（食品科学专业论文）大豆分离蛋白水解产物呈鲜味组分的制备及性质研究.pdf

摘要 酱、酱油等大豆发酵食品是具有特殊的鲜昧调味品，不仅鲜味醇厚、持久，而且有提香的作 用。研究己证实，这种鲜味主要来源于原料蛋白质经米曲霉分泌的蛋白酶、肽酶及谷氨酰胺酶的 作用后生成的氨基酸和肽类。 本研究以大豆分离蛋白为原料，以五种蛋白酶为工具酶，通过测定酶解液的性质和感官分析 选择出鲜味较强，苦昧较弱的酶解液，然后进一步分析不同水解度的酶解液与呈鲜强度的关系， 以及酶解产物与肌苷酸( i m p ) 的鲜味协同作用。确定了大豆蛋白酶解液中呈鲜味组分的分子量分 布范围。 实验结果表明，大豆分离蛋白经风味蛋白酶酶解后，在水解度达到4 3 时，可以产生最强的 鲜味；酶解液经超滤分级和葡聚糖s e p h a d e xg 一2 5 凝胶过滤后发现，平均分子量在1 1 1 0d a 的组 分对于呈鲜起了主要的作用，而分子量大于3 0 0 0d a 和小于5 0 0d a 的组分主要呈现苦味和涩味： 呈鲜组分和i m p 间有强烈的鲜味协同作用；将平均分子量为1 1 1 0 d a 呈鲜味组分用反相液谱进行 了分析，确定其中主要有8 种肽组分。 关键词：大豆分离蛋白，酶解，鲜味，感官分析，反相高效液相色谱 a b s t r a c t i th a sb e e ns h o w nt h a ts o y b e a nf e r m e n t a t i o np r o d u c t ss u c ha ss o ys a u c ea n ds o yp a s t ee l i c i tt h e u m a m it a s t em i l d e rt h a nm s g ( m o n o s o d i u mg l u t a m a t e ) ，w h i c hw a sp r e s u m a b l ya t 臼i b u t e dt oa m i n o a c i d sa n dp e p t i d e sh y d r o l y z e db yp r o t e a s e ，p e p t i d a s ea n dg l u t a m i n a s es e c r e t e db y a a p e r y i l l u so r y z a e i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ec o m p a r e dt h et a s t ep r o f i l eo fs o y b e a np r o t e i ni s o l a t ew i t hf i v ed i f f e r e n t p r o t e i n a s e s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sa n du m a m it a s t ew a sd e t e r m i n e d ；t h e a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to ft h em a i nf r a c t i o n se l i c i t i n gu m a m it a s t eo re n h a n c i n gu m a m it a s t ew i t h i m pw a s a n a l y z e d ，a n dt h e f r a c t i o n sw e r es e p a r a t e d ，p u r i f i e db y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h er e s u l ts h o w e dt h a t4 3 o fs o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ( s p i ) w a sh y d r o l y z e db yf l a v o u r z y m e ， p r o d u c i n gt h em o s ti n t e n s eu m a m it a s t e ，w h i c hw a sc o m p o s e do ff r a c t i o n sw i t ha v e r a g em o l e c u l a r w e i g h t1 1 1 0d aa sc h a r a c t e r i z e db yu l t r a f i l t r a t i o na n ds e p h a d e xg - 2 5g e lc h r o m a t o g r a p hy i nc o n t r a s t ， p e p t i d ef r a c t i o n sw i t hm o l c c u l a rw e i g h tm o r et h a n3 0 0 0d aa n dl e s st h a n5 0 0d af o r m e ds i g n i