喹啉双季铵盐与小牛胸腺DNA的作用研究-本科毕业论文

本科毕业论文（设计） 题 目：喹啉双季铵盐与小牛胸腺喹啉双季铵盐与小牛胸腺 DNADNA 的作用的作用研究研究 目目 录录 摘要摘要 . I 关键词关键词 . I Abstract . II Keywords . II 1 绪论绪论 .1 1.1 BZQN 的结构特征及生物效应 . 1 1.2 DNA 的结构特征与生理作用. 2 1.3 本课题的研究方法 . 2 1.4 本课题研究的主要内容、目的及意义 . 3 2 实验部分实验部分 .4 2.1 实验仪器与试剂 . 4 2.2 实验内容 . 5 3 结果与讨论结果与讨论 .7 3.1 BZQN 对 ctDNA 的紫外吸收光谱的影响 . 7 3.2 荧光光谱 . 8 3.3 碱变性实验 . 11 3.4 金属离子对 BZQN 与 DNA 相互作用的影响 . 12 3.5 热变性实验 . 13 3.6 BZQN 对 DNA 的结构影响 . 14 3.7 BZQN 与 DNA 相互作用的焓变 . 15 3.8 分子模拟 . 16 4 结论结论 .17 参考文献参考文献 .18 I 喹啉双季铵盐与小牛胸腺喹啉双季铵盐与小牛胸腺 DNA 的作用的作用研究研究 摘要摘要：本论文采用圆二色谱法、等温滴定量热法、分子模拟、荧光光谱法等方式 研究了喹啉双季铵盐(BZQN)与小牛胸腺 DNA(ctDNA)的相互作用机理及热力学。 研究结果表明， BZQN 具有显著的荧光， 在 340nm 激发， 470nm 发射； 随着 DNA 浓度的增加，BZQN 的荧光发生明显的猝灭，并且猝灭常数（Ksv）随着温度的 升高而增大，符合动态猝灭的特征；紫外可见光谱实验、热变性实验及圆二色谱 结果均表明，BZQN 与 DNA 发生嵌插结合，从而导致 DNA 的二级结构发生改 变；离子选择性实验表明 K+ 使 BZQN-DNA 体系的荧光发生最显著的猝灭；分 子模拟的结果表明，BZQN 可能是以静电作用方式结合在 DNA 大沟附近；等温 滴定量热实验表明 BZQN 与 DNA 的结合位点数约为 4，推测 BZQN 与 DNA 的 结合是熵驱动过程。综合以上实验结果可以推断，BZQN 与 DNA 能发生熵驱动 的相互作用，其作用模式既有嵌插作用又有静电作用，且静电作用占主导。 关键词关键词: : 喹啉双季铵盐；小牛胸腺 DNA；光谱法；等温滴定微量热；分子模拟 II Study on interaction of quinoline biquaternary ammonium salt with calf thymus DNA Abstract: In this paper, the interaction and thermodynamics of quinoline biquaternary ammonium salt (BZQN) with calf thymus deoxyribonucleic (ctDNA) was investigated by circular dichroism (CD), isothermal titration calorimetry (ITC), molecular simulation and fluorescent spectrometry. The results showed BZQN had significant fluorescence at 470nm when it was excited at 340nm. Its fluorescence was quenched by ctDNA and the quenching constant (Ksv) was increased as the temperature rose, which was fitted the characteristics of dynamic fluorescence quenching. The results of UV spectra, thermotropy experiment and CD spectra indicated that the secondary structure of DNA had been changed because of the intercalation effect between BZQN and DNA. The effect of different metal ions on BZQN-DNA