五组利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体青蒿酸.ppt

微生物发酵工程案例教学 第五组 利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体 青蒿酸 微生物发酵工程案例教学 选用这篇文章的原因 符合微生物发酵的主题 且综合分子生物学 微生物学 细胞生物学等学科大部分为我们所学的知识 生化中的甲羟戊酸途径 分子生物学实验手段等等实验思路简单明了 充分体现对知识的灵活运用实验结果影响深刻 将会对疟疾治疗带来一场革命 微生物发酵工程案例教学 一 疟疾 俗称 打摆子 是一种由疟原虫 疟原虫属 Plasmodiumspp 是一类单细胞真核生物 属于细胞内寄生虫 造成的 通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病 微生物发酵工程案例教学 疟原虫的生命周期很复杂 通过蚊子叮咬进入宿主体内後首先侵入肝脏细胞 再由肝脏进入血液感染红血球 在红血球内无性繁殖扩增之後 受外部环境因素的影响 它们可以继续感染新的红血球 也可能形成配子体 gametocyte 当蚊子吸取受感染的血液後 雄 雌配子体进入蚊子胃内发育成配子并进行有性生殖 合子最终在胃壁下形成卵囊 oocyte 卵囊中疟原虫进行无性繁殖 最终形成孢子体 sporozoite 进入蚊子唾液腺 准备感染新的脊椎动物宿主 微生物发酵工程案例教学 疟疾在年发病率不超过十万分之三的中国可能并不为人们关注 但是在非洲 平均每30秒就有一名儿童死于疟疾 世界范围内 仅是呈现临床症状的患者病例每年就在3亿到5亿之间 而每年因患疟疾而死亡的人数则则在一到三百万之间 这其中大部分为儿童 微生物发酵工程案例教学 由于传播疟疾的恶性疟原虫 Plasmodiumfalciparum 具有复杂的生命周期 因而很难根除这种疾病 治疗是唯一的选择 而抗药疟原虫突变系Plasmodiumfalciparum2 3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制 而青蒿素 一种由我国学者在20世纪70年代初从ArtemisiaannuaL 菊科植物 俗称青蒿 中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物 C 15倍半萜 通过释放高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫 是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物 被世界卫生组织称为 治疗疟疾的最大希望 二 青蒿素 微生物发酵工程案例教学 人工合成青蒿素由于其工艺复杂 毒副作用大 成本高而不能投入生产 世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从野生和栽培青蒿中直接提取 但是青蒿中青蒿素的含量很低 0 1 1 w w 且受地域性种植影响较大 目前使用青蒿素进行治疗每个疗程的费用是 美元到 美元 对于受疟疾危害最深的非洲和南美地区的贫困患者来说过于昂贵 微生物发酵工程案例教学 基于这些因素 科学家们开始尝试利用基因工程手段通过微生物去合成这种物质 这项工作被专门列为 青蒿素计划 由美国加利福尼亚大学伯克利分校的生化工程师JayKeasling主持 并且起初就获得 比尔 梅琳达盖茨基金会 4260万美元的资助 2006年 Keasling等宣布 通过合成生物学技术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造 使得后者可以产生高水平的青蒿酸 artemisinicacid 青蒿素的一种直接的前体 该成果发表于2006年4月13日英国 自然 杂志上 题为 Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast 三 基因工程合成青蒿酸 微生物发酵工程案例教学 但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍 而且其培养条件容易控制 不受气候 政治等因素的影响 因此 如果能用酵母生产青蒿酸 那将是非常高产 高效的 真核糖酵解甲羟戊酸途径 真核糖酵解甲羟戊酸途径 酵母与青蒿相比 微生物发酵工程案例教学 研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的 焦磷酸法呢酯 FPP Amorphadiene 合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料 青蒿酸 青蒿素 微生物发酵工程案例教学 由于酵母也可以合成FPP 所以我们所需要做的只是将FPP到Amorphadiene再到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母细胞内 