（细胞生物学专业论文）arf对miz1抑制p53转录活性的阻抑作用.pdf

中文文摘 中文摘要 虽然我们知道含有p o z ( ap o x v i r u sa n dz i n cf i n g e r ) 结构域的转录因子m i z 1 即m y c 结合的锌指蛋白1 ( m y c i n t e r a c t i n gz i n cf i n g e rp r o t e i n 1 ) 的主要功能是 参与m y c 的转录抑制，但有关m i z 1 的其他调控作用却所知甚少。利用酵母双 杂交系统，我们鉴别到人源的a r f ( p 1 4 a r f ) 是m i z i 的一个新的相互结合蛋 白。m i z - 1 的锌指结构域涉及与a r f 的结合。另外，我们也发现m i z 1 可以与 p 5 3 的d n a 结合结构域( d b d ) 直接结合，从而减少了p 5 3 与它的靶基因的启动 子的结合并抑制了p 5 3 介导的基因转录作用。有趣的是，m i z 1 对p 5 3 转录的抑 制并不需要a r f 和m d m 2 的存在。更重要的是，a r f 与p 5 3 二者通过与m i z - 1 的竞争性结合来调节p 5 3 的转录活性，体外的结合实验以及使用p 5 3 的内源靶 基因b a x 和p u m a 的启动子而进行的竞争性的c h i p 实验都证实了这个结果。因 此，我们的研究揭示了m i z 1 作为p 5 3 功能的抑制子是通过干扰p 5 3 与其靶基因 的d n a 结合功能，而a r f 可以通过与m i z 1 的直接结合反转这种抑制作用，从 而达到保护和和活化p 5 3 的作用。综合以上结果，我们认为m i z 1 是肿瘤抑制 途径a r f p 5 3 途径中新的中介子。 关键词：p 5 3 ，m i z 一1 ，p 1 4 a r f ，蛋白蛋白相互作用，转录表达调控 v 1 i a b s t r a c t a b s t r a c t a l t h o u g hm i z - 1i sk n o w n t ob eap o z z i n cf i n g e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o rr e q u i r e df o r m y ct r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s i o n ，a d d i t i o n a lr e g u l a t o r yr o l eo fm i z 一1h a sr e m a i n e dl e s s u n d e r s t o o d h e r ew er e p o r tt h a tb yy e a s tt w o h y b r i ds c r e e n ，p14 a r fw a sf o u n dt ob e an o v e li n t e r a c t i n gp a r t n e ro fm i z 一1 t h ez i n cf i n g e rd o m a i no fm i z 一1i si n v o l v e di n i t sb i n d i n gt oa r f i na d d i t i o n ，w ef o u n dt h a tm i z - 1w a sa b l et oi n t e r a c tw i t hp 5 3 t h r o u g hi t sd n ab i n d i n gd o m a i n ( d b d ) ，t h u st od i m i n i s ht h eb i n d i n go fp 5 3t oi t s t a r g e tp r o m o t e ra n di n h i b i tp 5 3 - m e d i a t e dg e n et r a n s c r i p t i o n t h i sm i z 一1 一r e g u l a t e d p 5 3t r a n s c r i p t i o n a ls u p p r e s s i o nd o e sn o tr e q u i r et h ep r e s e n c eo fa r fo rm d m 2 i m p o r t a n t l y , a r fa n dp 5 3w e r ef o u n dt oc o m p e t i t i v e l yb i n dt om i z 一1i nr e g u l a t i n g p 5 3 - m e d i a t e dt r a n s c r i p t i o n ，a n dt h i sc o n c l u s i o nw a sv e r i f i e db yc o m p e t i t i v ec h i p a s s a yu s i n gab o n af i d ep 5 3e n d o g e n o u sb a xp r o m o t e