f i c a n t l y b i t t e ra n da s t r i n g e n tt a s t e s o u rr e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h e r ew a ss t r o n gs y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o n b e t w e e ni m pa n ds o y b e a nh y d r o l y s a t e so nt h ec a s eo fu m a m it a s t e a f t e rs e p a r a t e da n ds t u d i e db y h p l c ，t h ef r a c t i o n sw i t ha v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t1 1 1 0d aw a sm a i n l ys e p a r a t e dt oe i g h tp e p t i d e s f r a c t i o n s k e yw o r d ：s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，u m a m i ，s e n s o r ya n a l y s i s , r p h p l c 独创性声明 y 9 3 9 5 3 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 家炎 时间：j 胪年月，j 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中l 雪农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 采炙 时间： 力。g 年月侈日 跏躲锄川镌 帆抽年月佩 中国农业大学硕士学位论文 第章绪论 第一章绪论 1 1 研究目的和意义 鲜味是区别于酸、甜、苦、成四种基本滋味的第五种滋味，对食品的滋味、可口性及可接 受性起着重要的作用( y a m a g u c h i1 9 9 8 ) 。鲜味( u m a m i ) 最早是1 9 0 8 年由日本科学家i k e d a ( 1 9 0 8 ) 命名的，i k e d a 从海带中得到具有鲜味的提取物，并从主体呈味物质中分离出一种单一成分谷氨 酸盐，该盐是这种鲜味的主要来源。鲜味不能由其他四种基本滋味的调配或混合产生。在自然 界中，有三种鲜味物质，分别是谷氨酸钠( m o n o s o d i u mg l u t a m a t em s g ) ，肌苷酸( d i s o d i u m i n o s i n a t ei m p ) ，鸟苷酸( d i s o d i u mg l u a n y l a t eg m p ) 。其中，谷氨酸是许多食物( 动植物) 蛋 白质的主要组成成分，在食品如肉类、水产品、蔬菜、发酵食品中都广泛存在着游离谷氨酸， 对提高食品的风味起着重要的作用( y a m a g u c h i2 0 0 0 ) ：不仅氨基酸类物质，许多寡肽也能产生 类似m s g 的鲜味。 寡肽的风味以及肽对食品风味的影响，一直是人们研究的热门课题，许多研究者在不同的 原料中发现了呈鲜味的寡肽。a r a i 等( 1 9 7 3 ) 合成了一些氮末端含有l - g i u 的寡肽，发现在 n a a 溶液中( p h 毫6 ) g l u - a s p ，g l u - t h r ，g l u - s e r 和g l u - g l u 能产生鲜味if u j i m a k i 等( 1 9 7 3 ) 在经链酶蛋白酶处理的鱼肉蛋白中分离得到了具有肉汤味和非常好的后味的寡肽，研究发现这 些寡肽氮末端都含有谷氨酸；美味肽，l y s g l y a s p g l u g l u - s e r - l e u - a l a ，最早是从木瓜蛋白酶 处理后的牛肉中分离得到( y a m a s a k i1 9 7 8 ) ：不仅在肉、水产制品中存在呈鲜味的寡肽，并且 在大豆发酵食品，如豆酱、酱油等鲜味调味剂中，也发现鲜味主要来源于原料中的蛋白质经曲 霉的蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶的作用后生成的氨基酸和肽类，其鲜昧浓厚，赋予酱油特殊的 调味作用，这些具有鲜味的肽包括g l u - a s p 、g l u s e r 、l - g i u x ( ) ( 代表氨基酸) 等一些低级酸性 肽( n e t t o1 9 9 8 ) 。 多肽的化学结构与其所具有的气味和滋味之间有着紧密的关系( i k e d a2 0 0 2 ) ，不同的氨基 酸组成的多肽呈现出不同的滋味。呈鲜组分中氨基酸的组成是怎样的呢? 研究发现这些呈鲜味 的寡肽中酸性氨基酸和中性氨基酸含量丰富；n a k a t a 等( 1 9 9 5 ) 对合成的5 肽的感官分析发现 肽中的酸性组分和碱性组分对风味的形成和强度起了很重要的作用，而肽的滋味形成主要是酸 性和碱性组分之间的相互作用。