 9 k gn i 血 可取代山梨酸钾作防腐剂 并能提高产品质量 罗欣等将n i 妣 首次用于牛肉冷却肉的保鲜p 3 1 还连栋 2 0 0 0 等将n i s 访用于扒鸡的生产 1 7 1 研 究表明 添加n i s i n 可降低杀菌温度 保质期达半年以上 并且使扒鸡的口感得到 改善 1 2 2 在乳制品中的应用 乳制品营养丰富 极易腐败变质 经巴氏灭菌和冷藏可延长保存期 但其中 肉毒梭状芽孢杆菌仍能存活 并产生一定毒素 n i s i n 可用于巴氏灭菌牛奶 添加 量为3 0 5 0 m g k g 通常在3 5 下产品货架期可延长一倍 罐装炼乳中添加8 0 1 0o f i l g k g 的n i s i i l 能减少10 i i l i n 灭菌时间 u h t 奶中添加2o i i l g k g 的n i s i n 能完 全抑制灭菌乳中嗜热细菌芽孢的生长 3 4 1 郭清泉等通过试验证明 添加4 0 i u l l 的n i s i i l 于酸奶中 将酸奶的后酸化推迟了3 天 且菌数保持在1 0 7 个仙以上 而且感官质量良好 3 5 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 3 在罐头制品中的应用 n i s i n 在酸性条件下易溶 稳定 抑菌活力也高 可用于高酸性 p h 4 6 罐头 的保鲜 如西红柿罐头中 添加n i s i n 可防止因耐酸的g 菌群如巴氏梭菌 浸淋 芽孢杆菌引起的腐败 添加量一般为1 0 0 2 0 0 i u g 在低酸性 p h 4 6 罐头如马 铃薯 蘑菇 水果罐头中 即使经高热处理 仍有一些嗜热菌的芽孢幸存 以致 引起罐头的腐败 并且高热处理对食品的感官质量有一定影响 添加适量的n i s i l l 不仅可以有效地抑制芽孢的生长 还可减少罐头的热处理时间 保持其新鲜度 并延长保存期 钱平等采用沸水杀菌和添加n i s i n 相结合的方法 对蔬菜罐头进行 杀菌 结果表明 经过处理的罐头感官特性大为改善 且在室温下贮藏期达到两 年f 3 6 1 2 4 在酱菜中的应用 瓶装酱菜是可供长期贮存的方便食品 瓶装酱菜一般采用巴氏灭菌 残存的 细菌主要为梭状芽孢菌及少数耐热的g 菌 传统的抑制杂菌的方法主要依赖于产 品的高渗透压 高盐 高糖 低氧环境及添加化学防腐剂 目前 各类酱菜中 含盐量偏高 约在1 0 2 0 之间 但高盐食品易诱发高血压等疾病 加入1 0 0 m g k g n i s i n 可抑制杂菌生长 并使盐的浓度下降为7 9 由于一些国家在食品中不准 使用苯甲酸钠 所以n i s i n 用于瓶装酱菜出口 具有现实意义 1 2 5 在酒精饮料中的应用 腐败乳酸菌对n i s i i l 敏感 但酵母几乎不受其影响 因此 n i s i n 可与酵母一 起在生产啤酒 果酒 烈性乙醇等酒精饮料时加入 用来抑制g 菌 啤酒生产中 易受乳杆菌和啤酒片球菌的污染 发生混浊 变酸 发粘等现象 o g d e n 等 1 9 8 5 用平板打孔法检测得出 啤酒常见腐败菌几乎均能被1 0 0 i u i i l ln i s i n 所抑制 3 7 捌 添加n i s i n 的啤酒 可以降低巴氏灭菌的时间和温度 并能延长啤酒 尤其是非巴 氏灭菌和瓶装啤酒的货架期 对照不加n i s i n 的啤酒 存放期延长了一倍的时间 第1 章前言 r a d l e r 1 9 8 1 曾把n i s i i l 应用于白酒酿造中 有效地阻碍了肠膜状明串珠菌 啤 酒片球菌和乳酸杆菌的生长 防止了杂菌的污染 3 9 1 1 2 6 在其它方面应用 n i s i n 也可用于焙烤食品中 以防止蜡状芽孢杆菌生长 用n i s i n 作防腐剂 在制作烤饼的面团中 添加不同浓度的n i s i n 作试验 结果显示 n i s i i l 添加量为 6 2 5 p g g 即可有效地抑制蜡状芽孢杆菌的生长 n i s i i l 还可用于对n i s i l l 不敏感的 微生物发酵过程中 以防止革兰氏阳性菌的污染 如单细胞蛋白 有机酸 