r t h u so u rs t u d yr e v e a l st h a t m i z 一1i sap 5 3s u p p r e s s o rb yi n t e r f e r i n gw i t hp 5 3d n a - b i n d i n ga b i l i t y ，a n da r fw a s a b l et oc o u n t e r a c tt h es u p p r e s s i o no fm i z - 1o np 5 3b yd i r e c tb i n d i n gt om i z 一1 ， s u g g e s t i n gt h a tm i z - 1i san o v e lm e d i a t o ri nt h ea r f p 5 3p a t h w a y k e yw o r d s ：p 5 3 ，m i z - 1 ，p i4 a r f , p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n ，t r a n s c r i p t i o n 缩略语 缩略语 c d k c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e c k ic d ki n h i b i t o r c d k n 2 a c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r2 a m t s l m u l t i p l et u m o rs u p p r e s s o r1 i n k 4 a i n h i b i t o ro fc y c l i n - d e p e n d e n tk i a n s e4 a a f u fa l t e r n a t i v er e a d i n gf r a m e p o zp o x v i r u sz i n cf i n g e r b t b b r o a d - c o m p l e x ，t r a m t r a c k ，b r i c - a b r a c m e fm o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s n f k b n u c l e a rf a c t o r x b p o k e m o np o ke r y t h r o i dm y e l o i do n t o g e n i cf a c t o r d m p l c y c l i n d - - b i n d i n gm y b - l i k ep r o t e i n a p 1 a c t i v a t i n gp r o t e i n - 1 r br e t i n o b l a s t o m ap r o t e i n b i l l hb a s i ch e l i x - l o o p _ h e l i x m d m 2m u r i n ed o u b l em i n u t e2 p c n ap r o l i f e r a t i o nc e l ln u c l e a ra n t i g e n u a s u p s t r e a ma c t i v a t i n gs e q u e n c e t f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r h v s h y a i o i dv a s c u l a rs y s t e m c h k l c h e c k p o i n tk i n a s e1 a t ra t ma n dr a d 3 r e l a t e d n p m b 2 3 n u c l e o p h o s m i n p t r f p o l y m e r a s eia n dt r a n s c r i p tr e l e a s ef a c t o r s u m 0 1 s m a l lu b i q u i t i n - l i k em o d i f i e r1 w r nw e r n e r sh e l i c a s e t at r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n d b d d n a bi n d i n gd o m a i n a da c t i v a t i o nd o m a i n m i z 1 m y c - i n t e r a c t i n gz i n cf i n g e rp r o t e i n - 1 i n ri n i t i a t o re l e m e n t d o xd o x o r u b i c i n i p i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w