水稻土中硫酸盐还原微生物研究进展.pdf

第2 9 卷第8 期 生态学报V 0 1 2 9 ，N o 8 2 0 0 9 年8 月A C T AE C O L O G I C AS I N I C A A u g ，2 0 0 9 水稻土中硫酸盐还原微生物研究进展 刘新展1 ，贺纪正1 ，张丽梅1 ( 1 中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室，北京1 0 0 0 8 5 ；2 中国科学院研究生院，北京1 0 0 0 3 9 ) 摘要：硫足水稻必需的营养元素之一。硫酸盐还原是硫元素生物地球化学循环巾的火键步骤，在稻田土壤表层和水稻根际都t J 分活跃。介导硫酸盐还原过程的硫酸盐还原菌( s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ，S R B ) 足稻田土壤中重要的功能菌群。它们不仅是硫 元素生物地球化学循环的重要参与者，也是土壤中有机污染物降解的主要力量之一，发挥着重要的生态和环境功能。综述了稻 田土壤中微生物参与的硫酸盐还原过程、S R B 的生物多样性以及目前研究稻田土壤S R B 主要采用的分子生态学方法，如末端 限制性片段长度多样性( T R F L P ) 、变性梯度凝胶电泳( D G G E ) 、实时荧光定量P C R ( r e a l t i m eP C R ) 、荧光原位杂交( F I S H ) ，并 对水稻土壤中S R B 的分子生态学研究方向进行了展单。 关键词：水稻土；硫循环；硫酸盐还原菌；末端限制性片段长度多态性；变性梯度凝胶电泳；实时荧光定量P C R ；荧光原位杂交 文章编号：1 1 2 0 0 0 9 3 3 ( 2 0 0 9 ) 0 8 4 4 5 5 0 9 中图分类号：S 1 5 4 3 6 文献标识码：A T h es u l f a t e - r e d u c i n gb a c t e r i aa n ds u r f e rc y c l ei np a d d ys o i l U UX i n Z h a n l 一，H Ej i Z h e n 9 1 ，Z H A N GL i M e i l 。 1S t a t e 研L a b o r a t o r yo fU r b a na n dR e g i o n a lE c o l o g y ，R e s e a r c hC e n t e rf o rE c o E n v i r o n m e n t a lS c i e n c e s ，C h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s ，B e i j i n g1 0 0 0 8 5 ， C h f n 口 2G r a d u a t eU n i v e r s i t yo fC h i n e s eA c a d e m yo f S c i e n c e s ，B e i j i n g1 0 0 0 3 9 ，C h i n a A c t aE c o l o g i c aS i n i c a ，2 0 0 9 2 9 ( 8 ) ：4 4 5 5 4 4 6 3 A b s t r a c t ：S u l f u ri so n eo ft h em o s tn e c e s s a r yn u t r i e n t sf o rr i c eg r o w t h S u l f a t er e d u c t i o ni sak e yp r o c e s si nt h es u l f u r b i o g e o c h e m i c a lc y c l e ，w h i c hi sa c t i v e i nt h es u r f a c ea n dr h i z o s p h e r eo ft h er i c ep a d d ys o i l s S u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ( S R B ) a r et h em a i nf u n c t i o n a lm i c r o b i a lg r o u pa n dc a na l s op l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ed e g r a d a t i o no fs o m eo r g a n i c p o l l u t a n t si nt h er i c ep a d d ys o i l s T h i sr e v i e wp a p e rs u m m a r i z e dr e c e n tm a j o ra d v a n c e si nt h ep r o c e s s e so fs u l f a t er e d u c t i o n a n dt h ed i v e r s i t yo fS R Bi nt h er i c ep