showed that the fluorescence of BZQN-DNA was sharply quenched by K+, but other cations had a little influence. The molecular simulation indicated that BZQN was bound to DNA near the big ditch by electrostatic interaction. By means of ITC, the binding point between BZQN and DNA was 4 and the combination process of BZQN and DNA was driven by entropy. So the binding mode of BZQN to DNA both included the intercalation and electrostatic effects, and the electrostatic effect was the dominant. Keywords: Quinoline biquaternary ammonium salt; Calf thymus DNA; Spectroscopy; Isothermal titration calorimetry; Molecular simulation 1 1 绪论绪论 1.1 BZQN 的结构特征及生物效应的结构特征及生物效应 1.1.1 BZQN 的结构特征的结构特征 喹啉是杂环芳香性有机化合物，分子式是 C9H7N，微溶于水，易发生取代 反应， 因此可以在喹啉环的基础上通过修饰母体结构改善水溶性，连接不同的取 代基实现其不同的生物功能。基于此，本论文通过喹啉环上的苄溴取代反应合成 了喹啉双季铵盐（BZQN），其结构如下图所示： (R)-(6-methoxy-quinonine-4-yl)(2S,4S,8R)-8-vinylquinuclidin-2-yl)methanol 1.1.2 BZQN 的的生物效应生物效应 喹啉类化合物属于芳香杂环类化合物， 多种药物及具有药理活性的天然产物 中都存在喹啉结构的骨架，由于其易发生亲电取代反应，可以连接不同的基团形 成不同功能的衍生物， 因此喹啉类化合物在医药及分子生物学等领域都有重要的 应用，尤其在抗疟疾、肿瘤、结核、HIV 病毒等领域具有突出的作用，是药物研 究的一个焦点。 自从 20 世纪 30 年代人类认识到喹啉类化合具有抗疟疾的作用以 来， 对喹啉类化合物的研究从未停止过，孙业欣等人全面综述了近十年来喹啉类 化合物在抗疟方面的研究进展1；冷元红等人对喹啉类及其衍生物的抗疟药物的 合成及推广作了简要介绍，同时阐述了其中几类药物的作用机理2；Hoppe HC 等人通过分子示踪法研究了喹啉药物氯喹和甲氟喹在恶性疟原虫的内吞作用， 分 析发现氯喹抑制血红蛋白消化但没有其他重要影响寄生虫的内吞作用的途径， 而 2 甲氟喹抑制内吞作用效果显著3；刘春亮等人通过小鼠肝癌模型及免疫学实验方 法研究了吡咯喹啉醌的抗肿瘤作用， 结果表明吡咯喹啉醌对靶细胞的杀伤效率很 高， 具有显著的抗肿瘤生长的效果，同时口服给药时能够提高机体的抗肿瘤免疫 功能4；应苗法等人通过动物实验和临床实验均证实了贝达喹啉能够特异性的抑 制结核杆菌的 ATP 合酶发挥作用，对耐药和非耐药的结核杆菌都有效5；霸明 宇等人采用细胞水平模型、酶联免疫吸附法和荧光法研究了 N4-芳基磺酰基喹喔 啉酮类化合物抗 HIV-1 作用机制及特点，结果显示该化合物作用于 HIV-1 复制 的逆转录环节，抑制了逆转录酶的 RNA 依赖 DNA 聚合酶活性，表现出优异的 抗 HIV-1 活性6；李小芳等人采用摩尔电导率、光谱法和热重分析手段研究了镧 -磺基水杨酸-8-羟基喹啉三元配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和真菌黑曲霉 的抑菌活性，结果显示该三元配合物对三种真菌均有非常好的抑菌效果7。 1.2 DNA 的结构特征与生理作用的结构特征与生理作用 参与 DNA 组成的主要有四种碱基即： 腺嘌呤(A)、 鸟嘌呤(G)、 胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)。