（环境科学与工程专业论文）自养硝化细菌的分离、鉴定及norb基因工程菌的构建.pdf

北京化工大学硕士学位论文 d h 5 a 克隆菌感受态中，构建含有重组质粒的转化子p e t 2 8 a - n o r b 。 经酶切和测序鉴定，扩增产物的碱基序列与n 3 中n o r b 操纵基因序列 完全吻合。将重组质粒p e t 2 8 a - n o r b 转化表达菌株b l 2 1 中，构建硝化 基因工程菌p e t 2 8 a n o r b b l 2 1 ( p n b ) 。采用用s d s p a g e 电泳验证 n o r b 还原酶在p n b 是否成功表达，得到一条5 7 k d a 大小的蛋白条带， 与预期大小一致。对重组基因工程菌p n b 进行硝化效果测定，结果表 明菌株p n b l l 菌株n 3 的硝化速率高1 2 7 。 关键词：硝化细菌，系统发育，克隆，基因工程菌，表达 h 摘要 s e p a r a t i o n 、i d e n t i f i c a t i o no fa u t o t r o p h i c n i t r o b a c t e i u aa n dc o n s t r u c t i o no fn o r b g e m s a b s t r a c t a u t o t r o p h i cn i t r o b a c t e r i a i st h em a i nm i c r o f l o r ai n b i o l o g i c a l n i t r o g e n r e m o v a l p r o c e s s t h e n i t r i f i c a t i o nr a t eo f a u t o t r o p h i c n i t r o b a c t e r i ai st h el i m i t e df a c t o rt h a ts i g n i f i c a n t l ya f f e c t st h en i t r i f i c a t i o n e f f i c i e n c y a n dn i t r o g e nr e m o v a le f f i c i e n c yi nw a s t e w a t e rt r e a t m e n t s y s t e m i nt h i sw o r k ，a u t o t r o p h i cn i t r o b a c t e r i aw e r ec u l t u r e db yt h e m e t h o d so fe n r i c h m e n t ，i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o n t r a d i t i o n a l m i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d sa n dm o d e mm o l e c u l a rb i o l o g yt o o l s w e r e a d o p t e df o rt h e i ri d e n t i f i c a t i o na n dt h en o r bg e n et h a th a sn i t r i f i c a t i o n w a sf o u n do u t b yu s i n gg e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n gm e t h o d ，h i g he f f i c i e n t n i t r o b a c t e r i aw e r ec o n s t r u c t e dt h a tc a ni m p r o v et h ed i s a d v a n t a g eo ft h e a u t o t r o p h i c n i t r o b a c t e r i a i n c l u d i n gl o n gg r o w t hc y c l e a n dt h el o w n i t r o g e nr e m o v a le f f i c i e n c y t h em e t h o df o ri s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f a u t o t r o p h i cn i t r o b a c t e r i aw a sa sf o l l o w e d ：a e r o b i ca c t i v a t e ds l u d g eo f a 2 ot r e a t m e n tp r o c e s sw a ss e r v e da sb a c t e r i a ls o u r c ea