这些呈鲜味的寡肽在食品原料蛋白中是否天然存在? 如果存在， 位于原料蛋白质的哪个亚基或肽链上? 目前还没有明确的定论。本研究着眼于酶解大豆蛋白中 的呈鲜组分，并从亚基的角度对呈鲜组分进行定位，这不仅能为水解蛋白调味品的生产和应用 提供理论依据，还能为专用大豆的育种研究提供理论参考，也对今后市场经济下利用大豆种质 资源有重要的实践意义。 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 ，2 国内外研究现状 1 ，乞1 关于鲜昧 鲜味是食品中可溶性成分溶于唾液或食品的溶液作用于鲜味受体在大脑皮质中产生的味 觉，对食品的滋味起着重要的作用，是食品美味的重要因素。大约2 5 0 0 年前，早期的罗马人和 希腊人特别钟情于种盐渍的鱼酱，叫g a m i n ，现在我们知道其中含有大量的谷氨酸盐。在1 9 0 8 年，1 1 【e d a ( 1 9 0 8 ) 在日本皇家大学从海带中发现谷氮酸盐是第五种滋味的主要来源，这种滋味， 不能由其他四种滋味的调配产生，被称为u m a m i 。 除了谷氨酸，其他氨基酸或氨基酸盐的滋味也被进行了报道。如表1 - 1 所示，呈鲜昧氨基 酸或盐有l 谷氨酸钠，l 广谷氨酸，l 天冬氨酸钠，i ，天冬氨酸，l 谷氨酰胺还有l 赖氨酸盐酸 盐，o 蛋氨酸，l 广丝氨酸等。o 丙氨酸属于非必需氨基酸，是血液中含量最多的氨基酸，具有 重要的生理作用，然而它具有甜及鲜味，与其它鲜味剂合用可以增效，可以用于鲜味料中的增 效剂；甘氨酸，是结构最简单的氨基酸，广泛存在于自然界，尤其是在虾、蟹、海胆、鲍鱼等 海产及动物蛋白中含量丰富，是海鲜呈味的主要成分，我国年产量已达3 0 0 0 吨左右：甘氨酸 作为鲜味剂，添加到软饮料、汤料、咸菜及水产制品中可产生出浓厚的甜味并去除咸味、苦味， 与谷氮酸钠同用增加鲜味( 王仲礼2 0 0 3 ) 。氨基酸的滋味已应用于食品的调味和仿制中，例如， 白螃蟹肉是由甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，m s g ，i m p 和盐以不同的比例合成的( 1 ( 0 n o s u1 9 8 7 ) ， 当这些鲜味组成被去除时，蟹肉的特征风味就消失了，可见，鲜味物质对形成许多天然食品的 独特的风味是非常重要的( k u r i h a r a2 0 0 0 ) 。 现在，谷氮酸钠调味料已大量工业化生产，但有报道过量食用谷氨酸钠能引起红细胞减少、 骨骼发育迟缓等内分泌系统及内脏的病变，并且食入大量的谷氨酸钠有引起婴儿脑病的危险； 7 0 年代的“中华餐馆综合症”及鲜味成分和营养成分的单一，口感不够自然成为食品消费的障 碍，尤其不被西方人接受；调昧品的发展经历了基本调味品( 酱油、醋等) 时代，化学调味品 ( 味精、核苷酸等) 时代，和今天的天然营养调味品为主流的时代。天然营养调味品是用纯天 然的物质，如蔬菜、水果、海产品及肉类经萃取、酶分解等方法而得到的，不仅能够满足味觉 上的要求，而且还具有营养和保健的功能，例如：降血压、降血脂等，所以研究开发天然而又营 养的调味品很有现实意义，满足消费者和市场的需求。 2 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 表1 - 1 各种氢基酸的呈昧特性 t a b l e l - 1 t h e t a s t e q u a l i t y o f v a r i o u s a m i n o a c i d s o 丙氨酸 l 天门冬氨酸 l ，天门冬氨酸钠 甘氨酸 l 谷氨酸 l 谷氨酸钠 l 谷氨酰胺 l - 组氧酸 l - 组氨酸盐酸盐 l 异亮氨酸 l 赖氮酸盐酸盐 l 蛋氨酸 l 广苯丙氨酸 k 苏氨酸 l 广色氮酸 l 缬氨酸 l 精氨酸 l 脯氨酸 l 丝氨酸 b 亮氪酸 十+ + + + + 注r + 、+ + 、表示呈味强度+ 呈味性低、+ + 中等、+ + + 强。( 引自武彦文等，2 0 0 1 ) 3 + + 3 瑚 m ； 渤 加 5 如 啪 猢 帅 啪 m 珈 啪 1 2 2 不同食品原料中呈鲜味寡肽的结构特征 在动物发酵食品中也发现了呈鲜味的肽。s e n t a n d r e u 等( 2 0 0 3 ) 通过凝胶过滤层析，从腌制 火腿的水溶提取物中分离得到了分子量小于1 2 0 0 d a 的小分子肽，包括v a l - g l u ，l e u - g l u ，l i e v a l ， g l y g l u ，g l y s e r 等，这些肽和游离氨基酸( l y s ，h i s ，1 3 - a l a ，g l u ，a s p ) 的相互作用构成了腌 制火腿的风味成分：p a p k 等( 2 0 0 2 ) 从v i e t n a m e s e 鱼酱( n u o cr o a m ) 中经过离子交换、超滤 和液谱分析分离得到了1 7 种寡肽，感官分析后发现，g l y - p r o o m g l y ，a s p p h e ，g l u - p h ea n d g l u - m e t p r o 没有呈现任何滋味，v a l - p r o 有甜味，只有一种三肽a s p m e t - p r o 在0 _ 3 的n a c i 溶液中 呈现鲜味。