所有 DNA 中腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔含量相等，即 A=T，鸟嘌呤 与胞嘧啶的摩尔含量相等，即 C=G。DNA 的一级结构是由数量及其庞大的四种 脱氧核糖核苷酸即： 脱氧腺嘌呤核苷酸， 脱氧鸟嘌呤核苷酸， 脱氧胞嘧啶核苷酸， 脱氧胸腺嘧啶核苷酸，通过 3, 5- 磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。 DNA 分子骨架是由反向平行的核苷酸链围绕同一中心相互缠绕，嘌呤和嘧啶碱 位于双螺旋的内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过 3, 5- 磷酸二酯键连接。双 螺旋结构上有两条螺形凹沟，一条较深，一条较浅。较深的沟称大沟，较浅的沟 称小沟。双螺旋的平均直径为 2 nm，碱基堆积距离为 0.34 nm，沿中心轴每旋转 一周有10个核苷酸， 两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键结合在一起8。 DNA 是生物体遗传信息存储和表达的载体，对生物体具有重要的意义9。 1.3 本课题的研究方法本课题的研究方法 圆二色谱法：圆二色谱法：圆二色谱主要是用于研究生物大分子的结构， 通过圆二色光谱 获得生物大分子如蛋白质、 多糖等的二级结构信息， 与分子设计与计算互相验证。 可应用于蛋白质折叠蛋白质构象研究， DNA/RNA 反应， 糖类等光学活性物质 的结构、纯度测量，药物筛选等。研究生物大分子之间的相互作用，大分子与小 3 分子的相互作用，测定分子相互作用后引起的生物大分子结构的变化，进而进行 以生物大分子作为靶点活性物的筛选或者研究药物的作用机制。 分子模拟：分子模拟：利用理论方法与计算技术模拟或仿真分子运动的微观行为，广泛 的应用于计算化学，计算生物学，材料科学领域，小至单个化学分子，大至复杂 生物体系或材料体系。分子模拟不仅避免了繁琐的量子力学方程的求解，而且在 保证精度的同时，大大扩展了原子的计算机模拟的使用范围。在药物设计领域， 可用于研究病毒、药物的作用机理等；在生物科学领域，可用于表征蛋白质的多 级结构与性质； 在药物研究方面通过分析和计算一系列活性药物分子的三维构象 并将其叠合，了解某一类药物分子所应具有的药物构象，这一信息给予新药研究 很大帮助， 药效构象的计算为今后的药效基团方法以及数据库虚拟筛选的方法打 下了基础10-11。 等温滴定量热法：等温滴定量热法：是研究生物热力学与动力学的重要方法，利用高自动化、 高灵敏度的微量量热仪连续、准确地监测、记录一个变化过程的热力学、动力学 曲线。等温滴定量热法具有许多独特优势：对被研究体系的限制条件少，样品用 量小且无损，灵敏度和精确度高，实验时间较短，操作简单。通过测定药物与 DNA 或者 RNA 相互作用， 可以获得生物分子相互作用的完整热力学和动力学参 数12-13。 荧光光谱法荧光光谱法：由于荧光光谱技术具有操作方便，灵敏度高等优点，常用于研 究小分子与核酸相互作用。对于本身具有荧光的物质，其荧光性质是研究它与 DNA 相互作用的关键性质。 当化合物嵌插入 DNA 后， 由于该化合物自身振动模 式受到影响，该化合物的荧光强度通常会有所改变。因此，可以依据荧光强度的 变化推测该化合物与 DNA 作用的程度及机理。对于本身无荧光的化合物则可以 通过溴乙锭竞争实验来研究其与 DNA 的相互作用8。 红红外光谱法：外光谱法：红外光谱法实质上是一种依据分子内部原子间的相对振动、 分 子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法。 将分子吸收红外光 的情况用仪器记录下来，就是红外光谱图，红外光谱图能够显示 DNA 分子中的 主链骨架、特征振动谱带以及侧链在 2000-500nm 范围振动谱带等，可以依据 DNA 在加入化合物前后红外图谱的变化来推测该化合物与 DNA 的相互作用8。 1.4 本课题研究的主要内容、目的及意义本课题研究的主要内容、目的及意义 4 DNA 是生物的基本遗传物质， 是遗传信息的载体， 是基因表达的物质基础， 因此 DNA 也是很多类药物的重要靶点。 DNA 与药物分子相互作用的研究对药物 的设计合成、结构改造及相关的作用机制研究具有重要的意义。喹啉类化合物是 一类在医药等领域有着广泛应用的芳香杂环化合物， 有关此类化合物的合成及应 用近年来受到人们的广泛关注。