a d d ys o i l s I ta l s oi n t r o d u c e ds o m ep r e v a l e n tm o l e c u l a rm e t h o d si nt h es t u d i e so fS R B i nt h er i c ep a d d ys o i l s ，s u c ha st e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( T R F L P ) ，d e n a t u r eg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( D G G E ) ，r e a l - t i m eP C R ，a n df l u o r e s c e n c e 讥s i t uh y b r i d i z a t i o n ( F I S H ) F u t u r ep e r s p e c t i v e s i nt h e m o l e c u l a re c o l o g yo fS R Bs t u d i e sw e r ep r o p o s e d K e yW o r d s ：p a d d ys o i l ；s u l f u rc y c l e ；s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ；T - R F L P ；D G G E ；r e a l - t i m eP C R ；F I S H 淹水稻田土壤被公认为是研究土壤微生物的典型模式环境，一直备受研究者的重视。近年来，参与水 稻土壤中碳、氮元素生物地球化学循环的微生物如甲烷氧化菌、氨氧化菌已经得到了深入的研究口JJ 。与碳 和氮元素相比，水稻土壤中硫元素的含量并不丰富，但其所发挥的营养功能却是不能被忽视的。每年水稻土 壤要获得8 1 7k g h m 2 的硫以满足水稻的正常生长M J ，并且植物均以无机态硫酸盐的形式吸收硫素营养 J 。 硫酸盐还原菌( s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ，S R B ) 不仅是稻田土壤中硫元素生物地球化学循环的主要参与者，而 且还能够降解稻田土壤中的有机污染物如甲酚、联苯，在环境修复方面发挥着重要的作用，7 J 。水稻土壤中 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 4 0 5 7 1 0 8 2 ) ；国家重点基础研究发展规划资助项目( 2 0 0 5 C B l 2 1 1 0 5 ) 收稿日期：2 0 0 8 0 8 2 7 ；修订日期：2 0 0 9 - 0 5 1 2 通讯作者C o r r e s p o n d i n ga u t h o r E - m a i l ：z h a n g l m r c e e s a c c n h t t p ：w w w e c o l o g i c a c n 万方数据 4 4 5 6生态学报2 9 卷 硫酸盐还原菌被证明能够参与甲烷的厌氧氧化，在水稻土壤中碳、硫循环中同时发挥着重要的作用1 。本文 将对近年来水稻土壤中硫酸盐还原过程，硫酸盐还原茵的多样性以及硫酸盐还原菌研究中常用的分子生态学 方法作一简要综述，旨在为今后从事水稻土壤中硫酸盐还原菌微生物生态学的研究提供参考。 1 土壤硫循环及硫酸盐还原过程 1 1 土壤硫循环 硫是水稻生长的必需营养元素之一，水稻植株中9 0 的有机硫都参与氨基酸和蛋白质的合成一3 ，但高浓 度的硫化氢会对水稻种子的萌发和水稻根系生长产生极大的危害，从而降低水稻的产量0 | 。土壤硫有一2 至+ 6 不同的价态，主要包括s 扣、S o 、s o ：一、s ：0 ；一和s 。o ：一等离子形式。硫元素会随着环境条件的改变在微 生物的作用下转变为不同价态的化合物，构成了硫的生物地球化学循环。微生物在硫循环过程中的作用途经 主要有3 条，如图l 1 所示：( 1 ) 有机硫( 如甲硫氨酸和铁硫蛋白中的硫) 矿化为s 卜，凡是能将含氮有机物分 解产氨的微生物均具有脱硫作用，在这类微生物的作用下，含硫有机物脱硫后形成H ：S 。( 2 ) 还原态硫的氧 化，H ：s 在好氧条件下通过硫氧化微生物的氧化作用形成硫酸盐。目前发现的硫氧化微生物主要有3 种，它 们是无机化能自养细菌( 如硫杆菌属) ，厌氧光合自养细菌( 如绿硫细菌、紫硫细菌) 和极端嗜酸嗜热的古生 菌类( 如硫化叶菌) 。( 3 ) 硫酸盐还原，硫氧化形成的硫酸盐一部分被植物和微生物吸收利用，另一部分在厌 氧条件下参与由S R B 介导的硫酸盐异化还原过程( 形成H ：s ) 或同化还原过程( 形成有机硫化物) 。 光 C y s t e i n e ，m e t h i o n i n e ，e r e 养 图1硫牛物地球化学循环 F i g 1 G e o m i c r o b i o l o g i c a lc y c l eo fs u l f u r 1 2 硫酸盐还原的微生物过程 水稻土壤大多处于还原状态，硫酸盐的异化还原成为硫循环的重要环节，其代谢途径及所涉及的关键酶 类如图2 所示 1 1 1 。