食品生物技术概论.ppt

IntroductiontoFoodBiotechnology,食品生物技术概论,现代生物技术是70年代未80年代初以现代生物学研究成果为基础，以基因工程为核心发展起来的一门新兴学科。现已成为解决人类面临的人口、资源、能源、食物和环境等五大危机的主要途径之一。食品生物技术是生物技术在食品原料生产、加工和制造中的应用的一个学科。它包括了食品发酵和酿造等最古老的生物技术加工过程，也包括了应用现代生物技术来改良食品原料的加工品质的基因、生产高质量的农产品、制造食品添加剂、植物和动物细胞的培养以及与食品加工和制造相关的其他生物技术，如酶工程、蛋白质工程和酶分子的进化工程等。,本课程的教学目的是使学生了解如下内容：基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程和蛋白质工程等生物技术的基本原理和基本方法；生物技术在食品等领域的应用；国内外生物技术各领域发展的现状、发展方向及其对社会各方面的深刻影响。,教学目的,1认识食品生物技术的概念、种类及其对经济社会发展的影响；2熟悉食品生物技术五大工程的原理、技术和方法；3了解生物技术在农业及其它领域的应用和成果；4了解国内外生物技术发明创新保护与生物安全性政策法规。,教学要求,食品生物技术的基本概念、术语、基础理论和基本技术;食品生物技术在科技教育、科学研究和生产领域中的应用;使学生全面掌握食品生物技术的基本知识和基本技术，并与相关学科有机衔接，使其融会贯通，进一步系统化而形成完整的知识和技术体系。,课程讲授的重点,要舍得花时间，要长期投入。扎扎实实学好每一章节，课后及时复习。动手：上课记笔记，做作业及思考题。注意：抄一遍比看10遍心里更踏实。阅读王镜岩编生物化学中的相关章节。绝对有好处！善于总结所学知识，前后联系，真正学会！重视实验课，巩固课堂知识。,具体学习方法,课程类型：专业限选课总学时：32学时上课考勤：40%课后作业：20%考试：40%,考试考核方法,第一章绪论,生物技术概述食品生物技术概述,重点掌握1、现代生物技术的概念2、生物技术的发展史3、食品生物技术概念、研究内容,克隆羊多莉,转基因延熟番茄,人类对自然界的要求认识利用再造改造创造现代生物学技术的发展也为科学研究提出了新的研究思路和方法。传统生物技术是根据生物的性状，找到有关的蛋白质，再确定其基因；现在可以先分离特定蛋白推测其基因或直接分离其基因，经克隆测序、表达，再研究其功能。这一过程与传统生物学相反，故称反向生物学。随着反向生物学的问世,在20世纪八十年代诞生了生物技术(Biotechnology)这门新学科。,生物技术学科的地位世界新技术革命的主角之一,生物技术与新材料,信息技术(包括微电子、计算机)一起已成为新产业革命三大支柱之一；阳光技术，朝阳产业，黄金工程，倍受世界各国重视。生物技术将成为21世纪高技术革命的核心内容。,生物技术的重要性有助于解决全球的重大难题：资源（能源）、人口、粮食、生态环境、健康与疾病和战争与灾害；促进传统产业的技术改造和新产业的形成，对人类社会生活产生深远的革命性影响；生物技术这一新生事物正迅速走向老百性日常生活各个方面,将对人类的发展做出贡献。,一、生物技术的定义及内涵,生物技术(Biotechnology,BT),亦称为生物工程（bioengineering),现统一称:生物技术。,1、定义现代生物技术代表着高新技术，但至今还没有一个统一的定义。而从学术方面对生物技术下定义是在20世纪的事（一）Biotechnology术语的诞生1919年一位匈牙利农业经济学家KarlEreky首创了“Biotechnology”一词目的：表达一切用生物转化手段进行生产的概念，并表明生物学与技术之间的内在联系（二）国际纯粹及应用化学联合会的定义（1982）生物技术是将生物化学、生物学、微生物学和化学工程应用于工业生产过程及环境保护的技术。,（三）国际经济合作及发展组织的定义（1982）生物技术是应用自然科学和工程学的原理，依靠生物催化剂(酶或活细胞)的作用对物料进行加工，以提供产品为社会服务的技术（四）1985年Moo-Young主编的综合生物技术中的定义生物技术是对生物作用和生物物料加以评价和应用，并进行工业产品生产的技术生物技术是指应用生物科学及工程学原理，依靠生物体系作反应器，将物料进行加工改造，获得人类所需产品的技术。,现代生物技术定义：以现代生命科学为基础,把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料,产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。,2、要点:,对象是具遗传特性有生命物质:包括病毒、细菌、植物、动物、直到人类。生物体系多个不同水平研究:从大分子(DNA、RNA、蛋白质、酶)、亚细胞、细胞、组织、器官到整个机体。应用工程学原理:经人类思维,设计方案、定向修饰、加工制作过程等体外操作环节。,有目的产品:目的产品有三个新特征:新遗传功能、新遗传性状、新物种。要有合乎人类所需的工业、农业、医疗和食品产品。高新技术起重要作用。,3、生物技术的内容医学生物技术药学生物技术动物生物技术农业生物技术海洋生物技术微生物生物技术,4、生物技术的上中下游,上游工程：实验室研究和开发阶段，包括基因、细胞、干细胞、转基因生物、组织工程等获得优良菌株、细胞系或固定化的菌体等。中游工程：中游加工以生物反应器为中心，优化和放大生产工艺。下游工程：从反应液中提取目的产物加工精制成合格产品。