n dt w os t r a i n so f a u t o t r o p h i cn i t r o b a c t e r i an 3a n dn 4w e r es u c c e s f u l yi s o l a t e d t h e n ，t h e i 北京化工大学硕士学位论文 t w os t a i n sw e r et r a n s f e r r e dt ol i q u i ds e p a r a t i o nm e d i u ma n dc u l t u r e df o r 14d a y s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h en i t r i f i c a t i o ne f f i c i e n c yo ft h et w os t r a i n s a l lr e a c h e d10 0 b yt h em e t h o do fm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ， p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s ，t h e t w os t r a i n sw e r e p r e l i m i n a r yi d e n t i f i e da s as p e c i e so fn i t r o b a c t e r i a t w os t r a i n sw e r e f u r t h e ri d e n t i f i e db yp c ra m p l i f i c a t i o n ，c l o n i n ga n ds e q u e n c i n g t h e s e q u e n c i n gr e s u l t sw e r es u b m i t t e dt og e n b a n kf o rh o m o l o g ys e a r c h ， c o m b i n e dw i t hc o m p a r a t i v ea n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i st h r o u g hm e g a s o f t w a r e 16 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h et w os t r a i n s b e l o n g e d t on i t r o b a c t e r i aa n dt h e i r h o m o l o g y t on i t r o b a c t e r w i n o g r a d s k y ic a nr e a c h 9 8 t h ec o n s t r u c t i o no fn o r br e d u c t a s eg e m sw a sa sf o l l o w s ：t h en 3 w a su s e da sas t a r t i n gs t r a i na n di t sd n aw a ss e r v e da sat e m p l a t e ； p r i m e r s w e r e d e s i g n e da c c o r d i n g t on i t r i f i c a t i o nr e d u c t a s en o r b m a n i p u l a t i o no fg e n es e q u e n c ea n dt h em u l t i p l ec l o n i n gs i t eo fp l a s m i d v e c t o rp e t - 2 8 a ；n o r bg e n e sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hp c ra m p l i f i c a t i o n t h e n ，t h eg e n e sw e r ed i g e s t e db ye c o r i ，h i n di i ir e s t r i c t i o ne n z y m e ， c l o n e di n t op e t - 2 8 av e c t o r , c h e m i c a lc o n v e r t e dt ot h ec o m p e t e n c eo f d h 5 ac l o n i n gs t r a i na n dc o n s t r u c t e do ft r a n s f o r m a n t sc o n t a i n i n gt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - 2 8 a n o r bs u c c e s s i v e l y a f t e rt h ei d e n t i f i c a t i o n p r o c e d u r ei n c l u d i n gr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n g ，r e s u l t s s h o w e dt h a tt h eb a s es e q u e n c eo fp c ra m p l i f i e d p r o d u c t s w e r e i v 摘要 c o m p l e t e l yc o n s i s t e n tw i t ht h en o r bm a n i p u l a t i o no fg e n es e q u e n c ei nn 3 t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp e t - 2 8 a n o r bw a st r a n s f o r m e di n t oe x p r e s s i o n s t r a i nb l 21a n dt h eg e m so fn i t r i f i c a t i o np e t - 2 8 a - n o r b b l 21 ( p n b ) w e r eb u i l t s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i sw a sa d o p t e dt ov e r i f yi ft h en o r b r e d u c t a s ec a l le x p r e s ss u c c e s f u l l yi np n b r e s u l t ss h o w e dt h a tap r o t e i n b a n do f5 7 k d aw a so b t a i n e dw h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ee x p e c t e ds i z e n i t r i f i c a t i o ne f f e c to ft h er e c o m b i n a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gb a c t e r i ap n b w a sa l s od e t e r m i n e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tp n b sn i t r i f i c a t i o nr a t e w a s12 7 h i g h e rt h a nt h en 3 k e y w o r d s ：n i t r o b a c t e r i a ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，c l o n i n g ，g e n e t i c a l l y e n g i n e e r e db a c t e r i a ，e x p r e s s i o n v 北京化工大学硕士学位论文 a n a m 昧噍o x s b r c n c a n o n o l a n d s h a r o n h r t u s a b d o f a e m m p n d n a p c r f i s h d g g e 符号说明 厌氧氨氧化 序批式反应器 碳氮比 完全自养型亚硝酸型脱氮 氧限制型自养硝化反硝化 短程硝化反硝化脱氮 水利停留时间 上流式厌氧污泥床 溶解氧 游离氨 有效微生物 最大可能计数法 脱氧核糖核酸 聚合酶连反应 荧光原位杂交 变性梯度凝胶电泳 h 北京化工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：融。尚竭 日期：丝i q ! 盘，2 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书o 作者签名：醢蝎蛆 日期：丝l 垒：壶：2 导师签名：叠绸趁日期：碰：笸兰 第一章绪论 1 1 生物脱氮工艺研究进展 第一章绪论 废水生物脱氮是水处理领域关注和研究的热点，生物脱氮技术因其高效安全倍受 青睐。传统生物脱氮是在好氧条件下通过好氧硝化菌的作用，将废水中氨氮转化为硝 酸氮或亚硝酸氮，然后在缺氧条件下，利用反硝化菌将硝酸氮和亚硝酸氮还原为氮气， 达到脱氮的目的【1 1 。 