bw e s t e r nbl o t c h i pc h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ， g s t g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e r n a ir n ai n t e r f e r e n c e s h r n as m a l lh a r p i nr n a g f pg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r t p c r r e t r o t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n v 中国科学技术大学学位论文原仓l j i l 生声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名：签字日期： 垆i o g tp 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入中 国学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 d 公开口保密( 年) 作者签名： i l 导师签名：墨膨 冬边 签字日期：兰? ! ：乡! 第一章背景综述 第一章背景综述：抑癌基因a r f 细胞增殖失控和凋亡障碍导致细胞周期调控异常被认为与细胞癌变密切相 关，所以肿瘤也被认为是一类细胞周期疾病( c e l lc y c l ed i s e a s e ) 。其中癌基因或抑 癌基因对细胞周期正负调节的失控导致细胞异常增殖是细胞癌变的重要原因之一。 癌基因编码的蛋白能够促进细胞生长或促使细胞绕过衰老途径达到永生化。例如， r a s 癌基因就是在大约三分之一的癌细胞中都被激活。抑癌基因是一类抑制细胞增 殖及癌变的基因，可以阻止癌蛋白发挥作用，同时也是调节生长和分化的正常基 因：参与细胞周期的调节、控制细胞生长、在细胞周期的各个检查点确保没有异 常发生。最常见的肿瘤抑制基n l ! 虹l p l 4 a r f 、r b 、p 5 3 等。由于抑癌基因在部分肿 瘤中频发失活，如p 5 3 基因是大多数人类肿瘤中突变，失活或缺失频率最高的基因， 它们对肿瘤的发生发展及预后起着重要作用。其中玳k 4 a a r f 是继p 5 3 和r b 等 数十个抑癌基因之后发现的具有独特的细胞调控作用的抑癌基因：它同时编码2 个蛋白p 1 6 i n k 4 a 和p 1 4 a r f ，均为细胞周期调控因子，分别通过p r b 和p 5 3 j 固路履 行调控细胞周期的职能，受到广泛的关注，是目前细胞周期调控冈子的研究热 点之一。也是我论文研究的重要对象，在这篇背景综述中，我将对抑癌基冈a r f 做系统和详细的阐述。 第一节i n k 4 a a r f 基因位点 1 1i n k 4g e n ef a m i l y 细胞周期是由细胞周期素( c y c l i n ) 、细胞周期素依赖蛋白激酶( c d k ) 和细 胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋e i ( c k i ) 来进行调控的。c k l 分为两类：k 4 和k i p 家族。i n k 4 基因家族编码4 种1 5 1 9 k d a 的蛋白：p 1 6 i n k 4 a ( s e r r a n o e ta 1 ，1 9 9 3 ) ， p 1 5 i n k 4 b ( h a n n o n a n db e a c h ，1 9 9 4 ；g u a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) ，p 1 8 i n k 4 c ( g u a ne ta 1 ， 1 9 9 4 ；h i r a ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ，和p 1 9 i n k 4 d ( h i r a ie ta 1 ，1 9 9 5 ；c h a n e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，它们分 别于1 9 9 3 1 9 9 5 年间被发现。对p 1 6 i n k 4 a ，p 1 9 i n k 4 d 与c d k 6 结合的复合物及 p 1 8 i n k 4 c 结构的n m r 和结晶图像学的研究证实所有i n k 4 蛋白具有相似的结构， 彼此间有近4 0 的同源性，但是在不同物种间各个成员是高度保守的，例如小鼠 第一章背景综述 中的i n k 4 家族蛋白与人类中的相关蛋自的相似性高选9 0 ( m a r t l n e ，1 9 9 9 ) i n k 4 基因蛋白均含有数个维持其活性所必需的类锚蛋白重复片段 ( a n k y r i n l i k er e p e a t s ) ，i n k 4 a 和i n k 4 b o ? 