梓醇抑制NADPH氧化酶保护2型糖尿病早期血管内皮功能[权威资料]

梓醇抑制 NADPH 氧化酶保护 2 型糖尿病早期血管内皮功能 本文档格式为 WORD,感谢你的阅读。 ）。另以 10 只健康 Wistar 大鼠作为正常组。正常组、模型组分别给予相当量的生理盐水。 6 周后全自动生化分析仪检测血糖、血脂； ELISA 检测血清 8-异前列腺素 F2 （ 8-iso-PGF2 ）含量；硝酸还原法检测血清一氧化氮（ NO）水平；羟胺法检测血清超氧化物歧化酶（ SOD）含量；观察离体胸主动脉环内皮依赖性血管舒张反应；荧光法检测主动脉组织活性氧（ ROS）的水平； HE 染色观察主动脉病理形态学改变；RT-PCR， western-blot 分别检测主动脉组织 Nox4， p22phox mRNA 及蛋白表达。结果显示梓醇中、高剂量组血管内皮损伤明显减轻，主动脉 ROS 水平降低，血清 NO 水平升高， 8-iso-PGF2 含量减少， SOD 含量升高；主动脉组织 Nox4， p22phox mRNA 及蛋白表达均降低，差异均有统计学意义（ P0.05）。因此梓醇对 T2DM 血管内皮具有保护作用，其机制可能与其下调 Nox4， p22phox 表达，抑制氧化应激反应有关。 关键词 2 型糖 尿病；内皮功能；氧化应激； NADPH 氧化酶 收稿日期 2014-04-03 基金项目 国家自然科学基金项目（ 81300688）；山东省自然科学基金项目（ ZR2009CQ013）；山东省中医药管理局项目（ 2013-237） 通信作者 刘江月，讲师，研究方向为糖尿病血管并发症的防治， E-mail： 近年来我国 T2DM 患病率呈明显上升趋势，糖尿病对人类健康的主要危害不是糖尿病本身，而是各种慢性并发症。动脉粥样硬化（ AS） 是糖尿病致死致残的主要并发症之一，血管内皮细胞损伤和功能障碍是 AS 形成的始动环节。氧化应激是糖尿病血管内皮功能障碍的重要原因之一 1。梓醇是从地黄中提取的环烯醚萜类化合物，是地黄的有效活性成分之一 2。研究表明梓醇具有降血糖、抗肿瘤、保护神经等 3-5多种药理作用。近年来多项研究发现 6-8，梓醇能够通过清除自由基调控凋亡相关蛋白发挥保护心血管系统的功能。目前，关于梓醇是否能够保护糖尿病早期血管内皮功能国内外尚未见报道。本研究通过高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，从氧化应激角度，以 NADPH 氧化酶为靶点，探讨梓醇对糖尿病早期血管内皮功能的保护作用及其可能机制。 1 材料 1.1 动物 雄性 Wistar 大鼠， SPF 级，体重（ 216.8 15.3 ） g，购自青岛市实验动物和动物实验中心，许可证号 SCXK（鲁） 20130010。 1.2 饲料 标准饲料：青岛市实验动物和动物实验中心提供普通大鼠饲料。 高糖高脂饲料：普通大鼠饲料83.25%， 1.5%胆固醇、 0.25%胆酸钠、 10%猪油、 5%蔗糖，由潍坊医学院实验动物中心配制。 1.3 药品与仪器 梓醇对照品购自南京森贝伽生物科技有限公司，链脲佐菌素（ STZ，美国 Sigma 公司）购自上海前尘生物科技有限公司；大鼠 NO， 8-iso-PGF2 ， SOD 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，活体组织氧化应激活性氧（ ROS）初级荧光测定试剂盒（ genmed）， Nox4，p22phox 多隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司， Nox4，p22phox 引物购自上海生工生物工程有限公司，转膜仪（美国Biorad 公司），凝胶成像分析仪（美国 Biorad 公司）， BL-420E 生物机能实验系统、 JH-2 型张力换能器均 购自成都泰盟科技有限公司。 2 方法 2.1 糖尿病模型造模方法及分组 60 只雄性 Wistar 大鼠适应性饲养 1 周后，高糖高脂饮食 1 月后腹腔注射 STZ（ 30 mg kg 灌胃。 10 只健康 Wistar 大鼠作为正常组，标准饲料喂养，正常组和模型组给予相当量的生理盐水灌胃，喂养 6周。观察各组大鼠一般状况，摄食量及体重变化。 