从中我们不难发现，在这些呈鲜味的肽组分中含有大量的亲水性和中性氨基酸残基； n o g u c h i 等( 1 9 7 5 ) 从鱼肉蛋白的链酶蛋白酶酶解产物中也发现了含有大量亲水性氨基酸残基的 酸性寡肽，分别是g l u a s p g l u ，g l u g l y s e r ，g l u g l n - g l u ，s e r - g l u g l u ，经感官分析，这些肽 都具有类似m s g 的鲜味；n a k a t a 等( 1 9 9 5 ) 为了确定8 肽中酸性氨基酸和碱性氨基酸的作用，合 成了5 种肽，分别是s e f _ l e u - a l a - l g l y - a s p - g l u g l u ，s e r - l e u a l a - a s p - g l u g l u u y s - g l y ， l y s g l y - s e r - l e u - a l a - a s p - g l u - g l u ，l y s g l y - a s p - g l u - o h ，g l u g l u - a s p - g l y - l y s ，这五种肽的氨基 酸组成相同而序列不同，发现尽管化学结构不同，这五种肽和其钠盐的鲜味或咸味强度相同，结 果表明，肽中的酸性组分和碱性组分对风味的形成和强度起了很重要的作用，鲜味或威味可由肽 中酸性组分的阴离子和碱性组分的阳离子定位产生。为了进一步说明肽的呈味性，t a m u r a 等 ( 1 9 8 9 ) 合成了酸性片断( a s p g l u g l u ) ，碱性片断( l y s g l y ) ，疏水性片断( s e r - l e u - a l a ) ， 在这三个片断的混合溶液，感官评定发现不含疏水性片断的溶液其鲜味强度比三者的溶液强，推 断疏水性片断只是在酸性和碱性片断之间的隔板，肽的风味形成只是酸性和碱性组分之问的相互 作用；y a m a s a k i 等( 1 9 8 0 ) 从合成的美味肽l y s - g l y - a s p g l u g l u s e l e u - a l a 去掉n 端碱性二肽 l y s g l y 后发现鲜味消失，呈现酸味，进一步说明了碱性组分在肽的里鲜味方面起了重要作用。 不仅在动物食品中，在植物制品。尤其是大豆发酵食品，如豆酱、酱油中也发现了呈鲜组分。 s e u n g - h o 等( 2 0 0 3 ) 对豆酱水溶液提取物通过凝胶过滤层析法分离出的组分进行感官分析和化学 分析发现，鲜味组分中主要含有谷氨酸和天冬氨酸，猜测鲜味主要来源于谷氨酸和天冬氨酸及鲜 味肽；对酱油中的肽组分研究也发现了至少有1 0 种多肽中含有大量的谷氨酸和天冬氢酸 ( y o s h i n o r i1 9 7 2 ) ；h a n i f a h 等( 2 0 0 4 ) 报道在印度酱油的鲜味组分中还含有芳香族游离氨基酸， 如l 广苯丙氨酸和l 赖氨酸，高盐含量时也会产生鲜味，在同一阈值浓度( 1 5r a m ) ，这两种芳 香族氨基酸对m s g a n a c i 混合物的风味强度有非常明显的增强作用；l - p h e 和l - t y r 在0 5m v l 和 1 5 m m 时对混合物的鲜味都有明显的增强作用，但对m s g 和n a c l 的单一溶液的风味无增强作 用综上所述，不管是在动物还是植物制品中，呈鲜肽中酸性氨基酸和中性氨基酸含量丰富，碱 性组分也对风味的形成和强度起了很重要的作用( n a k a t a1 9 9 5 ) 。表l - 2 列出了几种氨基酸的d f 值，肽的疏水值o = e , d f n ，n 表示肽链中氨基酸的个数，疏水值越高，表示肽的疏水性越强，越 趋向于呈现苦味( n e y1 9 7 1 ) 。 4 衰卜2 各种羹基酸的a f 值 t a b l e l - 2z 口f v a l u eo f t h es i d ec h a i no f s o m ea m i n oa c i d s ( 引自s o y ，1 9 7 1 ) 大豆蛋白质是重要的食物蛋白质资源，其必需氨基酸含量接近f a o w h o 的推荐模式，在 其主要组分l l s 和7 s 的氨基酸含量中，谷氨酸和天冬氨酸最多，两者共占4 5 ，尤其谷氨酸 含量更多。我们知道，食物蛋白质的水解是产生肽和氨基酸的有效途径，与酸水解相比酶水解 反应温和，水解产物中不会产生一氯丙醇、二氯丙醇之类的致癌物，应用前景广阔。以大豆蛋 白为原料通过单纯的酶解能否获得原料中天然存在的鲜昧成分，至今尚无定论。 根据文献，从牛肉木瓜蛋白酶酶解产物中分离得到的美味肽( b m p ) 曾引起争议，w a s s c n a a r 等( 1 9 9 5 ) 报道这种8 肽并没有呈现像y a m a s a k i 等( 1 9 7 8 ) 所说的鲜味或其他风味：h a u 等 ( 1 9 9 7 ) 也报道烹调的牛肉或牛肉消化过程中并没有发现8 肽的产生。