硫酸盐( s o l 一) 是最稳定的硫氧化物形式，在A T P 推动下首先转化为腺苷磷酸硫酸酯 ( A D S ) ，可见，A P S 是s o l 一还原过程的起始物。A P S 还原有2 个途径：一是以有机物( 主要是乙酸) 和H ：作为 电子受体，直接转移6 个电子还原为硫化氢( 图中l 越o ) ；二是先转化为三磺酸盐和硫代硫酸盐中间产物， ，再还原为s 2 一( 图中l q “硝硝) 。其中第一条途径被认为是普遍存在的、主要的还原过程。过去一般认 为水稻土壤中s 元素的含量相对较低，硫酸盐还原过程会因为电子受体s o l 一的低浓度而受到限制2 1 。然而 最新研究表明，在培养1 3 周的水稻土壤中仍然可以检测到较高的硫酸盐还原速率( s u l f a t er e d u c t i o nr a t e ， h t t p ：w w w e c o l o g i c a c n 万方数据 8 期 刘新展等：水稻中硫酸盐还原微牛物研究进展 S R R ) m 1 ，这是由于还原态的硫化合物在水稻土壤富氧区域被重新氧化所致m 】，此富氧区域包括氧气可以扩 散到的土壤表层( O 4m m ) 和由于植物通气组织的泌氧作用而形成的根际富氧区域1 5 1 ，实验1 6 8 1 证明这些 区域具有很高的原位硫酸盐还原活性，S R B 数量也很高。 图2 异化硫酸盐还原代谢途径 F i g 2 M e t a b o l i cs c h e m e sa s s o c i a t e d 而t I ld i s s i m i l a t o r ys u l f a t er e d u c t i o n 土壤富氧表层( 0 1c m ) 是硫酸盐还原过程的主要发生区域之一。T h o r s t e n 等 1 卅对意大利水稻土壤0 1 0c m 的土壤层进行分析后发现s o l 一的浓度在lc m 以内最高，可达3 0 0 斗m o l L ，在深度为1 0c m 时s o l 一 的浓度减少为3 0 恤m o l L 一左右。虽然水稻土的s o ；一的浓度比海洋要低很多，但硫酸盐还原活性比较高，约 为2 8I x m o l c m 一d 。 水稻根际是硫酸盐还原过程最活跃的地方，不仅是因为其高的含氧量为硫酸盐还原过程提供大量的电子 受体s o ：一，而且由于根际释放大量的有机物如乙酸、丙酸、乳酸等，直接为硫酸盐还原菌提供电子供体和底 物，因此根际区域的S R B 群落也很为丰富9 | 。水稻土中有限的s o l 一离子浓度还不足以为活跃的硫酸盐还 原过程提供足够的电子受体，水稻植株通气组织释放的氧气才是还原性硫化物转化为s o ：一的主要原因，因 此根际周围( 0 3m m ) 的s o i 一浓度可以达到9 0 1 0 0I j m o l L ，S R R 可以达到0 5I 山m o l c m - 3d 。L l3 1 。 2 硫酸盐还原菌的多样性 硫酸盐还原菌( S R B ) 是一类形态各异、营养类型多样，在厌氧和微氧环境中能利用硫酸盐或者其他硫氧 化物作为氧化有机物的电子受体，并在代谢过程中产生高浓度H ：S 的革兰氏阳性或阴性细菌或古菌】。水 稻土中，由于根际和非根际土壤不同的物理化学性质如有机底物浓度、含氧量，S R B 的数量和多样性分布也存 在着差异。与非根际水稻土相比，根际水稻土中S R B 的数量较高H 纠。另外，在根际水稻土中，生长速度较 快、不完全氧化代谢有机物的S R B 如D e s u l f i v i b r i o 占优势；而在非根际水稻土中，生长较为缓慢，能够形成孢子 且以完全氧化代谢有机物的S R B 如D e s u l f o t o m a c u l u m 为主要类群 1 8 】 过去一般根据细胞形状、细胞可移动性、D N A 中鸟嘌呤和胞嘧啶含量( G C 含量) 、最适生长温度和是否完 全氧化乙酸等对S R B 进行分类，但随着分子生物学技术的迅猛发展，1 6 Sr R N A 基因序列分析应用于S R B 分 类之中怛1 | ，不仅有助于提供S R B 进化的分子信息，而且加速了不同类别S R B 的引物和探针设计，为更深入研 究S R B 提供了有利的手段。 h t t p ：w w w e c o l o g i c a c n 万方数据 生态学报 2 9 卷 目前，已发现的S R B 达1 3 0 余种，通过数据库中1 6 Sr R N A 基因序列的分子进化分析它们被分为4 个主 要类群：革兰氏阴性嗜温S R B ，革兰氏阳性S R B ，嗜热S R B 细菌和嗜热S R B 古菌，涵盖了4 个细菌门：变形菌 门( P r o t e o b a t e r i a ) 、硝化螺旋菌门( N i t r o s p i r a e ) 、热脱硫杆菌f - i ( T h e r m o d e s u l f o b a c t e r i a ) 、厚壁菌门( F i r m i c u t e s ) 和1 个古菌门：广古菌门( E u r y a r c h a e o t a ) 心1 2 2 1 ( 表1 ) 。