有4 个而i n k 4 e 和i n k 4 d 中含有5 个， 由3 0 7 个氨基酸组成，功能与蛋白之间的相互结合有关。程序化突变的研究结果表 明第3 个类锚蛋白重复序列对i n k 4 蛋白和c d k 4 和c d k 6 结合至关重要。 燃w k 潴” 二二 ji l 4 帏 _ 霸l h 帅- j ，1 9 i n w _ 一m 岬n m s - + i a 目a 蛐g a m e n t 1 3 8g d 孙 ， 2 1 6 6 窜d 1 3 图1 - 1i n k 4 基因结构和人染色体定位 ( f r o m m 叭m e f r o u s s e l t1 9 9 9 ，。n c o g 凯e 1 8 ，5 3 l h 5 3 1 7 ) i n k 4 家族的口1 6 i n k 4 a 、p l5 i n k 4 b 、p 8 1 n k 4 c f f f l p l 9 1 n k 4 d 由不同基因编码，约】5 1 9 k d a 。 i n k 4 基因蛋白均含有类锚蛋白重复片段，为其活性所必需。彼此间约有4 0 同源性。 i n k 家族的成员均是c d k 4 和c d k 6 的抑制因子通过与c d k 4 6 结合导致后 者的构型改变而无法与d 型c y c l i n s 结合，来抑s t c d k 馓酶的催化活性( s h e ha n d r o b e r t s ，1 9 9 9 ) 。它们彼此同源，尤其是p l5 1 n k 4 b 和p 1 6 1 n k 4 a 在氢基酸序列 上有8 5 的相似性生化差异也非常小。i n k 4 a 是i n k 4 基因四种亚型中最先被发 现的基因( 人类中亦称为c d k n 2 a 基因) ，编码p 1 6 i n k 4 a ，位于人9 q 2 1 位点，其 同源基因位点位于小鼠4 号染色体和大鼠5 号染色体上。附k 4 b 仅称c d k n 2 b ) 编码p l5 1 n k 4 b ，也位于人9 号染色体短臂，- 与9 q 2 1 串状排列。由于p 1 6 1 n k 4 a 基 因位点还编码另外一个蛋白a r f ( 我们将在后面详述) ，故这2 个相邻位点常被 称为n 咏4 扣a r f - i n k 4 b 基因位点。p 1 8 i n k 4 c 和p 1 9 n 啦4 d 功能和其类似分g 位 于1 q 3 2 和1 9 q 1 3 上。i n k 4 蛋白与c d k 4 和c d k 6 的结合从而抑制7 c d k 4 6 介导的 r b 及其家族成员p 1 3 0 、p 1 0 7 的磷酸化。维持了r b 家族蛋1 3 的非磷酸化状态，从 第一章背景综述 而促进与e 2 f 结合。转录吲子e 2 f 无法从r b 的结合中释放，从而阻碍e 2 f 转录因 子家族成员的转录( 使细胞进 d n a 合成朋) 的进行，使细胞分裂被阻滞十g 期，抑制了细胞的增殖。 l n k 4 a f s m u y p 1 9 嘣_ p 1 8 州t p 1 5 嘣4p 1 6 帐“ l c d kn y c u n d 世 上蔷，甾 蒿一弋。 图】o ：i n k 4 家族的蛋白通过与c y c l i a d 竞争结合c d k 抑制r b 蛋自造径，调节细胞周期 i p r o mt t i l p ：，w w u l e c l $ c a p e l 1 2i n k 4 a a r f 等位基因 1 2 1p 1 6 l n k 4 a p 1 6 1 n k 4 a 的发现 1 9 9 2 年在研究黑色素瘤的易感基因时，发现9 q 2 l 有一个抑癌基因所在位点 ( c a n n o n a l b r i g h te ta l ，1 9 9 2 ) ；次年在d n a 病毒s v 4 0 转化的成纤维细胞中发现了 个1 6 k d a 的耋；肽与c d k 4 紧密结台( x i o n g e ta l ，1 9 9 3 ) ；并且m c d k 4 作为诱饵进行 酵母双杂交筛选，寻找与之结合的蛋白时，找到的阳性克隆其e d n a 编码分子量 l5 8 4 5 的蛋白质，该蛋白被命名为p 1 6 i n k 4 a 蛋白( s e r r a n oe ta l ，1 9 9 3 ) ；1 9 9 4 年， k a m b 利用染色体步移法的物理图和序列标记位点图( s t s ) 研究肺癌、乳腺癌、膀 第一章背景综述 胱癌等多种细胞系，发现9 q 2 i 存在个与p 1 6 c d n a 序列相同的多肿瘤抑制基因，将 之命名为多肿瘤抑制子i ( m t s l ：m u l t i p l e t u m o rs u p p r e s s o r1 ) ，以后由h u g o 正 式命名为c d k n 2 。 i n k 4 a 是发现的第一个直接调控细胞周期井抑制细胞分裂的新型抑癌基因是 除p 5 3 基因之外人类肿瘤中最常见失括的抑癌基因，口】6 基因全长85 k b ，由两个内 含子分隔成3 个外显子，其中5 端第- j f 显了为1 2 6 b p ，第二外显子为3 0 7 b p ，3 端第 三外显予为1 1b p ；其编码的蛋白产物分子量约1 6 0 0 0 道尔顿，含有1 4 8 个氨基酸的开 放阅读框架；具有4 个锚蛋白重复序列，可阻滞细胞于g i 期。 