因此，我们在合成喹啉环的基础上通过修饰喹啉 的母体结构，连接不同功能的取代基来实现其不同的生物能，本论文对新合成的 喹啉双季铵盐化合物通过紫外、荧光、圆二色谱、等温滴定量热、分子模拟等方 式进行结构鉴定和表征，并进一步探讨其与 DNA 间的相互作用。 2 实验部分实验部分 2.1 实验仪器与试剂实验仪器与试剂 2.1.1 实验仪器实验仪器 本实验所用实验仪器如表 1 所示： 表表 1 实验仪器实验仪器 仪器 型号 产地 瞬态荧光分析仪 FLS920 英国爱丁堡仪器有限公司 双光束紫外可见分光光度计 T-1901 北京普析通用仪器有限责任公司 圆二色谱仪 Chirascan 英国应用光物理公司 等温滴定量热仪 Nano 美国 TA 公司 傅立叶红外光谱仪 Nicolet-380 美国尼高力公司 2.1.2 实验试剂实验试剂 本实验所用实验试剂如表 2 所示： 表表 2 实验实验试剂试剂 药品 类型 产地 ctDNA BR sigma 公司 喹啉双季铵盐 曾林涛老师馈赠 磷酸二氢钠 AR 天津市天力化学试剂有限公司 磷酸氢二钠 AR 天津市天力化学试剂有限公司 5 2.2 实验内容实验内容 2.2.1 圆二色谱圆二色谱 DNA 是光学活性物质，因此可测定它的圆二色谱，从而了解其构象。实验 所用仪器为 Chirascan 圆二色谱仪，光源系统用氮气保护(流量为 5 L/min)，样品 池的光径为 0.5 mm。测量参数：扫描速率 100 nmmin-1 ，分辨率 0.1 nm，响应 时间 1 s，累积次数 3 次。扫描波段为 200320 nm，DNA 的浓度为 0.3 g/L。 实验时在样品池中放置 90 L 2.17 10-5 mol/L 的 DNA 溶液， 加入 9 L 1.13 10-3 mol/L BZQN 溶液，测溶液的 CD 谱。 2.2.2 分子模拟分子模拟 本实验采用 SYBYL 8.1 软件， SYBYL 是美国 Tripos 公司为从事药物及相关 领域研究的用户提供的全面的药物设计工具， 是目前药物设计方面的权威工具软 件。在 SYBYL-X 软件包中有着当今最先进、最现代的同源建模技术与工作流， 同源蛋白识别、 从序列预测结构与功能、 配体结合位点分析以及3D 建模技术等， 用来解决诸如生物大分子建模以及生物信息学分析之类的结构生物学设计任务。 不论是进行配体 - 受体的相互作用的理论计算，还是依据生物大分子的结构设 计新配体，都是把配体对接到受体的结合部位去，形成配体 - 受体复合物，这 个过程即为分子对接11。在进行分子对接时，首先是以已知配体 5-乙氧羰基-6- 甲基-4-4-甲氧基苄基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(EMMD)与受体 ctDNA 的晶体结构 为基础，计算受体 ctDNA 结合部位的表面性质；然后删去原来的配体 EMMD， 计算用于分子对接的新配体 BZQN 的各表面性质，然后依据互补匹配原则，将 配体 BZQN 对接到受体 ctDNA 的结合部位上去。 2.2.3 等温滴定等温滴定微微量热量热 BZQN 与 DNA 作用的热力学焓变由美国 TA 公司的 Nano ITC3G采用连续注 射的方法完成，用仪器自带 Nano ITC Analyze 软件进行数据采集和处理。具体 实验过程为：将 250 L 1.13 10-4 mol/L 的 BZQN 溶液装入 250 L 滴定针，设 定总的滴定次数为25次， 每次滴 10 L于1.00 mL 2.17 10-5 mol /L DNA溶液中； 连续滴定时间间隔为 300 s，每次滴定持续时间为 2 s。2 次滴定实验的时间间隔 大约 45min，使信号有足够的时间返回基线。测量池的温度控制为 25 oC，安培 6 瓶中搅拌器的转速固定在 350 r/min，等基线稳定后再启动实验，以便使因搅拌 而产生的热量被自动扣除。 为扣除 BZQN 和 DNA 的稀释热， 要进行空白实验。 2.2.4 紫外光谱紫外光谱实验实验 小牛胸腺 DNA 用 PBS 稀释，采用文献所述方法14，将 0.01 g/L ctDNA 在 紫外吸收光谱 260 nm 处，根据文献中摩尔吸收系数 2606600 L mol-1 cm-1， 可以确定其浓度为 2.2 10-5 mol/L，溶液保存于 4 C 的冰箱中备用。 