并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控 使之能正常并且大量合成青蒿酸 微生物发酵工程案例教学 为了将流程图转为现实 我们对酵母细胞进行了总共8次的基因工程改造 四具体流程 微生物发酵工程案例教学 第一步 为了能让酵母细胞合成Amorphadiene 我们将ADS基因插入由GAL1启动子控制转录的pRS425质粒中 然后在酵母细胞中表达 结果显示单独转入ADS基因的酵母只合成少量的amorphadiene 如图中菌株EPY201 4 4mg L 微生物发酵工程案例教学 而细胞中与amorphadiene的量最直接相关的就是FPP的量 所以 为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力 我们对FPP合成途径 甲羟戊酸合成途径 进行了总共5次的基因工程改造 几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控 而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控 同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性 所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的 具体过程如下 微生物发酵工程案例教学 首先 将一种截短的水溶性酶3 羟基 3 甲基 戊二酰辅酶A还原酶 我们所学生化书中为译为 羟基 甲基 戊二酰辅酶A还原酶 简称HMGCoA还原酶 又简称tHMGR 是固醇合成的限速酶 过表达 可提高amorphadiene的合成产量近五倍 菌株EPY208 微生物发酵工程案例教学 其次 利用一个methioninerepressible启动子 PMET3 通过对编码鲨稀合酶 固醇生物合成途径中FPP合成后第一步 的ERG9基因进行负调控 可将amorphadiene的合成量再增加两倍 菌株EPY225 微生物发酵工程案例教学 然后 尽管upc2 1 一个可以加强UPC 啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子 活性的半显性突变体等位基因 在已有菌株EPY208背景下过表达 菌株EPY210 对amorphadiene合成的提高起的作用并不显著 但结合对ERG9基因的负调控 其过表达可将amorphadiene的合成量提高到105mg L 菌株EPY213 微生物发酵工程案例教学 再次 在酵母染色体更远处在转进一个tHMGR拷贝可以将将其合成量再增加50 达到149mg L 菌株EPY219 微生物发酵工程案例教学 最后 虽然编码FPP合酶的基因 ERG20 过表达对amorphadiene合成总量 菌株EPY224 的提高效果非常小 但在细胞密度降低的情况下其合成量却可增加10 将所有这些对基因的修饰综合在菌株EPY224上 amorphadiene的合成量已经达到了153mg L 是之前所报道这种倍半萜 烯 最大合成水平的几乎500倍 微生物发酵工程案例教学 现在我们已经得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株 但为能将amorphadiene转变成青蒿酸 我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化amorphadiene转变成青蒿酸的酶的基因 青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物 这些衍生物在菊科植物中普遍存在 是一类十分有特性的细胞次级代谢产物 我们假定菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的合成酶 据此对菊科植物进行了一次基因组比较分析 微生物发酵工程案例教学 进行基因组比较分析之前 我们先接触两个概念 1 细胞色素P450酶细胞色素P450同工酶是血红蛋白超级家族 它是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶 每个细胞色素P450同工酶由一个蛋白质及一个血红素基弥补部分组成 细胞色素P450酶系统催可催化很多反应 包括环氧化反应 N 去烷基化 O 去烷基化 S 氧化及脂肪族和芳香族残基的羟化反应 和所有的酶一样 细胞色素P450同工酶呈饱和Michaelos Meuten动力学 其活性需要辅助因子 并可被诱导或抑制 系统命名 比如 CYP2家族有几个亚家族 诸如CYP2C CYP2D CYP2E 数字代表不同的酶 如CYP2D6 基因同样用CYP2D6表示 不论其来源或催化活性为何 这种命名法的优点是很易识别结构一致或高度相似的细胞色素P450酶 CYP71AV1 微生物发酵工程案例教学 2 已表达序列标志 EST EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5 端和3 端单一次测序获得的短的cDNA部分序列 代表一个完整基因的一小部分 EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库 EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用 EST是在随机选择并经序列分析后分离得到的和 或 进行了特性鉴定的核酸 当确定EST片段的序列时尚不知道由之编码的蛋白质的功能 鉴定EST分子 首先确定部分序列信息并将其储存在数据库中 然后用该序列信息作为探针与数据库中的已知序列数据进行比较 在有些情况下 经过这种同源性检索可以在核苷酸序列水平上揭示出与编码已知功能蛋白质的另一种核酸相关的特定EST序列 最后 选择这样的EST分子并进一步分析之 微生物发酵工程案例教学 进行基因组比较分析的已知条件 知道是一种特异的细胞色素P450酶对amorphadiene进行专一性羟化 先前已经有文章报道 但其基因未知 我们目的就是要找到其编码基因假定菊科植物在半倍萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的合成酶知道菊科植物的已表达序列标志 EST 数据库 由向日葵和莴苣这两种菊科作物提供的基因数据构建 从中检索得到细胞色素P450已表达序列标志 ESTs 拥有针对CYP71和CYP82家族 P450酶在菊科植物中最多的两个家族 其序列已知 高度特异的简并引物 那么怎么通过对已知条件的运用才可以得到青蒿中这种特异的细胞色素P450基因呢 微生物发酵工程案例教学 步骤如下 高度特异的简并引物 青蒿毛状体细胞的互补DNA库 PCR 凝胶电泳回收等 几个特定的p450片段 一个青蒿P450基因片段 与之对应的mRNA 完整P450cDNA CYP71AV1 RT PCR 转录 BLAST分析法将这些片段与向日葵和莴苣的EST 比对 我们惊奇地发现有一个青蒿P450基因片段与来自以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似 微生物发酵工程案例教学 经过BLAST分析筛选出的那个青蒿P450基因片段与来自以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似 氨基酸水平上达相似度达85 88 而同其他非菊科植物的P450序列相似度较低 氨基酸水平上小于50 这表明相对于非菊科植物 P450基因在这三个亲缘关系较远的菊科植物属中是高度保守的 随后相应的完整P450cDNA CYP71AV1 一个编码495个氨基酸的开放阅读框 成功从青蒿中分离获得 微生物发酵工程案例教学 为了保证异源表达的CYP71AV1可以发挥正常功能 协同它进行氧化还原反应的天然配体 NADPH 细胞色素P450氧化还原酶 CPR 同样从青蒿中成功分离 并且其生化活性已经在体外被证实 微生物发酵工程案例教学 1 体内表达GC MS检测 在配体分子CPR的参与下 我们分别在活细胞体内和体外研究了CYP71AV1是否可以催化amorphadiene转变为多级氧化产物 微生物发酵工程案例教学 分析结果显示 几乎95 的这种特异化合物是来源于细胞体的 而且这种化合物的电子碰撞质谱和保留时间与从青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合 微生物发酵工程案例教学 在摇瓶培养条件下 同时表达CYP71AV1和CPR的EPY224菌株青蒿酸产量为32 13mg L 平均数 标准差 n 7 更为重要的是 其中间代谢产物 青蒿醇和青蒿醛在细胞体和培养基中被检测到的量几乎可以忽略 青蒿醇的量比青蒿素酸的5 还少 并且根本没有青蒿醛被检测出 微生物发酵工程案例教学 从啤酒酵母菌株YPH499中分离微体 这些微体仅表达CPR 对照组 或者同时表达CPR和CYP71AV1 将微体在不同的合成途径中间体 amorphadiene 青蒿醇 青蒿醛 条件下进行培养 2 体外酶法检测 微生物发酵工程案例教学 a c 每一种酶的测定分别加入 a 10 Mamorphadiene b 25 M青蒿醇 c 25 M青蒿醛 底物的色谱峰用星号标出 醚提取物经过衍生 并用GC MS在不同的粒子模式下分析 mlz 121 189 204 218 220和248 酶反应的产物按照预期得到 1 青蒿醇 保留时间13 20分钟 2 青蒿醛 保留时间11 79分钟 3 青蒿酸 保留时间13 58分钟 甲酯化后检测 微生物发酵工程案例教学 虽然先前已经有报道 使用青蒿蛋白提取物的体外酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶和一种C11 13双键还原酶 作用于醛 参与青蒿素的生物合成 我们不排除在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶参与的催化反应 