蕊纛塞| | | | i | l | | 霉| l i 姆r 一+ _ a d 2 。一 。o r 一7 石r 躲黜：嚣篇黜。： 霉”! 。! ：? ! 登? 6 婴爱翟儿竺钟如! 1 5 a d 4 1 目1 - 3 ：p 1 6 i n k 4 a 序列同源性比对。均舍有4 十高度保守的锚蛋白结构域。 ( f r o ms h a r p l e s s t2 0 0 5 ，m u t a t i o nr e s e a r c h ，5 7 6 ：2 2 - 3 8 ) p 1 6 l n k 4 a l 搠控机理 与c y c l i n d 的结台后，c d k 4 6 的蛋白檄酶活性被撤活从而能磷酸化r b 蛋白， 释放e 2 f 1 。e 2 f 】是转录因子与d n a 合成密切相关的重要酶类基因如d n a 聚合 酶( p o l ) 、胸苷激酶( t k ) 、二氢叶酸还原酶( d h f r ) 均是它的转录靶基因， 这使细胞从g 1 进入s 期。而p 1 6 1 n k 4 a 词过与e y e l i n d 竞争结合c d k 4 6 来抑$ l c d k 4 6 的活性，从而导致r b 蛋白非磷酸化，非磷酸化的r b 与e 2 f l 的启动子结合，通过阻 断e 2 f 1 的反式激活域或引进组蛋白脱乙酰化酶( h d a c ) 抑制e 2 f - 1 的转录。故 通常我们认为p 1 6 i n k 4 a 主要调控r h 通路：p 1 6 1 n k 4 a - e y e l i n d c d k 4 r b e 2 f 。 p 1 6 1 n k 4 a 是抑癌基因 蚕兰耋薹霉 第一章背景综述 q u e l l e ( 1 9 9 7 ) 等在i n k 4 a 基因外显子2 中引入错义突变，结果发现p 1 6 i n k 4 a 与c d k 4 或c d k 6 的结合能力显著下降，细胞进入无限增殖状态。w a l k e r 在家 族性黑色素瘤细胞研究中发现i n k 4 a 基因功能缺失非常普遍，且大多数突变仅 局限于外显子l q 。s e r r a n o ( 1 9 9 6 ) 等通过基因敲除技术将小鼠中的外显子l q 敲除， 结果发现与对照组相比，自发肿瘤的比率显著增加。上述这些结果均有力证明 p 1 6 i n k 4 a 具有很显著的抑癌作用。 p 1 6 i n k 4 a 除了与肿瘤发病密切相关外，还与肿瘤发展及预后密切相关。 g e s s n e r 等对6 l 例进展期非小细胞肺癌( n s c l c ) 患者进行研究，发现p 1 6 i n k 4 a 表达缺失的患者平均存活期约为4 个月，而p 1 6 l n k 4 a 基因正常表达的患者存活期 大大提高约为1 5 个月，而且p 1 6 i n k 4 a 的表达缺失与肿瘤的浸润转移、抗凋亡密 切相关( 李军国，2 0 0 4 ) 。迄今为止人们已在黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、神经胶 质瘤、大肠癌、白血病、肾癌等多种人类恶性肿瘤中发现了i n k 4 a a r f 基因的 功能缺失。有资料表明，i n k 4 a 基因的失活主要与其外显子2 改变密切相关， 而此基因位点编码的另外一个基因产物a r f 的功能状态主要决定于外显子1 1 3 。但 外显子2 的改变是否影n 向p 1 4 a r f 的功能以及外显子1 d 的改变是否影n l 句p 1 6 i n k 4 a 的功能等问题尚须进一步探讨。 1 2 2a r f 在哺乳动物，单个基因位点构成两种不同读码框架，编码两种不同蛋白质 尚无先例。1 9 9 5 年q u e l l e 等在试图分离小鼠p 1 6 i n k 4 的实验中发现小鼠i n k 4 a 位点还编码一个蛋白质，它和p 1 6 i n k 4 a 共用第2 ，3 外显子，但读码框不同，翻 译成1 6 9 个氨基酸的特殊蛋白质，其产物被称为a r f ( a l t e r n a t i v er e a d i n gf r a m e ) 。 这使i n k 4 a a r f 基因位点成为目前发现的唯一的一段序列编码两个不同蛋白质 的位点。在人类、小鼠和大鼠基因组中，此基因位点有两套各自独立的启动子， 阅读不同的编码框，因此它们的蛋白质产物没有氨基酸序列的同源性，但两者 共享部分外显子( h a b e r ，1 9 9 7 ) 。虽然a r f 与i n k 4 a 的启动子序列很接近，但 前者c p g 岛的数量较多，t a t a 盒较少，提示基因的转录调节机制可能有所不同。 基因和蛋白质结构 a r f 位于人染色体9 p 2 1 而鼠的同源物位丁第4 对染色体，包含3 个外显子。 外显子l p ，位于外显子10 l 上游约2 0k b 区域，与1 n k 4 b 位点临近，和外显子2 剪 接成的m r n al ：l 二p 1 6 m r n a 略短，编码长度为1 3 2 氨基酸，分子量1 3 9 0 2 道尔顿 的蛋白，称为p 1 4 a r f 。