取 2 mL 2.17 10-5 mol/L ctDNA 溶液于比色皿中，相应的试剂 PBS 做参比， 测试溶液紫外吸收强度做空白对照，加入 5 L 7.5 10-1 g/L BZQN 溶液，测试溶 液紫外吸收强度，重复 10 次。 在 25 oC 时，测试 2 mL 2.44 10-5 mol /L ct DNA 溶液紫外吸收强度。将恒温 槽升温至 35 oC (35-95 oC 间、每隔 5 oC 的温度，总共 12 组温度)，重复测试溶液 紫外吸收强度。然后在 2mL 2.44 10-5 mol/L ct DNA 溶液中加入 2 L 5.63 10-4 mol/L BZQN 溶液混合，重复上述过程。 2.2.5 荧光光谱荧光光谱实验实验 取 2 mL 2.25 10-5 mol/L BZQN 溶液于比色皿中，测试溶液的荧光强度做空 白对照，加入 5 L 1.08 10-3 mol /L ctDNA 溶液，测试溶液的稳态荧光强度，重 复 10 次。 在初始激发波长为 490 nm，350 - 470 nm 之间记录发射光谱，间距为 10 nm 的条件下，分别扫描 BZQN 和 BZQN-ctDNA 体系的三维荧光光谱，其中 BZQN 的浓度为 2.63 10-5 mol/L，BZQN-ctDNA 体系 ctDNA 的浓度为 1.52 10-6 mol/L。 在控制 25 oC 恒温， 取 2 mL 2.25 10-5 mol/L BZQN 溶液于比色皿中， 测试溶 液的荧光强度做空白对照，加入 5 L 1.08 10-3 mol/L ctDNA 溶液，测试溶液荧 光强度，重复 10 次。再分别控制 31 oC、37 oC 恒温，重复上述实验。本实验中 的数据分析均遵循 Sterm Volmer 方程15， 其中静态猝灭公式为： 0 1 q F KC F 动态猝灭公式为： 0 1 sv F KC F 。 7 取2 mL1.08 10-4 mol/L ctDNA溶液， 加入10 L 5.63 10-4 mol/L BZQN溶液， 测得体系荧光光谱。加入 4L 1 mol/L 的 K+，测溶液的荧光强度，重复 5 次。再 将 K+ 溶液分别换为 Fe3+ 和 Na+，重复上述实验，测试体系荧光光谱。 取40 L 5.42 10-3 mol/L的ctDNA溶液和10 L 5.63 10-4 mol/L的BZQN 溶 液分别用 pH=8，9，10，11，12，13 的 Britton-Robison 缓冲溶液配成 2 mL 的溶 液，固定最佳激发波长(340 nm)和最佳发射波长(490 nm)测不同 pH 值下的溶液 的荧光强度。 2.2.6 红外光谱实验红外光谱实验 采用液膜法，在压好的溴化钾片上，分别滴加 DNA，DNA-BZQN 体系的溶 液，检测个体系的红外光谱。 3 结果与讨论结果与讨论 3.1 BZQN 对对 ctDNA 的紫外吸收光谱的影响的紫外吸收光谱的影响 图 1 BZQN 对 ctDNA 紫外吸收强度的影响 5 8.35 10/c DNAmol L 3 10/:0,2.81,8.45,14.1,19.7 BZQN cmol LAH 图 1 是不同浓度的 BZQN 在 ctDNA 溶液中的紫外吸收光谱， 其中曲线 F 是 2.75 10-2 mmol/L BZQN。溶液在 325nm 左右有最大吸光度，紫外吸收光谱发生 增色效应，溶液的紫外吸收随 BZQN 浓度的增大而增强，说明 BZQN 与 ctDNA 8 之间发生了较强的相互作用。增色效应与减色效应是 DNA 所特有的，与其双螺 旋结构密切相关的光谱性质，若药物嵌入到 ctDNA 的碱基对中，则会改变构成 碱基堆积力的疏水作用力和范德华力，从而使 DNA 的构象和结构的稳定性产生 改变，表现为显著的增色效应16。因此可以推断 BZQN 与 ctDNA 之间可能是嵌 插作用。 3.2 荧光光谱荧光光谱 3.2.1 稳态荧光稳态荧光 图 2 BZQN 滴定 ctDNA 的荧光光谱 5 8.35 10/c DNAmol L 3 10/:1.41,2.82,4.22,7.04,9.85,12.7 BZQN cmol LBG 图 3 ctDNA 滴定 BZQN 的荧光光谱 5 2.25 10/c BZQNmol L 3 10/:0,2.70,5.42,8.13,10.8,13.5,16.3,19.0,21.7,24.4 DNA cmol LAJ 9 图 2 是 BZQN 滴定 ctDNA 溶液的荧光光谱。 其中曲线 A 是 1.67 10-5 mol/L ctDNA， BZQN空白对照的浓度为1.88 10-3mmol/L。 