2.2 血糖、血脂及血清 8-iso-PGF2 ， SOD， NO 的检测 各组大鼠于最后一次灌胃后，禁食 12 h，不禁水。 10%水合氯醛 300 mL kg， 10 min）， 全自动生化分析仪检测血糖、血脂；硝酸盐还原酶法测定血清 NO 含量， ELISA 试剂盒检测血清 8-iso-PGF2 含量，羟胺法检测 SOD 活性。 2.3 主动脉内皮功能检测 大鼠处死后立刻取出主动脉，置于 Krebs 液中，剥离周围组织后剪成主动脉环，一端固定于水浴槽中，另一端连接张力换能器，通过 BL-420e 生物机能实验系统观察记录血管张力变化，苯肾上腺素（ PE）（ 110 2.4 主动脉 ROS 测定 取小段胸主动脉，研磨组织后，按照 genmed 活体组织氧化应激活性氧（ ROS）初级荧光测定试剂盒操作说明 书检测主动脉 ROS 含量。 2.5 主动脉 HE 染色 取小段胸主动脉， 10%福尔马林固定，石蜡包埋后 5 mm 切片， HE 染色，光镜下观察。 2.6 RT-PCR 法检测主动脉 Nox4， p22phox mRNA 表达 取主动脉组织， Trizol 提取总 RNA，按逆转录试剂盒操作步骤进行 RT 反应，所得 cDNA 在 PCR 仪上进行扩增。 2 L 的cDNA 为模板， -actin 为内参， PCR 反应参数：预变性95 2 min ， 94 变性 30 s， 56 退火 30 s 和 72 延伸 30 s，共 32 个循环， 72 延伸 7 min。 Nox4 上游引物5 -TAGCTGCCCACTTGGTGAACG-3 ，下游引物 5 -TGTAACCATGAGGAACAATACCACC-3 ，扩增长度为 245 bp； p22phox 上游引物 5 -CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3 ，下游引物 5 -TCACACGACCTCATCTGTCAC-3 ，扩增长度为 455 bp。 2.7 Western-blot 法检测主动脉 Nox4， p22phox 蛋白表达 取主动脉组织，提取总蛋白， SDS-PAGE 电泳，转膜后加一抗（ 1500 ） 4 过夜， TBST 漂洗 3 次，加入二抗孵育 1 h， ECL 显影，暗室曝光，图像分析。 2.8 统计学方法 采用 SPSS 18.0 软件进行统计学分析，计量资料以 s 表示，组间采用单因素方差分析，两两比较用 SNK-q 检验， P0.05 为差异有显著性。 3 结果 3.1 各组大鼠一般状况 实验过程中，模型组大鼠死亡2 只，梓醇低剂量组死亡 1 只，正常组和梓醇中、高剂量组均无死亡。随着实验进程正常组和梓醇高剂量组大鼠一般状况好，毛发油亮，反应敏捷，摄水摄食正常，体重稳步增长 ；而模型组和梓醇低剂量组大鼠却每况愈下，毛色暗淡，反应迟钝，甚至部分动物尾部皮肤出现溃烂，摄水摄食量较正常组明显增多，但体重却增长缓慢，梓醇中剂量组大鼠一般状况较正常组和梓醇高剂量组大鼠差，但与模型组相比，上述症状明显改善。 3.2 血糖、血脂及血清 8-iso-PGF2 ， SOD， NO 各组大鼠血糖、血脂比较见表 1。 6 周后模型组及梓醇低剂量组大鼠血糖、血脂水平较正常组均明显升高，与模型组比较梓醇高剂量组血糖、血脂均显著降低（ P0.01），梓醇中剂量组血糖、血脂也显著降低（ P0.05），梓醇中、 高剂量组血糖、血脂水平有显著差异（ P0.05）。各组大鼠血清 8-iso-PGF2 ， SOD， NO 变化见表 2。 6 周后模型组及梓醇低剂量组大鼠血清 8-iso-PGF2 水平较正常组明显升高而 NO 水平及SOD 活性显著降低（ P0.01），与模型组比较梓醇高、中剂量组血清 8-iso-PGF2 水平显著降低而 NO 水平及 SOD 活性明显升高（ P0.05），且 2 组间血清 8-iso-PGF2 ， NO 水平及SOD 活性均有显著差异（ P0.05）。 3.3 主动脉内皮功能检测 各组大鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张反应 见图 1。