以下对4 类S R B 进行分别介绍。 2 1 革兰氏阴性嗜温S R B 此类群属于6 一变形菌纲，主要包括两大科：脱硫杆菌科( D e s u l f o b a c t e r a c e a e ) 和脱硫弧菌科( D e s u l f ：o v i b f i o n - a c e a e ) 】，其中D e s u l f o b a c t e r a c e a e 科中有些具有很特殊的形态特性。如脱硫八叠球菌属( D e s u l f o s a r c i n a ) 可以 形成鞭毛，脱硫线菌属( D e s u l f o 船，舭) 的丝状S R B 可以进行滑行运动。 利用T R F L P 和1 6 Sr R N A 基因克隆文库分析发现 ，水稻根际和非根际土壤中革兰氏阴性嗜温S R B 的 组成并无区别，但是会随季节而演替。D e s u l f o b a c t e r a c e a e 科的S R B 主要以D e s u l f o 船，眦属、D e s u l f o s a r c i n a 属和 杆状脱硫菌属一互营杆菌属( D e s u l f o r h a b d u s S y n t r o p h o b a c t e r ) 复合体为主；D e s u l f o v i b r i o n a c e a e 科主要以脱硫弧菌 属( D e s u l f o v i b r i o ) 为主。水稻根际S R Br R N Ad o tb l o t 杂交分析显示，革兰氏阴性嗜温S R B 约占细菌r R N A 总 量的2 一3 ，其中D e s u l f o b a c t e r a c e a e 科约占1 4 ，高于D e s u l f o v i b r i o n a c e a e 科的0 5 。R e a l t i m eP C R 定 量研究发现】，在水稻根际和非根际土壤中D e s u l f o b a c t e r a c e a e 科是S R B 的主要类群，每克干土中所含拷贝数 分别为6 4X1 0 7 个和7 5 1 0 7 个，其中以D e s u l f o r h a b d u s S y n t r o p h o b a c t e r 复合体和脱硫杆菌属( D e s u l f o b a c t e r i u m ) 为主。而在水稻根部，D e s u l f o b a c t e r a c e 科、D e s u l f o v i b r i o n a c e a e 科和脱硫叶菌属( D e s u l f o b u l b u ss p ) 均为主 要类群，拷贝数量均为每克干土约1 0X1 0 8 个。 衰1 主要S R B 类群分布 T a b l e1T h em a i nS R Bg r o u p s 主要分类单元T a x o n o m y 代表属种T y p i c a lg e n u sa n ds p e c i e s 革兰氏阴性嗜温S R B G r a m n e g a t i v em e s o p h i l i cS R B 革兰氏阳性S R B G r a r a p o s i t i v es p o r eS R B 嗜热S R B 细菌B a c t e r i a lt h e r m o p h i l i cS R B 嗜热S R B 占菌A r c h a e a lt h e r m o p h i l i cS R B D e s u l f o v i b r i o ，D e s u l f o m i c r o b i u m D e s u l f o b u l b u s ，D e s u l f o b a c t e r ，D e s u l f o b a c t e r i u mD e s u l f o c o c c u s ，D e s u l f o s a r c i n a ， D e s u l f o m o n i l e 。D e s u l f o ， ，m ，D e s u l f o b o t u l u s ，D e s u l f o a r c u l u s ，D e s u l f o b a c u l a ， D e s u l f o s p i r a ，D e s 以f o c e l l a ，D e s u l f o b a c c a ，D e s u l f a c i n u m ，T h e r m o d e s u l f o r h a b d u s ， D e s u l f o r h a b d u s ，D e s u l f o c a p s a 。