p 1 4 a r f 阅读框到外显子2 终止，外显子3 为3 非翻译区。 5 第章背景综述 外显子l b ( 卜6 4 a a ) 编i q a p , f 的n 端，外显子2 ( 6 5 - 1 3 2 a a ) 编码c 端。小鼠a r f 的l b 外显子序列与人有6 0 的相似性，编码长度为1 6 9 氪基酸，分子j 1 9 2 3 8 道 尔顿的蛋白质，称p 1 9 a r f 。如前所述，虽然外显子2 和3 为p 1 6 1 n k 4 a 和p 1 4 a r f 共享。但是受外显子1 b 开放读码框起始密码的位置影响，使p 1 4 a r f 与p 1 6 i n k 4 a 氨基酸序列完全没有相似性。 人类和小鼠的a r f 均为富含精氨酸的疏水蛋白，等电点高达p h l 2 。这两个 蛋白之间的同源性为5 0 ，前1 4 个氪基酸中有1 1 个相同，这一区域拥有a r f 的 许多功能，包括核定位，结合m d m 2 等。l l 女n p l 9 a r f 缺失其n 来端2 6 _ 3 7 个氨基 酸残基和p 1 4 a r f 缺失其n 末端1 - 1 4 个氨基酸以及c 末端8 5 一1 0 1 的氨基酸残基均 可导致无法定位于核仁( q u e l l e ，1 9 9 5 ) 。虽然a r f n 端编码的蛋白几乎集中体现 了a r f 的功能，但拓扑异构酶i 和线粒体蛋f 刍p 3 2 c 1 q b p 却是与a r f 的c 端氨基 酸结合( 图l 一4 ) 。 霹豳| l | ! | 摊瓣鬻豳爨攀 图i o ：a r f 序列同源性对比圈。n 段的氨基酸主要负责与m d m 2 结合。 ( f r o ms h a r p l e s s ，2 0 0 5 ，m u t a t i o nr e s e a r c h ，5 7 6 ：2 2 。3 8 ) 表达和降解 a r f 蛋白广泛表达于组织细胞中在细胞分裂问期主要定位于细胞核仁颗 粒中，也有少数散布于核质。绝大多数正常组织中，a 盯表达水平非常低，但是 在异常促有丝分裂信号( 主要指一些原癌基因的异常表达，如m y c 、r 她瑟其突 变体) 的刺激下，a r f 被激活，表达水平升高t a r f 是一个相对稳定的蛋白半衰期大约在1 6 h 左右。p 1 4 a r f 和p 1 9 a r f 的 n 末端都可被多泛素化，它们的降解依赖蛋白酶体途径，b 2 3 可延缓它的降解。 应激条件下，a r f 在核质不均匀分布，a r f 的靶基因结台a r f2 - 2 9 位氨基酸将 吐晡麟燃 第一章背景综述 a r i ：拉 核仁a r f 的半衰期延长。与这一致，k o r g a o n k a “2 0 0 5 ) 等发现a r f b 2 3 复合物在核仁形成，阻止a r f 入核从而阻断a r f 的泛素化，a r f 的稳定性增强。 1 23i n k 4 a a r f 的生物学功能 目前关于a r f 的资料主要是来自对小鼠p 1 9 a r f 的研究报道( q u e l l e ，1 9 9 5 ) 。 a r f 并不直接干扰c d k 的功能，但是它能导致细胞周期g 】和g 2 期的停滞。研 究表明，a r f 和p 1 6 “a 一样也是肿瘤抑制基因。但与p 1 6 i n k 4 a 的不同的是， a r f 能够和p 5 3 的负调节园子m d m 2 ( i n u r i n ed o u b l em i n u t e2 ) 结台并使之降解，从 而恢复和稳定细胞中p 5 3 的水平，增强p 5 3 在g l _ s 和g 2 _ m 的监督作用，最 终使细胞阻滞于g 1 和g 2 期，导致细胞衰老或凋亡，抑制肿瘤的生长。 太多数癌细胞发生发展的条件是失活2 个重要的抻癌基因p 5 3 与r b 。而它们 分别被同一个基因位点i n k 4 a a r f 编码的两种不同蛋白p 1 6 i n k 4 a 和a r f 所特 异调控。p 1 6 i n k 4 a 和a r f 两者都是很重要的肿瘤抑制蛋白，它们彼此之间还相 互影响，它们的缺失、突变或启动子甲基化导致的表达缺失、降低或功能失活 均与肿瘤的发生发展有着直接和间接的关联。p 5 3 、r b 、i n k 4 瘌1 4 a r f 这四种 蛋白形成复杂的信号网络，在促癌因素作用时起着关键的监视作用：抑制细胞 分化、清除不可修复的受损细胞。由于p 1 6 i n k 4 a 和p 1 4 a r f 蛋白在功能上的相似 与协调性，决定了i n k 4 a a r f 基因位点具有重要的生物学意义。 长型唧 p 1 9 a r f 上 l p 5 3 上 0 1 6 i 4 l ，p 19 a r f e 翻 p 1 6 i n k 4 a j _ c y c l i nd c d k 4 6 l p f i b 上 g ta r r e s t 圈i - 5 ：i n k 4 a a r f 基因位点。 ( f r o mm a r t i n e ，1 9 9 9 ，o n e o g e n er1 8r5 3 1 l - 5 3 1 7 ) i n k 4 a r f 位点编码2 个免疫不相关的蛋白：p 1 6 i n k 4 a 和p l g a r f 。p 1 6 1 n k 4 a 由外显子 la 、2 和3 ( 黑色方块) 。p 1 9 a r f 由外显子l b 、2 和3 ( 网纹方块) 。p 1 6 i n k 4 a 结台并抑 第一章背景综述 制c d k 4 和c d k 6 从而阻止p r b 磷酸化，诱导g 1 阻抑。p 1 9 a r f 结合并抑制m d m 2 对p 5 3 的降解，导致g l 和g 2 细胞周期阻抑 第二节a r f 的功能和分子机制 正如前面所说，a r f 的功能研究的比较清楚的是其对p 5 3 活性的影响，从而 引起p 5 3 下游的功能，但随着越来越多的研究报告发表，我们发现a r f 是个很有 个性的特别的蛋白，它拥有众多的结合蛋白，其中也不乏肿瘤发生发展途径中 的重要蛋白( 除p 5 3 之外) 。这使得a r f 可以在p 5 3 途径之外更全面的对肿瘤起到 抑制作用。除此之外，a r f 的新功能也在不断的发现中。一般而言，把a r f 的功 能简单分成依赖p 5 3 和不依赖p 5 3 两种方式。 2 1a r f - p 5 3 途径：a r f 依赖于p 5 3 的功能 a i 讧最常被提及的就是与p 5 3 途径的关联。p 1 4 a r f 基因在细胞周期的调节和 细胞凋亡的诱导中具有重要作用。a r f 可通过p 5 3 依赖性途径引起细胞周期阻滞 和细胞凋亡。 2 1 1a r f 对细胞周期的调控作用 有文献报道当细胞中a r f 基因过表达时，细胞周期阻断在g 1 期与g 2 m 期，且此阻断作用主要依赖肿瘤抑制因子p 5 3 。当p 5 3 突变失活或被原癌蛋白中 和时，a r f 无法抑制细胞周期( p o m e r a n te ta 1 ，1 9 9 8 ) 。p 5 3 是众所周知的重要的 转录因子，被a r f 活化后的p 5 3 可以激活p 2 1 c i p l 及g a d d 4 5 ( g r o w t ha r r e s ta n dd n a d a m a g ei n d u c i b l e ) 基因的转录。g a d d 4 5 与p 2 1 c i p l 和p c n a ( p r o l i f e r a t i o n c e l l n u c l e a ra n t i g e n ) 结合，抑制细胞的增殖，将细胞周期阻断在g l 期和g 2 m 期。后 来有其他研究者发现，表达p 1 4 a i 讧的细胞可以在缺少功能性p 5 3 的情况下将细胞 阻滞在g 2 期。他们的试验还提示：p 5 3 对于p 1 4 a r f 诱导的g 1 期的“控制点”是必 需的，但对于p 1 4 a r f 诱导的g 2 期的阻滞不是必不可少的。p 1 4 a r f 口- 7 通过 p 2 l w a f l 的诱导和c d c 2 5 c 的失活，从而引起c d c 2 活性的抑制。 p 1 4 a r f 还通过p 5 3 非依赖性途径调节细胞周期和细胞凋亡。最近发现a r f 能与d n a 复制蛋白a ( r p a 3 2 ) 结合。当a r f 过表达或p 5 3 基因缺失时，a r f 与 r p a 3 2 结合加强，使d n a 合成速率下降，引起细胞周期s 期的阻滞( y a r b r o u g he t 8 第一章背景综述 2 1 2a r f 与细胞凋亡 哺乳动物细胞的凋亡通路主要有两种：一种是细胞表面死亡受体介导的细 胞凋亡，另一种是以线粒体为核心的细胞凋亡通路( k r a m m e r ，1 9 9 9 ) 。如图卜6 所示。a r f 介导的细胞凋亡主要依靠第二种捅亡通路。 礁 魈勺古 o # 4 一一 口 圈i - 6 ：细胞凋亡的两条通路- ( f o l i i ii g n e ya n dk i r r n l l l g r ，2 0 0 2 ) 研究表明a r f 并= | = 直接激活线粒体凋亡通路，而是通过活化p 5 3 而激活其靶 基因b a x ，导致线粒体释放细胞色素c ，从而触发下游一系列c a s p a s e 家族激酶的 级鞋活化，诱导细胞的凋亡。有报道称b a x 同a r f 一样，能介导m y c 诱导的凋 亡反应，抑带u m y c 转基因小鼠的淋巴瘤的形成，但b a x 缺失的前b 2 细胞就无法 诱导凋亡。但是b a x 抑瘤作用依赖p 5 3 而和a r f 无关。b a x 的缺失井不影响m v c 转基因小鼠淋巴瘤中a r f 的缺失频率，也不改变a r f 缺失的小鼠肿瘤形成率。 这说明m y c 转基因小鼠淋巴瘤中b a x 与a r f 不在同一个调控通路上，或者说 第一章背景综述 b a x 与a r f 虽然在同一个调控通路，但b a x 与a r f 没有直接的相互作用 ( e i s c h e ne ta 1 2 0 0 i ) 。 可以激活线粒体拥亡通路的还有很多其他的蛋白，如s m a c ，d i a b l o ，它也 是线粒体蛋白，在凋亡时释放到胞质，- 与c y t o c 的释放极为相似。