,5、生物技术涉及的具体技术包括:,DNA重组、细胞培养及融合、抗体制备技术,干细胞培养及定向分化,显微注射技术,动物饲养技术,转基因技术,胚胎克隆,细胞及酶的固定化技术,发酵技术,生物反应器,蛋白质分离纯化,生物大分子合成及纯化,生物大分子修饰,生物物理、生物信息及其他相关领域技术。,二、生物技术的构成,基因工程,细胞工程,酶工程,蛋白质工程,发酵工程,（一）基因工程（Geneengineering）是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，也称DNA重组技术主要原理：以分子遗传学为基础，利用人工方法把生物的遗传物质分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的DNA导入某种宿主细胞中，从而改变它们的遗传性质。这种创造新生物并赋予新生物以特殊功能的过程称为基因工程,对象:在核酸分子(DNA或RNA)或基因上操作。定义:在体外对DNA进行切割、拼接,使遗传物质重新组合,经载体转移到细胞中扩增表达,获得人类所需产品,或组建新生物类型的技术。,（二）细胞工程（Cellengineering）基本原理体外大量培养技术、细胞融合技术(也称细胞杂交技术)、细胞拆分、染色体工程和繁殖生物学技术等,定义:,指在体外条件下对细胞进行培养、繁殖，按人们的意愿改变细胞某些生物学特性，获得有用的产品或达到改良生物品种的技术。,对象:细胞,在细胞水平上实现基因转移或改变生物学性状。,细胞工程,授体基因,(大肠杆菌),(干扰素基因),受体基因,重组基因,植入受体细胞核(大肠杆菌，酵母菌),发酵,分离,生物药剂（干扰素、胰岛素等）,废液,（三）发酵工程（Fermentationengineering）主要原理包括微生物生长动力学，发酵条件的优化和控制，生化反应器的设计，以及产品的分离、提取和精制等技术,对象:微生物在常规发酵工艺上发展而成。有时也称微生物工程。定义:利用微生物特定性状（生长快、培养简单和代谢过程特殊等）,通过现代化工程技术,快速、连续生产人类所需物质的技术。,要点:核心是提高产率,过程包括:菌种选育、生产、代谢产物的利用。所用技术包括大规模悬浮培养,细胞固定化,产物分离提取。应用:药物生产(活性多肽、抗生素)、单细胞蛋白生产、环境保护、微生物冶金技术。,（四）酶工程（Enzymeengineering）主要原理酶固定化技术、细胞固定化技术、酶化学修饰技术和酶反应器设计等技术,对象:酶分子修饰、生产应用和酶的固定化,定义:利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。,（五）蛋白质工程（Proteinengineering）对象:基因序列DNA分子中改造,最终导致蛋白分子氨基酸序列改变。,定义:蛋白质工程，是以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。,核心:蛋白质空间结构,DNA重组,人工定向改造蛋白质功能域构象,使得功能改变。这被称为是生物技术发展的第二浪,如通过增加或减少人工二硫键、置换氨基酸等修饰技术,提高或改变活性多肽(激素、酶、细胞因子)的稳定性。,三、生物技术各构成成分之间的关系生物技术中的五大工程之间是相互依赖、密切联系、难于分割的。在现代生物技术中基因工程是核心技术，但是基因工程包括蛋白质工程所提供的新的、具有特殊功能的细胞，还必须通过发酵工程或细胞工程来实现它的潜在的经济价值。酶工程中固定化酶和固定化细胞技术，它本来就是从发酵工程中分离出来的一部分，也是同发酵工程密不可分的技术。细胞工程中的动物和植物细胞大量培养技术原理类似于发酵工程。蛋白质工程是酶工程中酶的分子修饰同基因工程相结合的产物,一、传统生物技术生物技术的发展与食品发展的历史是密不可分的，对促进人类社会的文明发展有着非常重要的意义，其发展简史如下：BC6000年，古埃及人和古巴比仑人利用微生物发酵生产酒精；我国也在石器时代后期，开始利用谷物酿酒；BC4000年，古埃及人开始用酵母菌发酵生产面包；BC221年，周代后期我国人民开始制作豆腐、酱油和醋,四、生物技术的形成和发展,1865年当时属奥地利的布隆（Brunn）基督教修道院的修士格里高孟德尔（GregorJohannMendel），根据他8年植物杂交实验的结果，2月8日在当地的科学协会上宣读了一篇题为“植物杂交实验”的论文，1866年正式发表在该协会的会刊上。,但这一伟大的发现被搁置了35年，孟德尔临终前说：“等着瞧吧，我的时代总有一天要来临”,1900年，孟德尔定律的二次发现（1）荷兰阿姆斯特丹大学的教授狄夫瑞斯（deVries）他进行了月草杂交试验，发现F2的分离比为3:1。1900年3月26日其论文“杂种分离法则”发表在德国植物学会杂志。狄夫瑞斯曾从L.H拜莱的植物育种中查到孟德尔的工作。他在德文版中提到了孟德尔的工作，但在法文版中却只字未提。,（2）德国土宾根大学的教授科伦斯（Correns,C.E）他于1900年4月21日阅读了狄夫瑞斯法文版的论文，发现其结论和自己的实验结果相同，尽管文中未提到孟德尔，但科伦斯已从老师未格里处知道了孟德尔的工作，于是他撰写了“杂种后代表现方式的孟德尔法则”一文，1900,4,24日发表在德国植物学会杂志(18)158-168。这对重新发现孟德尔法则起了重要的作用。,（3）奥地利维也纳农业大学的讲师切尔迈克(Tschermak)他也作了豌豆杂交试验，发现了分离现象，撰写了“关于豌豆的人工杂交”的讲师就职论文，清样出来后他读到了狄夫瑞和斯科伦斯的论文，于是急忙投寄论文摘要，于1900，6,24日也发表在德国植物学会杂志。