但是体外实验中重组的CYP71AV1将amorpha 4 11 diene高效转化为青蒿酸 完全显示出膜结合 多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的关键促成因素 微生物发酵工程案例教学 我们证实 通过用碱性缓冲液 pH为9的Tris HCL缓冲液中添加1 2M的山梨醇 清洗胞体沉淀物 绝大部分合成的青蒿酸 96 可以而被分离出 而且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为2 青蒿酸不仅可以被高效的转移到细胞外 且在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞表面 五 提纯 微生物发酵工程案例教学 利用这个特点制定了一种便捷提纯方法 混合培养物 细胞体沉淀物 碱性清洗缓冲液 凝胶柱层析 纯度大于95 的青蒿酸 HCL调pH 醚抽提 抽提产物 微生物发酵工程案例教学 在一个一升发酵罐中 青蒿酸的产量为115mg 而通这种方法的 我们可以得到76mg的提纯产物 最重要的是 经1Hand13C原子核磁共振检测显示 这种酵母合成青蒿酸与从青蒿中直接提取的青蒿酸分子结构完全一样 因此 可以确定我们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸 微生物发酵工程案例教学 转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相比 总之 转基因酵母菌珠的单位生产效率比青蒿高了近两个数量级 微生物发酵工程案例教学 总的来说 我们采用改造FPP生物合成途径的方法获得了能高水平生产青蒿酸的啤酒酵母菌株 该方法通过表达amorphadiene合成酶 一种新型的细胞色素P450和与之相关的来自青蒿的氧化还原酶来提高FPP的产量 据了解 相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化学方法可能还有许多待改进之处 但微生物法生产青蒿酸是获得此类高效抗疟疾药物切实可行的方法 微生物发酵工程案例教学 六 实验方法 化学和植物材料 青蒿酸标准品购买于ApinChemicals公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取 青蒿植株被栽培在加州大学伯克利分校的温室当中 并且都是从种子开始培育的 2 GC MS法分析Amorphadiene 用GC MS对不同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量进行测定 使用十二烷阻止Amorphadiene的挥发 为了定量衡量Amorphadiene产量水平 用于测定标准曲线的Amorphadiene 90 纯 是通过大肠杆菌菌株发酵制备的 微生物发酵工程案例教学 3 青蒿酸的胞内发酵 纯化及化学分析 将经过预培养的在600nm A600 下吸光度达到0 05的EPY224菌株 已经被转入pESCURA CPR或者pESCURA CPR CYP71AV1 接种到25ml合成培养基中 该培养基不含组氨酸 亮氨酸 甲硫氨酸和尿嘧啶 但是添加有0 2 的葡萄糖 1 8 的半乳糖以及1mMol定量的甲硫氨酸 300C下恒温培养120小时 然后将培养混合物进行离心 留下细胞体 再用50mMTris HCl缓冲液 pH9 0 冲洗细胞体 加入2M的HCl将缓冲液的pH调至2 0 用混入4 烷基苯甲酸 10ug ml 的乙酸乙酯进行萃取 萃取馏分经50ul2M的四甲基硅烷 重氮甲烷和10 的甲醇衍生 在进行GC MS分析前 产物还要经过以 1 1 的醚和戊烷为洗脱剂的凝胶色谱提纯 微生物发酵工程案例教学 最后 提纯的产物经气相色谱质谱仪 70eV AgilentTechnologies 分析 毛细管柱为DB5 0 25毫米内径 0 25 30m J WScientific 气相色谱的加热程序从80 保持2分钟 以每分钟20 的梯度递增到140 产品分离时由5 min的速度增加到220 采用火焰电离色谱检测标准品时为了定量 没有使用相同的气相加热程序对柱子进行净化 微生物发酵工程案例教学 4 发酵及产物的核磁共振分析 使用1升的生物反应器 New BrunswickScientific 在30 的条件下 培养酵母菌93个小时 2 的半乳糖的诱导酵母细胞 600nm下测OD值为1 7 最终的细胞浓度OD值A600达到5 0 搅拌速度从100rmp变到500rmp 每分钟通氧0 5L 使得溶氧量始终保持在40 青蒿酸使用碱洗的方法从细胞沉淀物中提取出来 再使用含有78 的己烷 20 的乙酸乙酯和2 的乙酸的硅胶管柱提纯 分离得到的青蒿酸 纯度大于95 的结构采用CollegeofChemistryNMRFacilityattheUniversityofCalifornia提供的1H和13CNMR500MHz核磁共振仪进行分析 微生物发酵工程案例教学 5 体外酶法测定 用重组质