而且经过感官评定，在 水中，b i v i p 有强烈的酸味和涩味，在牛肉的品尝过程中，不管是加入还是不加盐或谷氨酸钠都 显示没有风味增强作用，推断这种8 肽并不是天然存在的：而在酶解的鸡肉蛋白( m a e h a s h i 等 1 9 9 9 ) 、鱼肉蛋白( f u j i m a k i 等1 9 7 3 ) 都分离得到了呈鲜昧的寡肽，与发酵产品中一致，水解 蛋白中对风味有积极贡献的成分主要是呈鲜昧的氨基酸浴氪酸和天门冬氨酸) 或肽，呈甜味的 氨基酸( 如甘氨酸、丙氨酸等) 或肽对风味的产生也有重要作用( 成坚等2 0 0 3 ) 。 对于大豆蛋白质酶解产物中呈鲜组分的研究很少，主要是因为大豆蛋白质水解后产生很强 的苦味，掩盖了本身含有的鲜味滋味。a r a i 等( 1 9 7 2 ；1 9 7 3 ) 从胃蛋自酶酶解的大豆蛋白酶解 液中，经类蛋白反应除去苦味成分，纯化得到的寡肽中发现了含谷氨酰胺残基的寡肽( o l u a s p ， g h g l u ，g l u s e t ，g i u ，o l y - s e r ) ，它们具有”b r o t h y ”的风味。 综上所述不论在动物食品还是植物制品中，呈鲜味肽的结构特征基本是一致的，但具体 是含儿个氨基酸残基的寡肽还需要具体分析；在酶水解产物中，尤其是大豆蛋白质的水解产物 中提高鲜昧物质的含量，降低苦昧，减少加工工艺也是霈要解决的问题；从分子和亚基的角度 分析呈鲜味组分中主要肽组成及大豆蛋白构成中的定位也是本研究要解决的问题。本研究从呈 味的角度研究了大豆肽，不仅能对用水解蛋白生产和应用水解蛋白调味品提供理论依据，为大 豆肽的产品开发和专用大豆的育种研究提供理论参考，对今后市场经济下高效地利用大豆种质 资源有重要的实践意义。 6 中国农业大学硕士学位论文 第二章呈鲜味大豆蛋白酶解物的制各及其呈味评价 第二章呈鲜昧大豆蛋白酶解物的制备及其呈味评价 2 1 前言 在1 9 0 8 年，l k e d a 从海带汤汁中发现谷氨酸盐是第五种滋味的主要来源，这种滋味，不能由其 他四种滋味的合并产生，被称为鲜味( u m a m i ) 。谷氨酸是许多食物( 动植物) 蛋白质的主要组成 成分( l i n d m a n n2 0 0 0 ) ，大豆蛋白质是重要的食物蛋白质资源，在其主要组分l l s 和7 s 的氨基酸 含量中，谷氨酸和天冬氨酸最多，两者共占4 5 ，尤其谷氨酸含量更多，因此，通过水解作用使 谷氨酸游离，产生大量的谷氨酸和天门冬氨酸获得鲜味，是一种有效而快速的水解方式。 目前工业上主耍采用水解效率高的盐酸作为催化剂来制造水解蛋白( i 、，p ) ，作为鲜昧剂添 加到鲜昧酱油、特鲜酱油、蚝油等调味品中，使产品具有特殊的鲜昧和丰富的滋味( 陈英才2 0 0 1 ) 。 但酸解法要求温度较高( 1 1 0 1 1 3 ) ，反应条件激烈，对设备要求也比较高；更为重要的是， 由于豆粕等原料中残存一定量的植物油脂，在盐酸的作用下水解成脂肪和丙三醇，丙三醇在高温 与浓盐酸发生化学反应生成各种含氯丙醇( c h l o r o y d r i n e ) ，此类物质有一定的毒性，对人体的肝、 肾和神经系统有损害，其中1 ，3 - - - - 氯一2 丙醇( 1 ，3 一d c p ) 和3 一氯1 ，2 一丙二醇( 3 m c p d ) 具有致 癌性( 武彦文2 0 0 1 ) 。 酶法水解是以蛋白酶为催化剂，具有高效、专一、反应条件温和等特点；不会产生氯丙醇 等危害食品安全的成分，因此酶法水解生产植物蛋白是发展的必然趋势。但问题是大豆蛋白酶 解后产生强烈的苦味，掩盖了本身含有的鲜味滋味，目前脱苦方法主要是物理吸附，中和法， 利用类蛋白反应和酶法脱苦( 成坚2 0 0 3 ；唐传核2 0 0 0 ) 。本研究着眼于酶的特性，选择合适的 酶和控制适当的水解度提高鲜昧、降低苦味，因此，本研究从酶的选择和水解度的控制方面来 改善酶解后水解产物中滋味的平衡，使鲜味更突出。 2 2 试验材料 2 2 1 材料及主要试剂 试验原料：大豆分离蛋白( s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ，s p i ) ，哈尔滨大豆高新科技有限公司提 供；碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 活力2 5 a u g ，风味蛋白酶( f l a v o u r z y m e ) 活力为5 0 0 l 廿u g ( l a p u 表示每分钟水解1m m 0 1l 亮氨酸- 对硝基苯胺所需要的酶量) ，复合蛋白酶( p r o t a m e x ) 活力为 1 5 a u g 诺维信公司提供；p r o t e a s em a m i n o 活力5 5 0 0 u g ，日本天野酶制品株式会社提供；苦 丁茶、蔗糖、食盐、味精( 9 9 谷氨酸钠) 和酒石酸，市售。 主要化学试剂：氢氧化钠、水合茚三酮、果糖、n a 2 h p 0 4 1 0h 2 0 、k h 2 p 0 4 、乙醇为北 京化学试剂公司分析纯产品；甘氨酸为s i g m a 公司产。 