s m a d d i a b l o 能够与 a p s ( x i a p 、c i a p c i a p 2 和s u r v i v i n ) 结合并活化c a s p a s e 一9 ，还 能诱导p r o c a s p a s e 3 的水解，促进成熟的c a s p a s e 3 的酶活性。但p 5 3 或a r f 是否 与s m a c d i a b l o 相互作用还未见报道。而有的促凋亡蛋白如p u m a ，同样也是 p 5 3 转录的靶基因，虽然还没有直接的证据，但是不排除a r f p 5 3 途径的凋亡可 能会和它有关。 2 1 3 a r f - p 5 3 分子通路的分子机制 2 1 3 i p 5 3 蛋白及其通路 1 9 7 9 年l a n e 首先描述了在s v 4 0 感染的n h 3 t 3 小鼠细胞核中存在一种5 3 k d 大小，含有3 9 3 个氨基酸，能与s v 4 0 大t 抗原作用的磷酸化核蛋白后命名为 p 5 3 蛋白。其主要的功能结构域包括n 端的转录活化结构域，中间的d n a 结合 结构域以及c 末端的多重功能结构域。如图1 7 所示。 匿薹 医睦至由 图i - 7 ：p $ 3 蛋白的功能结构域示意图 ( f o r m a n n mb o d ee t a l ，n a t u r e r e v i e w s c a n c e r ( 2 0 0 4 ) 4 ：7 9 3 8 0 5 ) p 5 3 作为抑癌基因，也是细胞中一个重要的转录因子，在人类5 0 以上的肿 瘤组织中均发现了p 5 3 基因的突变。一般而言，影响p 5 3 的功能的途径有三条： 一是d n a 损伤，二是癌蛋白形成的异常生长信号，三是化疗药物、紫外线、缺 氧。当上述三种机制的胞外信号存在时，通常处于细胞中非激活状态的p 5 3 被 激活，诱导细胞出现周期阻滞和细胞凋亡来维持基因组和细胞的稳定，抑制肿 瘤生长。而p 5 3 这些功能很大程度上是通过p 5 3 活化其不同的靶基因来实现。 而其自身也受到包括转录、r n a 的剪切、定位、修饰以及降解等多方面的调控 第一章背景综述 ( g i a c c i a a n d k a s t a n ，1 9 9 8 ；y i ne ta i ，2 0 0 2 ) 。 目前己知介导p 5 3 泛素化降解的e 3 连接酶主要有m d m 2 、p i r h 2 、c o p i 以 及a r f b p i ( c 0 1 c o r a ne t a l ，2 0 0 4 ；d o m a ne la l ，2 0 0 4 ；l e n ge ta l ，2 0 0 3 ) 。其中， m d m 2 t 作为调控p 5 3 稳定性最重要的e 3 连接酶研究的最为椿入。m d m 2 ，是具 有4 9 1 氨基酸的磷酸化蛋白，定位于细胞核，半衰期5 - 3 0 m i n ，通常诱导g l 期 阻滞并使p 5 3 失活。细胞应激状态叫，m d m 2 直接与p 5 3 相结合，抑制其转录， 诱导p 5 3 发生泛桑化使其降解。正常细胞中，m d m 2 通过泛素化来降解p 5 3 。反 过来，其自身的转录水平也受到p 5 3 的调控，因此形成一个自动调节的反馈环。 匦西圈 雹 n a l 州r 1 ：m f 图l 8 ：m d m 2 对于p 5 3 的调节 ( f o r mp a t r i c k c h i n e ，2 0 0 3 ，n a t u r e r e v i e w s c a n c e r 3 ，1 0 2 一1 0 9 ) 2 , 1 3 2 癌基因通过诱导a r f 激活p 5 3 途径 外源性表达癌基因能激活p 5 3 ，导致细胞碲亡和过早衰老。因此必须使p 5 3 检查点功能失活，才能促进细胞增生而不激活p 5 3 诱导的生长抑制反应。肿瘤 抑制蛋白a r f 参与了癌基因诱导的p 5 3 激活。由于r b 不足导致细胞周期失调， 引起细胞走3 p 5 3 介导的凋亡途径而a r f 作为该途径中的一个介质被首次发现， 使得致癌因素与p 5 3 相关联。许多其他形式的致癌因子譬如，过表达v a b l 、 c _ m y c 、e l a 、e 2 f 或r b 的缺失都可以诱导a r f 的生成，使p 5 3 稳定表达。r b e r k o v i c h 第一章背景综述 h a l ，2 0 0 3 ；z i n d ye ta l ，1 9 9 8 ) ! 。 巫竺兰堕叫一。r e 。p 。b c a “ i 州巨霹堕至薹囵 唪oi 飞畦b 矿 卜匿盈 阿赢丽町 幽! ! ! ! ! ! 塑! ! 竺】 图1 9 癌基因诱导a r f 活化p s 3 功能 ( f o r md a v i dwm e e k ，2 0 0 9 ，n a t u r er e v i e w sc a n c e r9 ，7 1 4 - 7 2 3 ) a r f 缺失细胞能被癌基因 a s 转化，遮与所谓的永生化癌基因( 如e i a 和m y c ) 诱导的效应类似；但是，m y e 和e i a 也能有效的促