D 蜘岫p a Z w ，D e s u l f o f u s t i s D e s u l f o t o m a c u l u m ，c l u s t e rI D e s u l f o s p o r o s i n u 5o r i e n t i s D e s u l f o t o m a c u l u mg u t t o i d e u m T h e r m d e s u l f o b a c t e r i u mc o m m u n e T h e r m o d e s u l f o v i b r i oy e l l o w s t o n i i A r c h a e o g l o b u sf u l g i d u s A r c h a e o g l o b u sp r o f u n d u s A r c h a e o g l o b u sl i t h o t r o p h i c u s 2 2 革兰氏阳性嗜温S R B 革兰氏阳性嗜温S R B 的G C 含量比较低，其生长温度较革兰氏阴性嗜温S R B 高，形态多样，乙酸、苯胺、 琥珀酸盐、儿茶酚、吲哚、乙醇、烟碱、苯酚、硬脂酸盐、丙酮等都可以作为S R B 生长的底物1 。不同的S R B 将 这些有机底物不完全氧化为乙酸，或者完全氧化为c O ：旧 。另外，在此类中某些S R B 例如脱硫肠状菌属 ( D e s u l f o t o m a c u l u mr e d u c e n s ) 可以利用F e 3 + 来代替s o ：一作为电子受体旧1 。 此类S R B 中以D e s u l f o t o m a c u l u m 属为代表，并可进一步分为3 个类群：c l u s t e rI ，和，其中大部分种 都属于D e s u l f o t o m a c u l u mc l u s t e rI 。D e s u l f o s p o r o s i n u so r i e n t i s 和D e s u l f o t o m a c u l u mg u t t o i d e u m 的1 6 sr R N A 基因 序列分别与梭菌属( C l o s t r i d i u m ) 和D e s u l f i t o b a c t e r i u m 属具有很高的相似性，因此被认为是两类新的革兰氏阳 性嗜温S R B ，分别代表着c l u s t e rI I 和c l u s t e rm 2 9 , 3 0 。 虽然这类S R B 与革兰氏阴性嗜温S R B 的生长环境比较相似，但由于能形成芽孢，其耐受高温、干燥和富 氧的能力更强。另外，水稻土比较低的s o ；一浓度，也有利于生长较为缓慢的D e s u l f o t o r n a c u l u m 属S R B 生 存【I8 l 。W i d d e l 汹1 等研究发现，水稻土总是处于有氧和无氧的交替之中，D e s u l f o t o m o 虻u l u m 具有较强的适应能 力而普遍存在于水稻土中。S t e p h a n 等口通过检测水稻根际和非根际土壤中的革兰氏阳性嗜温S R B 发现，所 得到的1 6 sr R N A 基因序列都属于D e s u l f o t o m a c u l u mc l u s t e rI ，说明此类革兰氏阳性S R B 在水稻土壤中的广 泛分布。r R N A 斑点杂交得出在水稻根际O e s u l f o t o m a c u l u mc l u s t e rIr R N A 含量大约占整个细菌的1 ，而在 h t t p ：w w w e c o l o g i c a a n 万方数据 8 期刘新展等：水稻土中硫酸盐还原微生物研究进展 4 4 5 9 水稻非根际土壤中大约为0 5 5 。利用r e a l t i m eP C R 方法对水稻根际和非根际土壤中的D e s u l f o t o m a c u l u m c l u s t e rI 进行定量后得出，这类S R B 分别为总细菌量的0 5 和2 m J 。 2 3 嗜热S R B 细菌 此类S R B 主要以热脱硫杆菌属( T h e r m o d e s u l f o b a c t e r i u mc o m m u n e ) 一副和热脱硫弧菌属( T h e r m o d e s u l f o v i b r i o y e U o w s t o n i i ) o 为代表。这两个属的S R B 都是从美国黄石国家公园的热泉中分离出来的，其生长温度大约为 6 5 7 0 。C ，介于革兰氏阳性细菌和嗜热S R B 古菌之间。这两个属的S R B 虽然具有相似的生理特性，但是基于 1 6 sr R N A 基因序列的系统发育分析表明它们的进化距离较远心I 3 4 J 。这种情形与D e s u l f o v i b r i o 属一样，此属中 不同S R B 种之间的生理特性很相似，但是它们的分子进化距离较远。此外，嗜热S R B 细菌和D e s u l f o v i b r i o 属 的S R B 能够利用的底物有限，且对乙酸进行的是不完全氧化。因此H e n r y 1 认为嗜热S R B 细菌和D e s u l f o v i b r i o 属S R B 可能在环境中发挥着同样的生态功能。