三个人的工作都发表在德国植物学会杂志，都证实了孟德尔法则。以上3位植物学家几乎同时证明了孟德尔遗传规律，从此揭开了遗传学研究的新纪元。,HugodeVries(1848-1935)狄夫瑞斯,CarlErichCorrens(1864-1933)科伦斯,ErichvonTschermak(1871-1962)切尔迈克,1885年，巴斯德（LouisPasteur)首先证实发酵是由微生物引起的，并建立了微生物纯种培养技术；20世纪20年代，工业生产中大规模采用纯种培养技术发酵生产丙酮和丁醇；同时代，AlexanderFleming爵士发现了青霉菌可以产生青霉素，50年代青霉素大量生产，为人类疾病治疗做出了巨大贡献，同时带动了发酵工业和酶制剂工业的发展；以上属于传统传统意义上的食品生物技术，也是近代生物技术的建立和全盛时期。,细菌的发现,我们已经知道,单个的细菌是十分微小的,它们的奥秘是怎样被发现的?细菌的发现者是谁?他为什么能发现细菌?,细菌的发现者是谁?,17世纪的荷兰人列文虎克并非职业科学家，但是他十分热衷自己制造显微镜经过几年的努力，他制造了能放大300倍的显微镜，是世界先进水平,列文虎克用自制的显微镜观察河水、人的精液、人的牙垢等，发现了一个新的世界,他为什么能发现细菌?,他是怎样让世人知道他的发现的?,列文虎克把自己的发现仔细记录下来他把观察结果寄给了当时的权威科学机构英国皇家学会，从此名扬天下，被誉为细菌学的开创者,他的成功是偶然的吗？,他善于发现和提出问题:微小的世界是怎样的?制定实施实验计划:自制显微镜,坚持观察各种微小物体60年,做详细记录善于表达和交流:把观察结果寄给英国皇家学会他的做法就是一个标准的科学探究过程他还发现了毛细血管、人类的精子、多种原生动物，成功绝非偶然遗憾：微生物从哪来？自然发生说,微生物学之父：法国人路易斯巴斯德,巴斯德以严谨的科学精神向世人揭示了细菌的许多秘密。例如，细菌不会在自然界凭空出现,著名的巴斯德鹅颈瓶实验让认为细菌是自然产生的人彻底闭嘴,鹅颈瓶实验的启示：1细菌可以用高温杀灭；2经杀菌的食物不接触细菌就不会腐败,鹅颈瓶实验原理的应用,1、外科手术用具的消毒，挽救了许多病人的生命,鹅颈瓶实验原理的应用,2、巴氏消毒法，这种灭菌法由巴斯德发明,因此得名。牛奶、啤酒和葡萄酒、罐头等，加热到7080维持530分钟，就能消灭绝大部分细菌，但不会影响味道和营养。,传统生物技术有如下特点：主要通过微生物初级发酵获得产品，仅仅局限在微生物发酵和化学工程领域。没有改变微生物的遗传物质，也没有出现新的微生物遗传性状。生产过程简单，上游主要是培养大量的微生物、对粗材料进行加工即进行发酵和转化，通过诱变选育良种，下游主要对产品进行纯化。生产周期长，费用高，产量低，效率差。,二、现代生物技术自1953年起，分子遗传学的兴起与发展，DNA转移和重组工程转基因技术：细胞工程转基因药物转基因动植物无性繁殖，克隆技术,改变生物的遗传性状,使分离高产量的工程菌变的容易,简化了生产过程；扩大了反应器范围，从发酵罐发展到细胞、植物及动物个体天然生物反应器。,特别是DNA重组技术可以,20世纪80年代，现代生物技术的发展日新月异，一跃成为代表21世纪新技术的发展方向，并成为具有广阔应用前景的新兴学科与产业。传统生物技术已被现代生物技术所取代，当前生物技术一词实质上已成为现代生物技术的简称。,现代食品生物技术的发展,R.Franklin简并序列是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：GTYRACY=C或TR=G或AYR=CG或CA或TG或TAHin实际上可以识别4个特定序列。3.识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的(某些酶识别位点在切割位点附近),即产生特定的DNA片段，这是与型酶的区别之一。Hga识别位点GACGC5/10(核苷酸距离)dsDNA上切割5GACGCNNNNNNNNNN33CTGCGNNNNNNNNNN5先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为Distantcleavage,(三)限制酶的切割位点：限制性对dsDNA2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口：1形成平头末端（flush或bluntend）在识别序列对称轴处平齐切割DNA两条链而形成的平头双链末端。如TCGA-smabsuRorTC3+5GA-AGCT-Alu-AG5+3CT-2.形成5粘性末端（5cohesiveend即3延伸末端）5-GAATTC3EcoR5-GAATTC-3+3-CTTAAG53-CTTAAG-53.形成3粘性末端（3cohesiveend）5CTGCAG3pstG-35-CTGCA+3GACGTC5ACGTC-53-G粘性末端（stickyend）限制酶切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端。,二DNA连接酶：DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。（二）来源噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD（1KD=1000道尔顿）。