生物法脱氮的途径如图1 1 所示： n 0 3 a l i - 1 4 + 一n 2 图1 1 生物脱氮示意图 f i g 1 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f b i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v a l 传统生物脱氮有很多缺点，首先是能量消耗较大，对氧的需求较高；其次，在反 硝化过程中电子供体必须为有机物，当污水的c n 比不足时，脱氮效果就受影响。此 外还有工艺流程长，占地面积大，基建投资高等缺点。 传统的生物脱氮技术主要包括以下工艺： ( 1 ) 活性污泥法( a c t i v a t e ds l u d g ep r o c e s s ) 活性污泥法【2 】又称三级活性污泥法，1 9 6 9 年由美国的巴次( b a r t h ) 提出，包括氨氧 化、硝化和反硝化三个过程。该工艺优点反应速率大，而且比较彻底。缺点是处理设 施多，占地面积大，造价高，管理不够方便。 ( 2 ) a o ( a n a c r o b i c o x i c ) i 艺 目前生物脱氮使用较为广泛的是o 工艺，o 工艺也称厌氧好氧工艺法。a o 工 艺流程简单，基建投资费用少，而且利用原水中的有机物作为碳源、不需要外加碳源， 可以降低运行费用，但是该工艺不能达到完全脱氮【3 1 。 ( 3 ) 氧化沟工艺( o x i d a t i o nd i t c h ) 氧化沟工斟4 】是活性污泥法的一种改型，其曝气池呈封闭的沟渠型，在水力流 北京化工大学硕士学位论文 态上不同于传统的活性污泥法，是一种首尾相连的循环流曝气沟渠，污水渗入其 中得到净化，最早的氧化沟渠不是由钢筋混凝土建成的，而是加以护坡处理的土 沟渠，是间歇进水间歇曝气的，从这一点上来说，氧化沟最早是以序批方式处理 污水的技术。其运行操作简单，基建和运行费用均低于活性污泥法，是一种经济有 效的废水处理技术。 ( 4 ) s b r t 艺( s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o r ) s b r ( 序批式反应器) 是目前国内外受到广泛重视、研究和应用日趋增多的一种氨 氮废水处理技术。 s b r 工艺是由按一定时间顺序间歇操作运行并在单个反应期内完成全部操作和 运行过程的处理工艺，其完整的操作过程包括五个阶段，按顺序依次运行：进水期、 反应期、沉淀期、排水排泥期、闲置期。 具有脱氮功能的s b r 工艺，增加了停曝搅拌阶段，其功能在于为反硝化过程创造 良好的环境条件。在停曝阶段搅拌阶段，虽然经曝气阶段后，混合液中的有机物已被 基本氧化，反硝化作用并不是十分显著，但与基本运行方式相比，由于其全部混合液 进行反硝化，因而十分有利于总体脱氮效果的提高。此外，为了获得良好的脱氮效果， 应保持足够的曝气时间以获得充分的硝化效果，一般控制在1 0 , - , 1 6 h t 5 1 。一般而言，这 种运行方式可以使脱氮总效率达n 7 0 - 8 0 。 由于废水排放量的急剧增加以及对废水处理要求的日益严格，传统脱氮工艺在废 水脱氮方面起到了一定的作用，但仍存在以下的问题【6 , 7 1 ：( 1 ) 硝化菌群生长速度慢且 难以维持较高的生物浓度，特别是在低温冬季，因此造成系统总水力停留时间( h r t ) 较长，有机负荷较低，增加了基建投资和运行费用；( 2 ) 为了维持系统较高的生物浓度 和获得良好的脱氮效果，必须进行硝化液和污泥的回流，增加了动力消耗和运行费用； ( 3 ) 高浓度的氨氮和亚硝酸盐对硝化菌有抑制作用，导致系统抗冲击能力较弱；( 4 ) 硝化 过程是产酸过程，需加碱中和，不仅增加了处理费用，还可能造成二次污染。 针对传统生物脱氮工艺中的不足，废水生物脱氮新工艺的研究、开发和应用，已 在全世界范围内得到了长足的发展，并出现了许多新型的生物脱氮工艺，这些工艺有 的已经在国内外实际工程中得到了良好的应用，并朝着自动化控制的方向发展。 早在1 9 7 5 年研究者就发现硝化过程中n 0 2 - n 的积累现象，并且首次提出了短程硝 化反硝化生物脱氮工艺。该工拦8 】将硝化过程控制在n 0 2 - n 阶段而终止，随后进行反 硝化，因其对高浓度氨氮低碳源废水的脱氮处理具有非常大的经济效益，国内外许多 学者都对此进行了广泛的实验研究。短程生物脱氮工艺的关键在于n 0 2 。n 的积累，而 n 0 2 - n 的积累受p h 值、溶解氧( d o ) 、温度和游离氨( f a ) 浓度等因素的影响【9 1 。 支霞辉【1 0 】等人采用s b r 法处理青岛某小区的生活污水。由于氨氧化菌比硝化细菌 更适应高温环境，在常温( 2 5 ) 下，可以通过提高进水氨氮浓度和p h 值来实现短程脱 氮。在p h 变化不大时，增加废水的进水氨氮浓度也可以提高亚硝酸盐的积累率。p h 2 第一章绪论 值对短程硝化的影响主要表现在对游离氨的影响，不同的p h 值氨氮会以不同的形式存 在，分子态游离氨对硝化细菌的抑制强于氨氧化菌。 