在细菌的分子系统进化分析中，嗜热S R B 细菌处于进化 分枝最深处的位置，这也验证了所有细菌的祖先都是嗜热细菌的推断一5 | 。 2 4 嗜热S R B 古菌 嗜热S R B 古菌相较于其它几类S R B 而言最大的特点是其最适生长温度都在8 0 以上，到目前为止共得 到3 株分离自海底热泉的S R B 古菌：A r c h a e o g l o b u sf u l g 谢u , m 】，A r c h a e o g l o b u sp r o f u n d u s 3 71 和A r c h a e o g l o b u s l i t h o t r o p h i c us 【3 8 l ，它们均属于古丸菌属。S t e t t e r m3 发现A f u l g u i 哪能够产生少量的甲烷气体，具有产甲烷菌 所特有的F 4 加因子，四氢甲烷蝶呤( 即F m 因子) 和甲烷呋喃。这被认为是硫酸盐还原菌和产甲烷菌之间进化 关系的证明，即硫酸盐还原菌的祖先可能来自于产甲烷菌【35 | 。另外，通过对A f u l g i d w1 6 S 和2 3 Sr R N A 基 因序列的分子进化分析得出，它与硫还原古菌和硫氧化菌的进化距离反而没有与产甲烷菌的进化距离近1 。 W o e s e 等认为硫酸盐还原古菌是从产甲烷菌进化而来的H 1 l ，因为产甲烷菌的划分依据除了能否产生甲烷，还 包括其它重要的代谢特征，例如喜盐古菌和热嗜酸菌。此外，W a g n e r 等 4 2 1 认为古菌和细菌拥有共同的祖先 且具有硫酸盐还原酶的活性，或者硫酸盐还原酶基因在古菌和细菌域之间存在水平转移。A r c h a e o g l o b u s 是占 菌域中唯一能够还原硫酸盐的类群，但是它们是怎么获得硫酸盐还原的活性，至今尚未找到答案。1 9 9 7 年， A f u t g d u , 的全序列公布，这也是第一个发表的S R B 全基因组序列J 。 3 研究硫酸盐还原菌的分子生态学方法 众所周知，传统的微生物检测手段只能研究土壤中约1 的微生物种类，这大大阻碍了土壤微生物生态 学研究的步伐。分子生物学技术能够提供丰富的不可培养微生物的数量和活性信息，使全面了解和认识不同 环境中微生物的结构和功能成为可能。这些研究技术主要包括：基于聚合酶链式反应( P C R ) 的分子标记技术 如末端限制性片段长度多样性( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，T R F L P ) 、基因克隆文库分析 法( c l o n el i b r a r y ) 、变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e e t r o p h o r e s i s ，D G G E ) 、实时荧光定量P C R ( r e a l - t i m eP C R ) 和不依赖于P C R 的核酸杂交技术如荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，F I S H ) 。 目前，这些技术已经广泛应用于S R B 的分子生态学研究中去，将环境微生物领域的研究带入一个革命性的新 时代。在实际应用中为获得更加准确的检测结果，常常将两种或多种技术结合起来相互补充、相互印证。 3 1 T R F L P 和克隆文库技术 T R F L P 即末端标记限制性片段长度多态性，是一种全新、快速、有效的微生物群落结构分析方法。T R F L P 采用一端荧光标记的引物进行P C R 扩增，P C R 产物经限制性内切酶消化后，消化产物以D N A 测序仪进 行分离，通过激光扫描，得到荧光标记端片段的图谱J 。图谱中波峰的多少表明了群落结构的复杂程度，峰 面积的大小代表了相应群落的相对数量。与其它分子技术相比，它的优点是能够迅速产生大量重复且精确的 数据，用于微生物群落结构的时空演替研究；而且其精确度和分辨率都要高于其它方法产生的图谱。但是，T R F L P 仅提供微生物的种类和相对数量的信息，还无法确定是何种微生物。因此，通常结合克隆文库测序分 析，达到确定微生物种类的目的。S c h e i d 等o 以基于1 6 Sr D N A 的T R F L P 技术为主，辅以构建克隆文库为手 段研究了水稻根际和非根际土壤中革兰氏阴性S R B 在不同生长期的群落结构变化。S c h m a l e n b e r g e r 等m 1 利 h t t p ：w w w e c o l o g i c a c n 万方数据 4 4 6 0 生态学报 2 9 卷 用基于异化亚硫酸盐还原酶基因( d i s s i m i l a t o r y ( b i ) s u l f i t er e d u c t a s e ，d s r A B ) 的T R F L P 技术分析了酸性沼泽 地0 5 0c m 深度梯度下S R B 群落结构的变化趋势。 3 2 D G G E 技术 D G G E 的原理是根据含有不同序列的D N A 片段在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为 的不同而导致迁移率的不同。