（三）催化反应：（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）,三、逆转录酶（一）概述逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove从鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan从劳氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分别各自发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retrovirus）生产循环中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆转录mRNAcDNA（complementoryDNA）。使用该酶可以获得目的基因，也可以用来标记cDNA作为放射性探针.（三）商品化逆转录酶有两种AMV（禽成髓细胞瘤）Mc-MLV(鼠白血病病毒)。,四、DNA聚合酶：DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大肠杆菌DNA聚合酶（E.coliDNApol）1956年，A.kornberg首先从E.coli中分离得到。是由1条多肽链组成的球蛋白直径65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接头折叠成两个区域含1945螺旋结构，分子中有单链巯基，每分子含1个Zn2原子，还不能证明Zn2参加了催化反应，酶活性中心有3个密切相连的结合位点即DNA核模，核苷磷酸（估计引物，生长链痘结合在这里）和dNTP(脱氧核苷三磷酸)结合位点。1E.coliDNApol由大小两亚基组成，具有3种酶活性，即大亚基53DNA聚合酶，35外切酶及小亚基的53外切酶活性：（1）53DNA聚合酶活性以ssDNA为模板，沿引物3OH方向，按模板顺序从53延伸。5CCGATAOHE.coliDNApol5CCGATAGCCT33GGCTATCGGA5Mg2dDNP3GGCTCGGA5（2）35外切酶活性即从游离的3OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证DNA复制的忠实性。其dsDNA外切活性可被53聚合活性所抑制。5CGCATCG-OH3E.coliDNApol5CGC3GCGMg23GCGdAdTdCdG（3）53外切酶活性：从游离的5端降解dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA杂交体RNA成分（具有RnaseH活性）5CTCATTAG3E.coliDNApol5CATTAG3GCGTAATC5Mg23GCGTAATC+pC,pG,（二）大肠杆菌DNA聚合酶的大片段Klenow片段酶基因工程很多情况下，E.coliDNApol可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApol所得到的。1.Klenow大片段是一条多肽链，MW76KD，保留了E.colipol的53DNA聚合酶，35外切酶活性。2.Klenow在基因工程用于：(1)补平用限制酶消化dsDNA得到的5粘性末端（即3延伸末端）5G-OHKlenow,Mg25GAATT3CTTAADntp3CTTAA(2)同（1），填平过程中，用32pdNTP标记DNA片段3末端。(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二条链。,五核酸酶常用的是单链特异的SI核酸酶（核酸酶SI,nucleaseSI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nucleaseSI，SI，常用的核酸酶)1.来源源于米曲霉素（aspergillusoryzas）2.酶作用底物ssDNA、ssRNA、dsDNA、或DNA-RNA杂交链。3.酶活性有低、中、极高3种情况变化(1)降解ssDNA或ssRNA形成5p末端的单或寡核苷酸，对DNA活性强于RNA(2)中量SI可从切口（Nick）或小缺口（smallgaps）处降解dsDNA，(3)极大量的SI才能讲解dsDNA或DNA-RNA杂交链，原因是后者对SI讲解有抗性，所以SI又称单链特异的核酸酶。在基因工程中用于：去除DNA片段的粘性末端而产生平端。打开cDNA中的发夹环，使其成平端。分析DNA：RNA杂交体结构，可证明基因内部内含子的存在（当一条DNA与它的mRNA杂交时，如果杂交链中有RNAloop环，SI可切开这个环，这是基因中有间隔顺序证明。,六、碱性磷酸酶（alkalinephoptase,APE）APE包括BAP（细菌碱性磷酶和CIP（小肠碱性磷酶）。功用如下：（一）去除DNA、RNA和dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的5磷酸根。（二）去除5-P，防止DNA片段或载体自身环化。（三）32p标记5末端前，先用其去除DNA或RNA上的5-P。,几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用,2.2基因载体的选择与构建,一、载体的功能、特征及质粒载体二、噬菌体载体与黏粒载体,一、载体的功能、特征及质粒载体,克隆载体（clonyvector）：具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。