g a r r i d 0 【l l 】等人在研究溶解氧浓度对气提式生物膜反应器性能影响时发现，溶解氧 超过2 5m g l - 1 ，氨全部转化为硝酸盐氮；溶解氧质量浓度介于1 肛2 0m g l 1 时，亚 硝酸盐开始积累并能达到最大，其中在溶解氧质量浓度为1 5m g l 1 左右时，氨氧化速 率和亚硝酸盐积累量都达到最大值；溶解氧质量密度低1 0m g l 1 后，氨氧化速率下降， 亚硝酸盐积累量减少。 r u i z 1 2 】等人认为游离氨( 】f a ) 对硝化细菌和氨氧化菌均有抑制作用，但硝化细菌比 氨氧化菌更易受到抑制。研究表明高游离氨( f a ) 是短程硝化的决定因素，而低d o 是 短程硝化的促进因素。 张树军【1 3 】等人采用单级u a s b s b r 生化系统处理渗滤液，在研究中发现低氧与常 氧交替运行可以维持稳定的短程硝化反硝化，同时也能控制低氧导致的污泥膨胀问 题。 z h a n gsj 等【1 4 】利用p h 值和氧化还原电位( o x i d a t i o nr e d u c t i o np o t e n t i a l ，o r p ) 作为实 时控制参数成功地实现了短程生物硝化反硝化。 2 0 世纪9 0 年代以来，荷兰d e l f t 科技大学的研究着在流化床反应器中发现了一种含 高浓度氨氮废水脱氮反应过程，并由此提出了一系列新型脱氮工艺，包括 s h a r o n ( s i n g l er e a c t o rf o rh i g ha c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a lo v e rn i t r i t e ，短程硝化- 反硝化) 工艺、o l a n d ( o x y g e nl i m i t e da u t o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o nd e n i t r i f i c a t i o n ，氧控自养硝化反 硝化) - r 艺、a n a n m o x ，( a n a m m o x a n a e r o b i ca m m o n i uo x i d a t i o n ，厌氧氨氧化) - r 艺， s h a r o n 和o l a n d 分别由d e l f t 科技大学和比利时g e n t 微生物生态实验室开发。 ( 1 ) s h a r o n i 艺 s h a r o n i 艺【1 5 】又称半硝化工艺，是由荷兰d e l f t 科技大学开发的脱氮新工艺，其 基本原理是将氨氧化控制在亚硝化阶段，然后进行反硝化，该工艺为理想的含高质量 浓度氨( 5 0 0 0m g l d ) 废水的处理工艺。实际上，它是一个无需污泥截留的单个c s t r 反应器( c o m p l e t es t i r r e dt a n kr e a c t o r ) ，在温度高于2 5 ( 一般3 0 - - 4 0 c ) 的条件下，可 有效的通过这种群筛产生大量的氨氧化菌，并使硝化过程稳定控制在亚硝化阶段，以 n 0 2 讣t 为硝化终产物，可节省能耗和外加碳源( 电子供体) 。由于硝化细菌( n i t r o b a c t e r ) 能快速的将n 0 2 - n 氧化为n o f - n ，而传统工艺很难将硝化控制在中间( 即亚硝化) 阶段。 在s h a r o n 工艺中，根据在高温条件下，硝化细菌的生长速度明显低于氨氧化菌的特 点，通过利用完全混合反应器，并控制短的停留时间及高温条件，可以有效地控制硝 化细菌的生长。通过间歇曝气可实现脱氮和p h 值的控制。由于在一定的较高温度下， 氨氧化菌对氨有较高的转化率，所以该工艺无需特别的污泥停留，缩短了水力停留时 间，反应器的容积也相应地可以减少。另外，硝化和反硝化在同一个反应器中完成， 减少了投碱量，也简化了工艺流程。 3 北京化工大学硕士学位论文 目前，s h a r o n 工艺已经在1 5l 反应器的试验研究的基础上，根据反应动力学和 化学计量物料平衡关系原理，于2 0 0 2 年在荷兰的鹿特丹( r o t t e r d a m ) d o k h a v e n 污水处理 厂设计并运行了处理规模为1 5 0 0m 3 d - 1 的生产性s h a r o n i 艺，证明了短程硝化反硝 化生物脱氮的可行性，但是，该工艺由于是在较高温度下实现的短程反硝化，对于大 多数废水的处理不是很现实，尤其是水温较低的情况下。 ( 2 ) o l a n d i 艺 o l a n d i 掣1 6 1 是由自养硝化细菌作为生物催化剂所发生氧化还原除氮工艺，为 氧控制自养硝化反硝化的简称，由比利时g e n t 大学开发的。该工艺的技术关键是控制 溶解氧的浓度，使硝化过程仅进行至i j n i - 1 4 + - n 氧化为n 0 2 - n ，实现亚硝酸盐的积累。研 究表明，低氧下亚硝酸大量积累是由于氨氧化菌对溶解氧的亲合力较硝化细菌强。低 溶解氧下氨氧化菌增殖速度加快，补偿了由于低氧所造成的代谢活动下降，使得整个 硝化阶段中氨氧化未受到明显影响。o l a n d i 艺就是利用这两类菌动力学特性的差 异，实现了淘汰硝化细菌，使n 0 2 - n 大量积累。