氨基 酸和维生素等工业发酵过程h 近年来 新的研究发现证实n i s i n 和万古霉素有 相同的作用位点 特别是以n i s i n 为主要形式的羊毛硫细菌素家族在治疗老鼠葡萄 球菌引起的传染性疾病和人类的痤疮上所取得的成功 致使n i s i n 在医药方面的作 用又重新引起了人们的关注 4 2 1 3nisin 的国内外需求 从产销规模看 1 9 8 8 年全球食品添加剂市场的总产值为1 5 0 亿美元 2 0 0 0 年 增加到1 6 0 亿美元 到2 0 0 3 年 食品添加剂全球销售额达2 0 0 亿美元 与1 9 8 8 年相比 增长了3 3 3 3 在我国 2 0 0 0 2 0 0 4 年间 国内食品工业迅速发展 工业产值年平均增长率在 2 3 左右 食品工业的快速发展 造就了食品防腐添加剂行业的高速发展 目前食 品防腐添加剂已经进入到粮油 肉禽 果蔬加工各领域 包括饮料 调料 酿造 甜食 面食 乳品 营养保健品等各工业部门 并进入了寻常百姓的一日三餐 2 0 0 0 2 0 0 4 年间国内食品添加剂销售额平均增长速度为1 7 1 9 9 8 年国内食品添加 剂产量只有1 3 7 4 万吨 2 0 0 4 年飙升至3 3 4 万吨 国内销售额也从1 9 9 9 年的1 7 0 亿元增长到2 0 0 4 年的3 3 5 亿元 2 0 0 5 年已经达到3 8 0 亿元的规模 而随着国内农 产品深加工的需要 并综合考虑我国食品工业的发展速度 新技术的推动以及消 费者对绿色有机食品消费增加的消费趋势等众多因素的影响 我国食品防腐添加 剂在未来的很长一段时间都还将呈现出快速增长的势头 黑龙江大学硕士学位论文 1 4nisin 发酵生产的研究现状 1 4 1nisin 代谢的动力学模型 n i s i n 的生产是和生长密切相关 它通常发生在整个生长阶段 从新陈代谢的 角度看 n i s i n 通常被认为是基础代谢物 也就是说 产率仅依赖生长率 但即使 n i s i n 的生产和生长相联系 由于许多影响其生产和吸附的因子之间的相互作用 细胞达到最大生物量时并不一定会使n i s i l l 有最大产量 这可通过细菌素积累模型 方程式1 进行说明 y p a y b x 1 式中 y p 和y x 分别指细菌素的产率和菌体的生长率 a 和b 是需要在试验中确定的参数 将 1 式变形 即得 y p a y x b 2 生物代谢可以分为3 类 基础代谢 当b 0 时 细菌素产率仅由菌体生长率所决定 二级代谢 当a o 时 细菌素产率仅由菌体数量所决定 综合代谢 当b o a o 时 细菌素产率由菌体生长率和数量共同决定 4 3 1 对于某些细菌素而言 产率和细胞的生长率确实是呈近似的线性关系的 也 就是说 它们是近似符合基础代谢的 但是 人们观察到 不论是连续生产还是分批 间歇发酵 n i s i n 的产率和细胞的生长的非线性关系非常明显 分批发酵中 菌体 指数生长阶段后期 n i s i n 的合成增加 显然和细胞生长不一致 由于m s 基因在 指数生长初期就有表达 因此n i s i n 产量在生长后期的增长 是基于碳源对n i s i i l 前体修饰基因的表达与活性调节 第1 章前言 1 4 2 培养条件对 sin 发酵的影响 研究发现除n i s i n 产生菌性能 培养基成分 碳源 氮源 磷源和阳离子 发酵条件 时间 p h 温度 搅拌 通风 发酵类型 分批发酵 连续发酵 等许多因素对n i s i n 的生成量均有影响f 4 4 1 杨博等曾以乳酸乳酸球菌 a c 手d c d c c 船j a c 芒如s 帕印 j a c 芒妇 y 一7 2 为研 究材料 令y 一7 2 的发酵培养基在不同的温度下进行发酵 以发酵液o d 值不再增 加为发酵终了的标志 测发酵液的效价 约在3 0 时发酵液效价和菌体产生量均 达最大值 高于此温度 菌体生长量急速下降 发酵液效价也随之下降 原因可 能是因为在高温时菌体产酸快从而抑制了菌体生长 乳链菌肽的合成也受到了抑 制f 4 5 温度达到4 5 时菌体于此温度发酵速度慢且发酵不能生长 