7 2 2 2 主要仪器设备 名称 酸度计 离心机 恒温磁力搅拌器 万分之一电子天平 千分之一电子天平 水浴恒温磁力搅拌器 循环水式多用真空泵 冷冻干燥机 紫外可见分光光度计 2 3 实验方法 型号 p h s - 3 c t d i ，4 0 b 9 0 1 型 a y 2 2 0 g f - 3 0 0 s i - l i _ a 型 s h b - i f d 1 s p - 2 1 0 0 u v 2 3 1 大豆蛋白酶解液的制备 产地 上海虹宜仪器厂 上海安亭科学仪器厂 上海泸西分析仪器厂 s h i m a d z u j a p a n n d ，j a i a n 金坛市华峰仪器有限公司 郑州市上街华科仪器厂 北京博医糜技术公司 上海光谱仪器有限公司 以哈尔滨大豆高新科技有限公司提供的大豆分离蛋白为底物，分别用风味蛋白酶( a ) 、复 合蛋白酶( b ) 、p r o t c a s em ( c ) 以及风味蛋白酶+ p r d 崦a s em ( d ) 和风味蛋白酶+ 碱性蛋白酶 ( e ) 酶解制备大豆蛋白水解液。将大豆分离蛋白4 0 9 配制成5 的浓度，在8 5 c 预热1 5 分钟 使蛋白部分变性，冷却到酶解温度5 0 u ，添加不同蛋白酶保温水解1 0 h ，各种蛋白酶的酶与底 物比( e s ) 见表2 - 1 。酶解结束后，将酶解液加热到9 0 4 c 并保温1 5r a i n 灭酶，冰水迅速冷却 至室温，离心( 3 0 0 0r p m ，1 5r a i n ) 除去未被完全酶解的部分，然后将上清液冻干，4 储存备 用。 表2 - 15 神蛋白群酶解大豆分离蛋白的蕊解条件 l h b l e2 - it h ec o n d i t i o no f h y d r o l y s i so f s p ih y d r o l y s a t e sh yf i v ed i f f e r e n te n z y m e s 8 中国农业大学硕士学位论文 第二章呈鲜味大豆蛋白酶解物的制鲁及其呈味评价 2 3 2 水解度及游离氨基的测定 参照a d l e r - n i s s e n ( 1 9 8 6 ) 和赵新淮( 1 9 9 4 ) 方法，水解度( d e g m e o f h y d r o l y s i s ，d h ) 表 示蛋白质被酶催化水解的程度，即原料蛋白质中肽键被裂解的百分数。蛋白质全部水解生成游 离氨基酸时d h = 1 0 0 ，没有水解d h = 0 。水解度用下式表示为：d h = ( 1 1 1 - h 。) m 。1 0 0 其中式中h 1 为水解后每克蛋白质被裂解的肽键数( m m o l g ) ，h o 为未水解时每克蛋白质所 含氨基量毫摩尔数( m m o l g ) ，h , o t ：每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数( m m o l g ) ，h b 。对一个特 定的蛋白质来说是一个常数，它可以由组成该蛋白质的氨基酸的含量计算出，例如对于大豆蛋 白h t o t = 7 8 m m o b i g ，h 0 = o 3 3m m o l 幢，所以只要测出水解后蛋白质被裂解的肽键数( h 1 值) 就可 以计算出相应的d h 值。由于每裂解一个肽键就同时新生成一个- n i - 1 2 基和c o o h 基，所以只 要定量的测出蛋白质水解后新生成的- n h 2 基和- c o o h 基的量就可以求得h l 值。 测定蛋白质的n h 2 基和- c o o h 基含量的方法主耍有三硝基苯磺酸( t n b s ) 法、茚三酮法、 甲醛法。常用的是t n b s 法，但该法中所需的试剂在一般的实验室中不太常见，测定时间也较 长，而茚三酮法及甲醛法更为方便。本文利用茚三酮法测定水解蛋白质的n h 2 基含量。 主要试剂： ( 1 ) 茚三酮显色剂( 水合茚三酮o 5 9 、果糖0 3 9 、n a 2 h p 0 4 1 0h 2 01 0g 及k h 2 p 0 46 9 ，定容至 1 0 0m 0 。( 2 ) 4 0 乙醇溶液( 乙醇：水= 加：6 0v v ) ( 3 ) 甘氨酸( 4 ) 标准n a o h 溶液( o 1m o v l ) 。所用 试剂均为分析纯级。 标准曲线的绘制： 取0 1 0 0 0g 干燥过的甘氨酸溶解后定容至1 0 0m l ，取出2 0 0m l 定容至1 0 0m l 得2 0u g m l 的溶液。取此液再分别稀释成含量为2 - 2 0u g m l ( 甘氨酸的分子量为7 5 0 7 ，相当子0 0 2 7 - 0 2 7 u m o f m l 的n h 2 基) 的溶液用于标准曲线绘制。取2 0 0 m l 测定用稀释液于试管中加入1 0 0n 吐 显色剂，混匀后沸水浴中加热1 5r a i n ，同时以2 0 0m l 蒸馏水以同样的方法作空白试验，然后 冷水冷却，加入5 0 0 m 1 4 0 乙醇溶液混匀，放置1 5r a i n 后用l c m 比色杯，以s p 2 1 0 0 u v 紫外 可见分光光度计在5 7 0n m 波长下用空白调零，然后测定样品的吸光值( a ) ，根据吸光度和甘 氩酸的含量制出标准曲线。 