ctDNA无荧光， 当加入BZQN 后， 溶液的荧光发射峰从 470nm 移动 388 nm 处， 且荧光强度随 BZQN 浓度的增 大而增强。说明 BZQN 对 DNA 具有增敏作用，表明 BZQN 与 DNA 之间发生了 相互作用。 图 3 是不同浓度的 ct DNA 在 BZQN 溶液中的荧光光谱，其中 ctDNA 空白 对照溶液的浓度为 1.67 10-2 mmol/L。 BZQN 在 470 nm 处出现特征吸收峰， 溶液 的荧光强度随着 DNA 浓度的增大而减小，说明 BZQN 与 ctDNA 发生了某种方 式的结合，DNA 的存在对 BZQN 的荧光有猝灭作用。 3.2.2 三维荧光三维荧光 三维荧光光谱不仅能够直观地表现核酸分子在不同条件下的构象变化， 还可 全面展现待测样品的荧光信息， 由此使核酸特征构象变化的研究更具有科学性和 可靠性9。 图 4 BZQN 的三维荧光光谱 10 图 5 BZQN-ctDNA 的三维荧光光谱 BZQN 的三维荧光光谱如图 4 所示，BZQN-DNA 的三维荧光光谱如图 5 所 示，比较图 4 和 5 可以看出：加入 ctDNA 后，散射峰明显增强，说明 BZQN 与 DNA 之间发生了强烈的相互作用；而荧光发射峰的强度减弱，与稳态荧光的结 果相同，表明 DNA 与 BZQN 发生相互作用后使 BZQN 的荧光猝灭。 3.2.3 变温荧光变温荧光 图 6 不同温度下 ctDNA 对 BZQN 的 Stern-Volmer 关系图 荧光猝灭机理可分为静态猝灭和动态猝灭。 静态猝灭是猝灭常数 Ksv 随温度 的升高而减小，而动态猝灭是猝灭常数 Ksv 随温度的升高而增大。猝灭常数 Ksv 11 能够衡量 DNA 对 BZQN 荧光猝灭的速率。以 F0/F-1 对 ctDNA 的浓度作图，可 以得到 DNA 对 BZQN 的 Stern - Volmer 猝灭曲线，如图 6 所示。 图 6 是利用温度在 298，303，310 K 时的荧光实验数据，分别做出 3 个温度 下的 Stern - volmer 曲线，对实验数据线性拟合，得 298 K 时 BZQN 与 DNA 作 用的猝灭常数 Ksv=5.3 104 L mol-1，303K 时的猝灭常数 Ksv =7.9 104 L mol-1 ， 310K 时的猝灭常数 Ksv =8.8 104 L mol-1。动态猝灭作用的 Ksv 值一般都小于 2.00 1010 L mol-1，初步判断 DNA 对 BZQN 的猝灭方式可能为动态猝灭。据文 献17报道，随着温度的升高，会使分子扩散系数增大，分子间发生碰撞的几率 增大，发生荧光猝灭的可能性也随之增大。如果荧光猝灭机理是静态猝灭，温度 升高会使 Ksv 减小；若是动态猝灭，则温度的升高会使 Ksv 增大。同时，升高 温度后将降低配合物的稳定性，这就使得形成配合物的可能性也减小。图 6 中， 随温度升高， Ksv 的值明显增大， 表明 ctDNA 对 BZQN 的猝灭方式为动态猝灭。 3.3 碱变性实验碱变性实验 图 7 BZQN-DNA 体系碱变性曲线 ctDNA 是具有双螺旋结构的大分子，通过两条链之间的碱基对由氢键相互 作用而紧密连接在一起。BZQN 是本身具有荧光的物质，和 DNA 相互作用后形 成的 BZQN-DNA 溶液也具有荧光。DNA 的碱变性指的是，互补碱基间的氢键 作用力在碱性溶液中会减弱， 导致DNA开链成两条单链， 破坏其双螺旋结构18。 12 曲线 A-F 是 pH=8, 9, 10, 11, 12, 13 的 BZQN-DNA 溶液的荧光光谱，由图可 以看出：随着溶液的碱性增强，溶液的荧光强度减弱，且在碱性较强的溶液中荧 光强度特别微弱。这种现象可能是因为溶液的碱性增强后使 DNA 的双螺旋结构 发生变化，致使 BZQN 从 DNA 上脱落，在溶液中游离使能量降低，荧光强度减 弱，据此可以推测 BZQN 应该嵌插于 ctDNA 的碱基间。 3.4 金属离子对金属离子对 BZQN 与与 DNA 相互作用的影响相互作用的影响 金属阳离子易与 DNA 的磷酸基团负离子发生静电作用，使得 DNA 的结构 特征发生变化，其理化性质和生理功能也会发生相应的改变。DNA 分子收缩后 使具有荧光的分子从 DNA 上脱落，游离的荧光分子由于相互碰撞或者与器壁碰 撞使能量降低，荧光强度减弱18。不同的金属阳离子加入后，对 BZQN-DNA 体 系荧光的影响不同，结果如图 8 所示。 