此种方法灵敏度非常高，能将仅有1 个碱基差异的D N A 片段分开mJ 。自1 9 9 3 年M u y z e r 4 7 1 等将D G G E 的方法应用于微生物生态学研究以来，D G G E 迅速成为一种简便而有效的分子生物 学研究手段。M i l e R o 镐3 等使用D G G E 技术对不同类型土壤的S R B 进行研究，且对D G G E 的技术条件进行了 优化，辅以建立克隆文库的方法对D G G E 的结果进行验证，结果发现两种分子生物学技术具有很好的可比性， D G G E 是一种有效的揭示S R B 群落结构的分子生物学方法。目前，D G G E 技术已经广泛用于研究海底沉积 物 4 9 】、含水土层 5 0 1 、湖泊等环境的S R B 研究中去，还未见到其应用于水稻土S R B 研究的报道。D G G E 技 术也存在一定的局限性。例如，V , d l a e y s 5 2 1 等发现D G G E 方法并不能对样品中所有的D N A 片段进行分离。 M u y z e r m l 等通过试验得出D G G E 只能对微生物群落中数量上大于1 的优势种群进行分析。 3 3R e a l t i m eP C R 技术 从环境中获得S R B 群落的数量信息对于研究S R B 的活性强度和生态意义具有重要的意义。过去，普遍 采用传统的依赖于可培养的方法对环境样品中的S R B 进行定量，比如最大可能数法( m o s tp r o b a b l en u m b e r ， M P N ) 1 6 , J s l 。然而，这种方法非常耗时，而且由于环境中大部分S R B 为不可培养微生物，M P N 法往往过低的 估计样品中S R B 的数量 5 3 I 。实时荧光定量P C R 在P C R 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实 时监测整个P C R 的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析懈J 。目前对S R B 的定量大多借助于 R e a l t i m eP C R 技术。S t u b n e r 晒3 2 1 用此技术定量分析了水稻土壤中3 个主要的革兰氏阴性S R B 种群 D e s u l f o b a c t e r a c e a e 科、D e s u l f o v i b r i o n a c e a e 科和D e s u l f o b u l b u ss p 的组成以及革兰氏阳性S R BD e s u l f o t o m a c u l u m 属的丰度。其结果与基于1 6 Sr R N A 的斑点杂交结果m 3 相吻合，再次印证了R e a l t i m eP C R 是一种灵敏的 微生物种群定量技术。刘新展”5 等使用R e a l t i m eP C R 分析了冬夏两个季节不同施肥处理下水稻土壤中的 S R B 群落丰度，结果发现，不同施肥处理下水稻土壤中S R B 并没有显著性差异。冬季平均每克干土d s r A B 基 因拷贝数为5 0 8 1 0 8 ，夏季平均每克干土d s r A B 基因拷贝数为5 9 2 1 0 8 。 3 4 F I S H 技术 F I S H 技术主要以微生物1 6 Sr R N A 基因作为鉴别微生物的标志物，设计并合成荧光探针，直接与环境样 品中微生物1 6 Sr R N A 基因上的目标特异性片段进行杂交反应，激发荧光信号对目标微生物进行观察和计数。 该方法的特点是能直观、准确地得到目标微生物的原位数量和空间分布信息，探测微生物群落结构和生物多 样性，监测微生物群落动态变化惭】。F I S H 技术结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，是各种分子 标记技术的有益补充，已经被广泛应用于微生物生态学的研究领域中。在不同环境中硫酸盐还原菌群落结构 的研究中也是一种非常有力的手段，被众多研究者所青睐。D e t m e r s 等 列利用F I S H 技术对德国煤矿G a r z w e i l e r I 附近的土层微生物群落分析得出，D e s u l f o t o m a c u l u m 属是优势的硫酸盐还原菌群，约占整个群落数量的 2 5 。P u r d y 等b 副使用S R B 特异性探针研究淡水和海水沉积物中S R B 类群时发现，在低s o , 一浓度( 0 1 2 8m m o l L 。1 ) 的淡水沉积物中，只能检测到D e s u l f o b u l b u s 属和D e s u l f o b a c t e r i u m 属，并且只占整个微生物群落 结构很小部分，大约1 6 ；而在海水沉积物中，S R B 群落更为多样，并且数量能够达到整个微生物群落的 1 0 1 1 4 。但是目前利用此技术来研究水稻土壤中S R B 原位空间分布和丰度变化还未见报道，因此这 是一个有待于发掘的广阔空间。 4 展望 水稻土壤是典型的淡水环境模式体系。