,目前基因工程中常用的载体有：细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体等。,一）载体的功能,1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件,二）载体应具备的特征条件,1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记,多克隆位点(是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。),ori,复制起始点,遗传标记(又称标记基因),Amp,polylinker,基因载体,三）质粒（plasmid）,质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）。不是细菌生长所必需的可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力分子量在1-200kb之间,1、质粒的基本特性,（1）自主复制性,携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制,（2）不相容性,同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存,（3）可扩增性,质粒就其复制方式而言分为两类松弛型复制严谨型复制,（4）可转移性,在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。,2、质粒载体的构建,（1）天然存在的两种质粒,A、colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cellB、pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell,（2）质粒载体人工构建的目的,天然质粒存在缺陷不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建,方法:重组，“拼拼接接，挖肉补疮”,（a）加入合适的选择标记基因（b）增加或减少合适的酶切位点（c）缩短长度，增加装载量（d）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（e）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件,pBR322质粒载体的构建,pUC18-19质粒载体的构建,以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z区组入一个多克隆位点,pUC18-19的构建,农杆菌Ti质粒载体的构建,设计原理:保留T-DNA两侧的边界序列,插入选择性标记,除去致瘤基因和无关基因.共整合质粒载体:将T-DNA区段编码致瘤基因和冠瘿碱合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片段取代,当携带目的基因片段的pBR322衍生中间载体进入农杆菌细胞后,两者相同的pBR322序列之间发生同源交换,导致外源目的基因片段整合到Ti质粒上.,外源片段共整合到Ti质粒上的过程,3、质粒的制备,实验室一般使用两种方法制备质粒,（1）碱裂解法（2）沸水浴法,（1）碱裂解法,原理：利用溶菌酶在NaOH与SDS的混合溶液中破坏细菌外壁，RNA酶降解，然后过柱，再进行洗脱。去除染色体DNA及变性蛋白质。,特点：质粒较纯，收得率高，繁琐，且有开环现象,（2）沸水浴法,特点：质粒不纯，收得率低，且制备规模小，但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。,1沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA(1)在Eppendorf管中加入110ml的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml)溶液,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.(3)迅速放置于常温下15000rpm离心15分钟.(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇(注意不同样品管中的溶液平衡),充分混匀后15000rpm离心15分钟.(5)弃上清液,沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗涤上述所得DNA样品,完毕后弃上清,管子倒扣10S左右,然后将DNA沉淀凉干.(6)沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解,样品可取5ml酶切电泳分析或待用.,2碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA(1)取1.5ml过夜细菌培养液于1.5ml离心管中,于台式高速离心机中以15000rpm,常温离心30秒,弃去上清液并将离心管倒扣在滤纸上.(4管/组)(2)在离心管中加入100ml溶液I悬浮菌体,涡旋振荡,以充分悬浮菌体成均匀悬浮液.(3)加入200ml溶液II,扣上离心管盖,立即轻轻混匀(来回颠倒数次),至溶液几乎澄清,成淡黄色透明粘液状.(4)打开离心管盖,加入150ml溶液III,轻轻混匀(来回颠倒数次),看到淡黄色消失,有大量白色沉淀生成,然后离心.