根据预实验，取吸光值在标准曲线范围内的大豆水解冻干样品( 约0 0 0 5 9 ) 定容至1 0 0 m l ，取2m l 稀释液于试管中并加入1 0 0m l 显色剂，混匀后置沸水浴中加热1 5r a i n 同时作空白试验 。以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算水解蛋白液中游离氨基( - n h 2 ) 的含l ( u m o l m 1 ) ，凯 氏定氮法测定大豆水解冻干样品中蛋白含量，再根据公式，计算水解度。 d h 2(ii；li；i；!；器一。ssc，”胁。z，占，)+，s c m m 。，s ，。 9 2 3 3 水解物平均肽链长度( a p l ) 的估计 绷, a d l e r - n i s s c n ( 1 9 8 6 ) 和窦君( 2 0 0 4 ) 方法，若一个蛋白质分子未被水解时肽链长度( 即 肽中的氨基酸的平均数目) 为a p l o ，则肽键总数目为a p h - 1 当被切开n 1 个肽键而水解成n 个 肽时， 由于a p i 庐n x a p l 所以 删。! 二! x 1 0 0 a p l o 一1 a p l o 11 一艇x 1 0 0 = 譬堂1 彪。一1， 由于大豆蛋白质的a p l 0 为2 0 0 3 0 0 ( 相应于亚基的分子摄为2 5 0 0 0 4 0 0 0 0 ) ，因此 l - o p l o 水解物平均肽缝长度可估计为； 2 3 4 感官评定 4 兕：l d h 鉴评员的筛选及培讪 实验室内感官分析的评价员与消费者偏爱检验的评价员是两类不同的评价员。前者需要专 门的选择与培训，后者只要求评价员的代表性。 i 鉴评员基本要求：身体健康，不能有任何感觉方面的缺陷；各评价员之间及评价员本人 要有一致的和正常的敏感性；具有从事感官分析的兴趣；个人卫生条件较好，无明显个人气味； 具有所检验产品的专业知识并对所检验的产品无偏见。在感官分析期间，要求评价员具有正常 的生理状态，例如要求评价员不能饥饿或过饱，在检验前1 h 内不抽烟、不吃东西，但可以喝水。 评价员不能使用有气味的化妆品，身体不适时不能参加检验。 敏感性检验常被用于选择与培训评价员。这些方法大致可分为：a ，阈检验：用于确定评 价员的不同的闽值，例如，刺激阈、识别阈、差别阈和最大闽：b ，稀释检验：用于确定可感觉 到的混入食品中的其他物质的最低量。 根据i 和i i 的要求，经过筛选，选定1 0 人作为本次研究的感官鉴评员，鉴评员选定后，除 非有特殊原因，否则不得缺席。 l o 中国农业大学硕士学位论文 第二章呈鲜味大豆蛋白酶解物的制各及其呈昧评价 样品的评定方法 本研究中感官评定具体要求及方法如下： a ，感官分析时给评价员创造一个安静的不受干扰的环境。本研究由于条件的限制，在实验室进 行，感官评定时，室内保持舒适的温度与通风，避免无关的气味污染检验环境，限制音响，其 他人员不得与评价员进行谈话或其他干扰。 b ，感官评定采用一次性塑料杯，所有的样品都用蒸馏水溶解。 c ，样品编码，例如用随机的三位数字或字母编码，并随机地分发给评价员，避免因样品分发次 序的不同影响评价员的判断。为防止产生感官疲劳和适应性，一次评价样品的数目不会过多。 评价样品时一般选择上午或下午的中间时间，因为这时评价员敏感性较高。 本实验采用标度评分检验法，检验时先由评价员分别评价样品指标，然后由检验的组织者按 事先确定的规则( 算术平均值或几何平均值) 在评价员评价的基础上给样品指标打分。数据处理 采用方差分析。( 引白杨荣华2 0 0 3 ；宋钢2 0 0 3 ；孙君社1 9 9 4 ；曹雁平2 0 0 2 ) 感官评定过程 选用苦丁茶、蔗糖、食盐、谷氪酸钠和酒石酸分别作为苦味、甜味、咸味、鲜昧和酸味五 种风味的标准物质。五种基本呈味标准物质配制成不同的浓度( 表2 - 2 ) ，晶尝鉴定。由经过培 训的人员组成评审小组，选定5 人采用评分法进行感官评定。检验前，首先应确定所使用的标 度类型，使鉴评员对每一个评分点所代表的意义有共同的认识，样品的出示顺序可利用拉丁法 随机排列。在室温条件进行评定，将5 种酶解产物分别配成l 的浓度，取2 0m l 盛放在杯中， 5 个样品随机编码( a - d ) 与5 种基本滋味的标准溶液呈放在各鉴评员面前，在感官评定过程 中，要求鉴评员将溶液全部浸入口中，并保持加秒左右的时间，吐出，然后给出分值。评分标 准：5 非常强，4 一强，3 - 标准，2 一弱，1 - 彳目弱，0 一不可鉴别。 表2 - 2 五种基本风味标准物质浓度的配制 t a b l e 2 - 2 t h e t t e t n t e r t s i t yo f s t a n d a r ds u b s t a n c e s f o r f i v e b a s i c t k s 基本风味物质 浓度( g g ) 苦味( 苦丁茶提取液)2 7 5 1 0 。2 2 5 1 0 41 7 5 1 0 41 2 5 1 0 47 5 1 0 5 甜味( 蔗糖) 1 a 1 0 2 1 0 1 0 26 x 1 0 32 1 0 - 31 1 矿 咸味( 食盐)1 1 0 27 5 1 0 。 