乳酸链球菌是同型发酵菌种 在其生长过程中会产生大量的乳酸导致p h 值的 大幅下降 虽然较低的p h 值有利于n i s i n 的合成和从菌体上解离 但高的p h 值 有利于茵体的生长 因此在发酵过程中控制p h 值在 个合理的范围内能过得到最 高的产量 另外 p h 值对n i s i n 的效价也有影响 侯革飞等研究表明n i s i n 的活性与p h 值成反比 但这很可能是由于n i s i n 在水中的溶解度受p h 值的影响引起的 蚓 h i r o s h is h i m i z i l 等将妇f o c o 搬加出和脚e m 叼 c 船撑搬搿妇以凇共同培养 通过 尉z 缈厂d 眇甜的代谢控制发酵p h 值 与流加碱控制p h 值比较得到了更高的n i s i i l 产量1 3 7 1 m l c 加等人提出了一个假设 即真正决定n i s i n 产量的是p h 值的下降 梯度 p h 这个梯度越陡 对生产越有利 生产可以通过将最后稳定的酸性p h 反复 碱化至初始p h 中间的间隔时间大概是6 小时 而使n i s i n 产量翻倍 这个假设在其 用菌株i im l b l 1 3 进行的相关的对比试验中得到了比较吻合的结果 但这个结论 是否对其它菌株也有效 还需要进一步的研究 在决定最优的p h 问题上 大多数认 为p h 应在5 8 6 o 之间对于恒定p h 值生产n i s h l 是合适的 这通常低于最佳生长 p h 但是这个p h 值范围不能推广到所有其他细菌素的生产 比如有几种细菌素的 生产只有在低p h 5 o 处才最佳 这也是随菌株或菌种而定的 而在m l c a b 0 的反 黑龙江大学硕士学位论文 复碱化的生产方法中 起始p h 为6 5 7 5 时 n i s i n 的生物合成达为最大 4 7 1 张秀明等在对上口c 幻 c c 姗 口c 廊n 3 0 2 进行发酵培养时 最佳的接种量为3 最佳发酵时间为2 1 h 但由于菌种间的差异 但由于菌种的差异 不同菌种的代时 和接种量对产量的影响是不同的 1 5 微生物的代谢调控 微生物的代谢可分为初级和次级代谢 为了在生长势头减缓后能维持一定的 碳流 以便一旦条件有利于生长时可以随时恢复生长 细胞将碳流流向次级代谢 产物的合成 这样做也有利于细胞维持其生命活动的要素 如关键蛋白质的周转 的修补和的维护等 初级代谢与细胞生存相关 涉及到产能代谢和耗能代谢 次 级代谢是细胞为了避免在初级代谢过程中某种中间代谢产物积累所造成的不利作 用而产生的一类有利于细胞生存的代谢类型 初级代谢产物如糖衍生物 核苷酸 和脂肪酸等单体以及由它们组成的大分子物质如多糖 核酸和脂类等通常都是细 胞生存不可缺少的物质次级代谢产物不是细胞生存所必需的物质 它们通常被细 胞分泌至胞外 并在同其它生物的生存竞争中起着重要作用 初级代谢是次级代 谢的基础 它为次级代谢产物合成提供所需要的能量和前体物质 4 引 次级代谢是 初级代谢在特定条件下的发展 是为了避免初级代谢过程中某种中间体或产物过 量积累对细胞产生毒害作用或是为了提高细胞相对于其它竞争物种的生存优势 代谢过程调控目的是增加限速步骤的代谢通量 通过研究产物的代谢途径 能得知或预知产物生物合成过程 然后运用遗传操作方法或改变培养环境使流向 产物合成的代谢流增加 从而使产物的产率大幅度提高 同时减少分叉代谢途径 的代谢通量即可以提高目标代谢途径的碳流量 细胞的代谢通量除了直接由胞内 酶决定之外 还间接受到了转录与转译的控制 具体表现在五个不同的水平上转 录水平控制降解翻译水平蛋白质激活或失活异构酶调节 胞内遗传物质或培养环 境因子的变化将导致酶活力或酶量的变化 代谢物浓度也随之改变 这进一步影 响到调节蛋白 致使在转录水平及蛋白组水平发生级联效应 通常认为目标产物 的产率偏低是由于相关酶系或酶级联反应限制了产物的合成能力 尽管与特定产 1 2 一 第l 章前言 物合成途径相匹配的全部酶活性控制着产物的合成速率 但产物的最终产量却是 各种中间代谢物分支点处流量分配的综合结果 细胞内同时进行的数千个生化反 应构成了错综复杂的细胞代谢网