图 8 Na+、Fe3+、K+ 对 BZQN-DNA 体系荧光强度的影响 图 9 K+ 对 BZQN 荧光强度的影响 c(Mn+)=0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.010 mol/L 13 由图 8 可以看出，随金属阳离子强度的增加，BZQN-DNA 体系荧光强度明 显减小，其中 K+ 离子的影响最显著。图 9 是 K+ 对 BZQN 荧光强度的影响，表 明 K+ 对 BZQN 并无特异性结合，只是对 BZQN-DNA 体系的影响比较显著。文 献19报道，金属阳离子与 DNA 的相互作用模式主要是静电作用。因此推测本实 验中荧光强度减弱可能是由于金属阳离子相对于BZQN更容易与DNA的负离子 磷酸基团作用，金属阳离子与 DNA 的静电作用更强，使得 BZQN 从 DNA 上脱 落，处于游离状态的 BZQN 在溶液中做无规则运动，容易发生能量转移，导致 BZQN 的能量降低，体系的荧光强度降低。这种现象说明在 DNA 与 BZQN 之间 的相互作用中，静电引力仍然是主要的作用力， 本实验进一步证实了静电作用是 二者的作用模式之一。 3.5 热变性实验热变性实验 加热可破坏 DNA 的双螺旋结构，使碱基之间的氢键断裂，形成两条单链。 通常将 DNA 双链结构失去一半时的温度称为 DNA 的熔点 Tm13。本实验中 Tm 的测定采用 35-100 oC 内每隔 5 oC 记录 ctDNA 及其复合物在 260 nm 处的吸光度 （A）。以 0 0 ss f AA f AA 对温度 T 作热变性曲线图。 0 0 ss f AA f AA 式中 A和 A 分别为起始温度和最终温度时的吸光度，A 为不同温度下体系的吸光度，则 fss 0.5 所对应的温度即为 ctDNA 和 BZQNDNA 复合物的 Tm。 图 10 ctDNA 与 BZQN-ctDNA 的热变性曲线 14 图10是温度对DNA及BZQN-DNA溶液的吸光度的影响曲线。 线a是ctDNA， 线 b 是 BZQN-DNA，由上图可以看出游离 ctDNA 的 Tm约为 87oC，而 BZQN DNA 复合物的 Tm约为 92 oC，Tm明显升高。由于嵌插结合会使 Tm增加，而沟 槽或静电结合对 Tm影响很小，因此推测 BZQN 部分嵌入 ctDNA 的碱基对中， 并在一定程度上增强了 ctDNA 双螺旋结构的稳定性。 3.6 BZQN 对对 DNA 的结构影响的结构影响 3.6.1 圆二色谱（圆二色谱（CD）法研究法研究 BZQN 对对 DNA 的结构影响的结构影响 DNA 的 CD 图中 275 nm 波长附近的正峰代表 DNA 碱基对的堆积，240 nm 处的负峰是 DNA 双螺旋结构的 B 型构象的特征峰20，可以通过正负峰的强度 和位置的变化判断 DNA 结构变化。 图 11 DNA 和 DNA-BZQN 溶液的 CD 谱 图 11 是 DNA 和 BZQN-DNA 的 CD 光谱图。在 200-300 nm 的紫外区内， ctDNA 在 275 nm 左右出现一个正的最大值，主要是由于 DNA 的碱基对堆积而 产生的；在 240 nm 左右出现一个负的最大值，是由于 DNA 的双螺旋结构导致 的，是 B 型 DNA 的特征峰20。加入 BZQN 溶液后，导致 DNA 的 CD 谱发生变 化， 在 275 nm 处的 CD 正峰强度减弱， 240 nm 处的负峰的强度增强。 说明 BZQN 与 DNA 之间发生了相互作用， 且作用后影响了 ctDNA 的二级结构的构象。 而二 级结构的变化会导致 DNA 三、四级结构的改变，从而引起 DNA 生物学功能的 改变并使 ctDNA 分子双螺旋链发生解链21。BZQN 加入后 ctDNA 的 CD 谱的谱 15 峰的峰位并未发生改变，说明 BZQN 的加入只影响了 DNA 的二级构象，并没有 使 ctDNA 分子双螺旋链发生解链。 3.6.2 FTIR 研究研究 BZQN 对对 DNA 结构的影响结构的影响 图 13 BZQN、DNA、BZQN-DNA 的红外图谱 图 13 是 BZQN、DNA 以及 BZQN-DNA 体系的红外光谱，在 DNA 的红外 光谱中，1631 cm-1是鸟嘌呤（G）的特征吸收峰；1487 cm-1是胸腺嘧啶（T）的 特征吸收峰；1400 cm-1是腺嘌呤（A）的特征吸收峰；1174 cm-1是胞嘧啶（C） 的吸收峰。