模型组、梓醇低剂量组大鼠胸主动脉对 ACh 的舒张反应均显著低于正常组（ P0.01），梓醇高、中剂量组大鼠胸主动脉对 ACh 的舒张反应较模型组明显增强，且 2 组间有显著差异（ P0.05）。各组大鼠胸主动脉血管收缩反应见图 2。各组大鼠胸主动脉血管对 PE 呈浓度依赖性收缩，模型组、梓醇低剂量组收缩反应均显著高正常组（ P0.01），梓醇中、高剂量组较模型组明显减弱，且 2 组间有显著差异（ P0.05）。 3.4 主动脉 ROS 测定 各组大鼠主动脉 ROS 含量见图3。模型组、梓醇低剂量组大鼠主动脉 ROS 含量 较对照组大鼠明显降低（ P0.01），与模型相比，梓醇中、高剂量组大鼠主动脉 ROS 含量均显著升高（ P0.05），且两组间有显著差异（ P0.05）。 3.5 主动脉 HE 染色 各组大鼠主动脉壁病理形态改变见图 4。 HE 染色后光镜下观察，正常组大鼠主动脉内膜光滑，内皮细胞完整，平滑肌层排列整齐，模型组、梓醇低剂量组，主动脉内膜连续性破坏明显破坏，内皮细胞体积增大。梓醇中、高剂量组主动脉壁各层细胞排列规则，病变明显减轻。 3.6 RT-PCR 法检测主动脉 Nox4， p22phox mRNA 表达 主动脉 Nox4， p22phox mRNA 表达见图 5。与正常组比较， 模型组、梓醇低、中剂量组大鼠主动脉 Nox4， p22phox mRNA 表达均明显升高（ P0.05）；与模型组比较，梓醇中、高剂量组大鼠主动脉 Nox4， p22phox mRNA 表达均显著降低（ P0.05），且 2 组间有显著差异（ P0.05）。 3.7 Western-blot 法检测主动脉 Nox4， p22phox 蛋白表达 主动脉 Nox4， p22phox 蛋白表达见图 6。与正常组比较，模型组、梓醇低剂量组主动脉 Nox4， p22phox 蛋白表达明显减少（ P0.01）；与模型组比较，梓醇中、高剂量组大鼠主动脉 Nox4， p22phox 蛋白表达均显著增加，且 2 组间有显著差异（ P0.01）。 4 讨论 血管收缩和舒张功能失调是血管内皮损伤和功能障碍的主要表现，是 T2DM 大血管病变的始动环节。高糖、高脂及氧化应激等因素均是导致 T2DM 血管内皮损伤的高危因素。本研究采用高糖高脂饮食联合小剂量 STZ 腹腔注射成功建立了T2DM 大鼠模型， 6 周后 T2DM 大鼠血糖、血脂明显升高出现糖脂代谢紊乱，血清 SOD 活性明显降低， 8-iso-PGF2 含量明显升高，主动脉 ROS 含量明显增加，出现明显的氧化应激反应。胸主动脉血管内皮舒缩功能障碍， HE 染色发现胸主动脉内皮损伤明显。证实了糖脂代谢紊乱及氧化应激对 T2DM 血管内皮损伤的影响。梓醇是地黄的主要活性成分之一，具有降低血糖、保护神经等多种药理学作用。但梓醇对 T2DM 早期血管内皮功能是否具有保护作用国内外未见报道。本研究建立T2DM 大鼠模型的同时给予梓醇干预治疗，研究发现， T2DM 大鼠胸主动脉内皮损伤明显减轻，血管舒缩功能明显改善，血清 NO 水平明显升高，表明梓醇对 2 型糖尿病早期血管内皮功能具有明显的 保护作用。本研究发现梓醇能够显著降低 T2DM大鼠血糖，明显改善血脂代谢紊乱，提示梓醇可能通过降低血糖、调节血脂，保护 T2DM 早期血管内皮功能。 T2DM糖脂代谢紊乱均可引起氧化应激，导致 ROS 过度产生， ROS 不能被及时清除而大量蓄积，造成各组织细胞损伤 11。 ROS 是衡量机体氧化应激水平的主要指标， SOD 则是反映机体抗氧化能力的常用指标， 8-iso-PGF2 主要来源于磷脂中的花生四烯酸，近年来已成为评价体内氧化应激水平的金标准 12。有研究发现梓醇能够减轻糖尿病大鼠氧化应激水平 13。本研究也 发现梓醇干预后 T2DM 大鼠血清 8-iso-PGF2 水平及主动脉 ROS 含量显著降低，而血清 SOD 活性明显升高，说明梓醇可能通过降低糖尿病大鼠体内氧化应激水平保护 T2DM 早期血管内皮功能。 目前认为 NADPH 氧化酶是血管内皮细胞生成 ROS 的主要来源 14，内皮细胞能够通过 NADPH 氧化酶产生的 ROS 来减少 NO 的生成，导致血管内皮功能紊乱 15。 NADPH 氧化酶包含 gp91phox， p22phox， p47phox， p67phox， rac 等 5 个亚组分 16，有研究报道，糖尿病患者几个 NADPH 氧化酶亚基（ p22phox， p47phox， p67phox）表达是升高的 17。 