5 1 0 32 5 1 0 - 31 3 1 0 - 3 鲜味( 9 9 谷氨酸钠)2 7 1 0 。2 0 1 旷1 3 1 0 3 6 7 1 酽2 5 1 0 - 4 酸味( 酒石酸)1 1 0 。7 5 x 1 矿5 1 0 。4 2 ，5 l 矿1 5 1 0 4 分值54 32 1 中国农业大学硕士学位论文第二章呈鲜味大豆蛋白酶解物的制各及其呈味评价 2 3 5 水解液中蛋白质含量的测定一凯氏定氮法 样品的准备 将待测蛋白质于电热鼓风干燥箱中恒重后，准确称取一定量( 1 0m g 左右) 的待测蛋白于 凯氏烧瓶底部，分别往每个凯氏烧瓶中加入3 0 0 m g 催化剂( 硫酸钾：硫酸铜= 5 ：1 ) 和3 m l 的 浓硫酸。空白对照不加待测蛋白。 蛋白质的消化 将准备好的空白对照和待测样品放到电炉上进行消化。先调到低功率挡加热煮沸，首先看 到凯氏瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫，当混合物停止冒泡，酸雾也均匀地放出时，将功 率调大，使液体微沸，直到消化液变成清亮地淡蓝绿色，消化即告完成。为了保证反应的彻底 完成，再继续消化1 小时。消化完毕后从电炉上取下凯氏瓶，冷却至室温。 蒸馏 往5 0 m l 的锥形瓶中加入5 m l 的2 硼酸指示剂混合液，应呈紫红色，用表面皿覆盖备用。 反应室清洗干净后，将消化好的样品完全转移至反应室中，加入4 5 的n a o h 约1 0 m l 左右。 直到反应室的液体由无色变成黑色为止。继续加热蒸馏，锥形瓶溶液由紫红色变成鲜绿色，自 变色起开始计时，蒸馏5 r a i n ，然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管1 ：1 约l c m ，并用少量蒸馏水洗 涤冷凝管口外周，继续蒸馏l m i n 。蒸馏结束后，用表面皿覆盖锥形瓶，待其余样品蒸馏完毕后 一同滴定。 滴定 盐酸的标定：碳酸钠在2 0 0 ( 2 以上恒重后，取0 0 1 s g 于锥形瓶中，加入5 0 m l 蒸馏水，用 0 0 5 的甲基橙做指示剂( 1 滴) ，标定待标定的o o l o o m o l l 盐酸，当溶液由黄变橙时为滴定 终点。 滴定：用标定好的盐酸溶液滴定锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸指示剂混合液由绿色变回淡紫 色，即为滴定终点。 计算公式 1 ) 计算h c l 标准浓度的公式： 。 所2 0 0 0 l h c i2 m n a 2 c 0 3 x v h c t 其中，m na 2 l z 0 3 ：n a 2 c 0 3 摩尔质量；m ；m n h 2 c 0 3 质量：v n c l ：h c i 体积 2 ) 样品中蛋白质含量计算公式 p r o t e i n ；( a - b ) x c a x 1 4 x 6 2 5 1 0 0 1 c x l 0 0 0 其中，a ：滴定样品用去的盐酸的平均体积数；b ：滴定空白样品用去的盐酸的平均体积数 1 2 中国农业大学硕士学位论文第二章呈鲜味大豆蛋白酶解物的制备及其里味评价 c ；称量样品的克数。( 参照国标g b 厂r 5 0 0 9 5 1 9 8 5 ) 2 3 6 风味蛋白酶酶解液呈鲜效果与同等量调味品比较及与i m p 的鲜味协同作用 取一定量的大豆分离蛋白溶于蒸馏水中使底物浓度达到5 ，在8 5 预热1 5 分钟使蛋白部 分变性，冷却到酶解温度5 0 ，加入风味蛋白酶保温水解3 0 ，6 0 ，1 2 0 ，2 4 0 ，3 0 0 ，3 6 0 ，4 8 0 ， 8 4 0 ，1 2 0 0 分钟，加热到9 0 ，1 5 分钟灭酶冷却，3 0 0 0 r p m 离心分离1 5 分钟，上清液冷冻干 燥，4 储存备用。 配制2 种不同的溶液：a ，0 0 5gi m p 的1 0 0m l 溶液：b ，o 0 5g 大豆分离蛋白水解产物的1 0 0m l 溶液，由感官评定确定的鉴评员1 0 入组成感官评定小组，以9 9 谷氮酸钠为标准鲜味物质配成不 同的浓度( 表2 - 3 ) ，分析风味蛋白酶酶解液与i m p 与m s g 呈鲜效果的强弱。 本研究采用递增必选法测阑值( a s t m1 9 9 1 ) ，准确称取不同量( 保留四位有效数字) 的i m p 溶解于1 0 0m l 水溶液中配成不同的浓度，如表2 - 3 。由感官评定确定的鉴评员1 0 人组成感官评定小 组，评定i m p 的识别闽值；然后加入识别闽值下的肽( 感官评定结果；察觉阑值0 0 0 5g l o om l ， 肽来自不同风味蛋白酶酶解时间获得) ，评定混合溶液中i m p 的识别阈值。 为分析肽和i m p 间的鲜味协同效果，配制四种不同的溶液：a ，o 0 2 5gi m p 的5 0m l 溶液； b ，o 0 5g 大豆分离蛋白水解产物的5 0m l 溶液；c 0 0 2 5g i m p 和0 , 0 5g 大豆分离蛋白水解产 物的5 0m l 混合溶液：d ，0 0 2 5gi m p 和0 1g 大豆分离蛋白水解产物的5 0i n l 混合溶液。以谷 氨酸钠为标准鲜味物质配成不同浓度的溶液，由