加入 BZQN 后 DNA 的红外光谱中，G、T、A、C 碱基的特征吸收峰 的峰位分别由 1631 cm-1移至 1637 cm-1，1487 cm-1移至 1489 cm-1，1400 cm-1移 至 1400 cm-1，1174 cm-1移至 1175 cm-1。其中 G，T，C 碱基峰位移动明显，推 测 BZQN 可能是嵌入到 DNA 的碱基对中。G，C 碱基特征峰的振动强度随着 BZQN的加入增大的比较明显， 而T， A碱基特征峰的振动强度只有微细的变化， 因此推测 BZQN 能与 DNA 的 G，C 碱基上的活跃位点作用22。 3.7 BZQN 与与 DNA 相互作用的焓变相互作用的焓变 图 12 是 BZQN 与 DNA 结合的 ITC 曲线， 以及对其积分得到的结合反应热 对 BZQN 与 DNA 物质的量之比的线性拟合曲线。用仪器自带的 Nano ITC Analyze 软件处理线性拟合曲线可以得到 BZQN 与 DNA 反应的焓变H与熵变 S分别为 27.72 KJ/mol 和 200.9 J/(mol K)，结合常数 Ka为 4.32 105 L/mol，结 16 合位点数 n = 4。根据吉布斯-赫姆霍兹公式GHT S (等温状态下)，常温 下 BZQN 与 ctDNA 结合的吉布斯自由能变G为-32.16 kJ/mol， 负值说明 ctDNA 与 BZQN 的结合在标准状态下是自发过程。 图 12 298.15K 时 BZQN 与 DNA 结合的 ITC 曲线 药物与生物大分子之间相互作用的作用力主要有静电、氢键、疏水作用。对 于 DNA - 药物体系，焓值和熵值都为正值，则表明药物 DNA 的作用过程是吸 热、熵增的过程23-24。据此推测 BZQN 与 DNA 作用是吸热熵增的，主要作用力 是氢键和静电作用。DNA 分子周围的水分子在药物与之相互作用的过程中会被 挤出，并且结合位点附近的水化层也会因为药物的靠近而失去一部分水分子， DNA 和药物的脱水作用都是吸热的过程， 并且对于熵增是正的贡献， 如果H0 且S0， 则是熵驱动过程23-24。 由于 BZQN 与 DNA 的作用过程中H0，S0 且 0G，所以推测 BZQN 与 DNA 的结合是熵驱动过程。 3.8 分子模拟分子模拟 图 13 是 BZQN 与 DNA 相互作用的分子模拟图，由图 13 可以清晰地看到 BZQN 非常靠近 DNA 的磷酸骨架， 可能是 BZQN 中带正电的部分与带负电的磷 酸骨架之间有静电引力； BZQN 的苯环上的 H 原子与 DNA 的胞嘧啶环侧链的 N 17 原子之间形成氢键，氢键长度仅仅只有 2.12 ，表明 BZQN 与 DNA 的碱基对之 间也很容易发生相互作用。 图 13 BZQN 与 DNA 相互作用的分子模拟图 分子模拟的结果表明，BZQN 是结合在 DNA 大沟附近的，羟基氢原子与 胞嘧啶 C4上的 N 原子形成氢键，由于 BZQN 分子带正电，DNA 的磷酸骨架带 负电，因此推测在 BZQN 与 DNA 的相互作用中静电作用占主导。 4 结论 (1) BZQN与DNA之间发生了相互作用， DNA能使BZQN的荧光发生猝灭， 且猝灭模式为动态猝灭；圆二色谱和红外光谱实验表明，BZQN 与 DNA 相互作 用后影响了 DNA 的二级结构，推测 BZQN 可能是嵌入到 DNA 的碱基对中，与 G，C 碱基上的活跃位点作用，并增强了 DNA 的稳定性； (2) BZQN 与 DNA 相互作用的结合常数为 4.32 105 L/mol；BZQN 与 DNA 相互作用的H 0，S 0，推测 BZQN 与 DNA 的结合是熵驱动过程； (3) 分子模拟的结果表明，BZQN 是结合在 DNA 大沟附近，羟基氢原子与 胞嘧啶 C4上的 N 原子形成氢键。 18 参考文献参考文献 1 孙业欣, 章怡彬. 喹啉及其相关杂环类抗疟药研究进展J. 国外医药 （抗生素分册） , 2012, 33(1): 6-22. 2 冷元红, 万莉, 袁萍等. 抗疟疾药物的发现与发展J. 化学教育, 2013, 34(7): 6-9. 3 Hoppe HC, Van Schalkwyk DA, Wiehart UI et al., Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. 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