Nox 家族是 gp91phox 的同工酶有 Nox1， Nox2， Nox3， Nox4， Nox5 等成员，其中 Nox4 定位于血管内皮细胞和平滑肌细胞。血管生理学认为， Nox 家族是血管 ROS 的主要来源 18。本研究发现 T2DM 大鼠主动脉 p22phox 和 Nox4 mRNA 及蛋白表达显著升高，梓醇干预后 p22phox 和 Nox4 mRNA 及蛋白表达明显下调，这可能是梓醇能够下调 T2DM 大鼠主动脉 ROS 水平的机制。 综上所述， 本研究首次报道了梓醇对 T2DM 早期血管内皮功能具有保护作用，其机制可能与梓醇改善糖尿病糖脂代谢紊乱，提高机体抗氧化能力，通过下调 p22phox 和 Nox4 mRNA 及蛋白表达减轻糖尿病大血管氧化应激损伤有关。 参考文献 1 Fox C S， Coady S， Soriie P D， et al. 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Catalpol protect diabetic vascular endothelial function by inhibiting NADPH oxidase LIU Jiang-yue （ Department of Pathophysiology of Weifang Medical College， Weifang 261053， China） Abstract The aim of the present study was to evaluate the protective effect of catalpol on vascular endothelial function in STZ-induced type 2 diabetes mellitus （ T2DM） rats. 40 high-fat diet with STZ-induced diabetes rats were randomly divided into model group， catalpol low-dose， middle-dose and high-dose group （ 10， 50， 100 mg kg）， 10 normal Wistar rats were used as the normal group. The normal and model groups were given an equivalent amount of saline. All reagents were administered by oral gavage for 6 weeks. After 6 weeks， blood glucose and lipids were detected by an automatic biochemical analyzer. The endothelium-dependent vasodilation response of thoracic aortar was detected. The pathological changes of the thoracic aorta were observed by HE staining. Serum nitric oxide （ NO）， 8-iso prostaglandin F2 （ 8-iso-PGF2 ） and superoxide dismutase （ SOD） were detected by ELISA. Reactive oxygen species （ ROS） level of thoracic aorta was detected by fluorescence method. The expression of Nox4 and p22phox mRNA and protein in aortic tissue were detected by RT-PCR and Western-blot respectively. After catalpol treatment， endothelial damage