水稻土壤中硫酸盐还原菌不仅与土壤中硫素的转化及其利用有 着直接的关系，而且与N 、M n 、F e 和c 循环的微生物功能群如硝酸盐还原菌、锰还原菌、铁还原菌和产甲烷菌 有着密切的竞争关系。研究水稻土壤中的硫酸盐还原菌的生态结构和生态机制，可以有效地保护土壤的肥 h t t p ：w w w e c o l o g i c a c n 万方数据 8 期刘新展等：水稻土中硫酸盐还原微牛物研究进展 4 4 6 l 力，阐明不同土壤微生物功能群之间的协作机制，维持水稻土壤生态系统的稳定。因此基于对国内外此领域 的研究工作加以总结后得出，今后需要重点加强以下研究： ( 1 ) 目前对于水稻土壤中硫酸盐还原过程及其相关的C 、N 、F e 元素的循环过程都还是停留在描述性的 阶段，究其原因是能够分离出来的可以培养的微生物还很少，阻碍了对单一微生物或主要微生物作用机制的 深入研究，使我们不能确定到底这些微生物在土壤中究竟发挥着怎样的功能。因此应对传统的微生物学方法 进行改善，结合现代分子生态学方法从水稻土壤中分离鉴定出更多的硫酸盐还原菌。 ( 2 ) 开展水稻土壤中硫酸盐还原菌系统的分子生态学研究，将影响水稻土壤中硫酸盐还原过程中的主要 理化因子如s o l 一的浓度和底物( 主要为乙酸和H ：) 的含量等原位信息与S R B 群落的组成联系起来，揭示特 定S R B 菌群生理特性。在分子水平上深入研究S R B 对环境条件，如温度、p H 及施肥等农业管理措施变化的 响应，阐述生态结构变化与环境因素改变之间的相互关系，从而对环境变化进行预警。 ( 3 ) 研究水稻土壤中硫酸盐还原过程和N 、M n 、F e 和C 循环过程的联系和相互制约关系，以及S R B 和土 壤其它重要功能菌群如硝酸盐还原菌、锰还原菌、铁还原菌和产甲烷菌之间的协作、竞争关系，阐明不同微生 物功能菌群之间的生态结构和调节机制。 R e f e r e n c e ： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 L i e s a c kW ，S c h n e l lS ，R e v s b e c hNP M i c r o b i o l o g yo ff l o o d e dr i c ep a d d i e s F E M SM i c r o b i o l o g yR e v i e w s ，2 0 0 0 ，2 4 ( 5 ) ：6 2 5 6 4 5 Z h e n gY ，Z h a n gLM ，Z h e n gYM ，D iHJ ，H eJZ A b u n d a n c ea n dc o m m u n i t yc o m p o s i t i o no fm e t h a n o t r o p h si naC h i n e s ep a d d ys o i lu n d e rl o n g t e r mf e r t i l i z a t i o np r a c t i c e s J o u r n a lo fS o i l sa n dS e d i m e n t s ，2 0 0 8 ，8 ( 6 ) ：4 0 6 4 1 4 H eJZ 。Z h a n gLM A d v a n c e si na m m o n i a o x i d i z i n gm i c r o o r g a n i s m sa n dg l o b a ln i t r o g e nc y c l e A c t aE c o l o g i c aS i n i c a ，2 0 0 9 ，2 9 ( 1 ) ：4 0 6 - - 4 1 5 F r e n e yJR ，J a c qVA ，B a l d e n s p o r g e rJF T h es i g n i f i c a n c eo fb i o l o g i c a ls u l f a t ec y c l ei nr i c ep r o d u c t i o n I n ：D o m m e r g u e sYD ，D i e mHGe d s M i c r o b i o l o g yo ft r o p i c a ls o i l sa n dp l a n tp r o d u c t i v i t y H a g u e ：M a r t i n u sN i j h o f f WJ u n kP u b ，1 9 8 2 K e r t e s zMA ，M i d e a uP T h er o l eo fs o i lm i c r o b e si np l a n ts u l p h u rn u t r i t i o n J o u r n a lo fE x p e r i m e n t a lB o t a n y ，2 0 0 4 ，5 5 ( 4 0 4 ) ：1 9 3 9 1 9 4 5 S h i b a t aA ，T o y o t aK ，M i y a k eK ，K a t a y a m aA A n a e r o b i cb i o d e g r a d a t i o no f4 - a l k y