(5)常温15000rpm离心10分钟,小心吸取上清液于另一离心管中.注意,不要把白色絮状物混入上清液中.(6)清液中加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各200ml),充分混匀,常温15000rpm离心10分钟,小心将上清液转移至另一离心管.注意不要将下层有机相混入上清液中.(7)在上清液中加入-20冷冻的异丙醇600ml,充分混匀,常温15000rpm离心10分钟.,(8)小心倾去上清液,注意避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉.加入400ml75%的冰乙醇,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干.(9)加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA,可在37保温510分钟.(100ml/管,4管)(10)合并于一管,加入2mlRNase,37保温30分钟,取5ml电泳检查消化彻底否.(以电泳前端无RNA条带为准)(11)RNase消化完全后加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各300ml),充分混匀,4,15000rpm离心15分钟,将上清液转移至另一离心管.(12)在上清液中加入0.1倍溶液体积的3M,pH5.5KAc(约40ml),400ml的20冷冻的异丙醇,充分混匀,4,15000rpm离心20分钟.(13)用400ml75%的冰乙醇洗涤一次,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干,待用.(14)如需定量或检测制备的质粒DNA的质量,可取适量质粒DNA进行适当稀释,测定OD260nm和OD280nm值,计算OD260nm/OD280nm的比值.质粒双链DNA量可以1OD260nm=50mg/ml计算.OD260nm/OD280nm应为1.8左右.,1)用限制性内切酶消化DNA样品2)用限制性内切酶消化质粒DNA3)连接样品DNA和质粒DNA的消化产物4)用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞5)涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选,4、典型的质粒克隆技术,1）用限制性酶消化DNA样品,粘性末端,2）用限制性内切酶消化质粒DNA,3）连接样品DNA和质粒DNA的消化产物,冷循环器,4）用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,转化细菌有两个基本方法。一是化学法，即用CaCl2处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。,5）细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选,筛选会有三种结果：一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成；二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落；三是要插入的序列与质粒相连，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。,筛选结果,蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的LacZ序列编码的功能性的片段白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上LacZ序列上有插入片段,筛选结果模式图,蓝菌落,蓝白菌落,筛选白色菌落,二、噬菌体载体与黏粒载体,一）噬菌体载体,噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和-DNA组成,噬菌体(电镜图）,1、-DNA的物理图谱,-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。,2、感染周期,噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入：,（1）吸附（2）DNA注入（3）DNA复制,（4）包装:只能包装-DNA分子的75%-105%即包装范围为36.4kb-50.9kb的DNA,（5）裂解,吸附,穿入,生物合成,成熟、释放,毒性噬菌体的溶菌性周期,噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。,二）DNA载体的构建,建立克隆载体前需要解决两个问题：1）DNA分子只能增加5%的大小，即只能插入3kb的DNA分子。2）基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因组。,.缩短长度缩短多余片段提高装载量。,（a）插入型载体,（b）取代型载体,.修饰酶切识别位点,多余的酶切位点必须被修饰自然选择法,通过自然选择法筛选无EcorI识别位点的-噬菌体,三）-DNA的抽提,大肠杆菌培养至对数生长期2)加入-噬菌体或重组-噬菌体悬浮液，37培养1hr3)用新鲜培养稀释，继续培养4-12hr4)高速离心，沉淀噬菌体5)