实验室研究表明，该工艺可实现5 0 r a g l 1 - 扩l 。 据报道，该工艺和传统的硝化反硝化工艺节省6 2 5 的供氧量和1 0 0 的碳源( 电 子供体) ，但是目前存在的问题是混合菌群在连续运行的条件下尚难以对氧和p h 值进 行控制。若可通过化学计量方法实现合理的控制氧的供给，则可使污泥处于亚硝化阶 段。 ( 3 ) c a n o n i 艺 2 0 0 2 年首先由荷兰d e l r 工业大学提出的新型生物脱氮工艺：硝化厌氧氨氧化组 合工艺( c a n o n ) 属于短程硝化反硝化工艺，该工艺在2 l 世纪初开发成功。研究表明氨 氧化菌( 如n i t r i s o m o n a se u r o p a e a ) f l 皂够在有氧条件下把氨氧化成亚硝酸盐，厌氧氨氧化 菌则在无氧条件下把亚硝酸盐转化为氮气。据此，该工艺将上述两种功能通过协同作 用而实现脱氮。但是由于厌氧氨氧化菌的细胞产率远低于反硝化菌，这样就意味着 c a n o n 工艺虽然是低好氧，但是需要长时间的积累来达到反应器所需的细菌数量， 所以c a n o n 工艺的实际应用还需有待于进一步改进。 o l a n d 工艺和c a n o n 工艺的主要差别在于：前者由氨氧化菌单独作用，后者由 氨氧化菌和厌氧氨氧化菌协同作用。基于对脱氮细菌的研究，人们对硝化、反硝化和 厌氧氨氧化理论认识的进步，研究人员在不断探索其它形式的厌氧氨氧化工艺。 ( 4 ) 厌氧氨氧化( a n a m m o 的i 艺 由于厌氧氨氧化生物脱氨技术在经济方面的独特优势，成为近年国内外研究的热 点，是未来污水生物脱氮技术发展的主流。厌氧氨氧化( a n a m m o x ) 工艺是由荷兰 d e l f t 科技大学日u y v e r 生物技术实验室与2 0 世纪9 0 年代开发的一种新的工艺，该工艺在 厌氧条件下以亚硝酸盐作为电子受体，由自养菌( c a n d i d a t u sb r o c a d i aa n a m m o x i d a n s ) 直 接将氨转化为氮气，不必额外投加有机物，是一种低能耗的处理技术彻。 4 第一章绪论 与传统的硝化反硝化工艺相比，a n 删c x 工艺具有需氧量低、运转费用低和 无需外加碳源的优点。 ( 5 ) 厌氧氨氧化( a n a m m o x ) ：i ：艺和s h a r o n ：i ：艺连用 与传统的生物脱氮工艺相比，s h a r o n 和a n a m m o x 联合工艺在氧气需要量和 外加碳源上均具有优势。荷兰d e l f t 科技大学采用的s h a r o n 和a n a m m o x 联合工艺 处理污泥消化池上层液表明：传统工艺的氧气需要量为4 6 5k 9 0 2 k g n 一，需要碳源为 4 5k g c o d k g n ；而联合工艺需氧量为1 7k 9 0 2 k g n - 1 ，几乎不需外加碳源【1 8 】。 上述介绍的脱氮新工艺为研究和应用更为节能有效的生物脱氮方法开辟了新的 前景，但是对厌氧氨氧化开展的研究较多集中于理论方面，实际用于工业规模的运行 装置还不多见，还有许多方面的问题需要解决【1 9 1 ：( 1 ) 如何在世纪工程应用中合理控制 运行条件，以实现工艺的长期稳定运行。( 2 ) 如何合理的组合工艺，实现这些工艺的最 优组合。( 3 ) 需要对有关微生物的特性作进一步的探讨分析。 1 2 生物脱氮菌研究进展 生物脱氮例是污水中的含氮有机物( 如蛋白质、氨基酸、尿素、脂类、硝基化合 物等) 在生物处理中被异养微生物氧化分解，转化为氨氮，然后由自养型硝化细菌将其 转化为n 0 3 ，最后再由反硝化菌将n 0 3 还原转化为n 2 ，从而达到生物脱氮的目的。如 何提高或改善污水脱氮效率，研究者【2 1 2 2 1 认为必须从微生物学的角度研究氨氧化菌、 硝化细菌和反硝化细菌等才有可能让微生物真正的为污水处理做贡献。 污水生物脱氮过程主要包括氨氧化、硝化、反硝化三个步骤，分别简述如下： ( 1 ) 氨氧化作用 氨氧化作用是指在氨氧化菌的作用下污水中的氨氮转化为亚硝酸盐氮的过程： 2 n h 4 十+ 3 0 2 2 n 0 2 + 2 h 2 0 + 4 h + ( 2 ) 硝化作用 硝化作用是指硝化细菌在好氧条件下将还原态的无机氮和有机氮转变成氧化态 氮的过程： 2 n 0 2 + 0 2 2 n 0 3 ( 3 ) 反硝化作用 反硝化作用是通过反硝化细菌的同化作用和异化作用来完成n 0 2 n 和n 0 3 - n 的 转化，包括同化作用和异化作用。 同化作用是n 0 2 - n 和n 0 3 - n 被还原为n h 4 + - n ，用以新增微生物细胞的合成，同化 反硝化的转化如下： n 0 3 。_ n 0 2 。- n h 2 0 h 州h 4 5 北京化工大学硕士学位论文 异化作用是n c h - n 和n 0 3 - n 被还原为n o 、n 2 0 和n 2 等气态物，主要是n 2 。 异化反硝化的转化如下： n 0 3 。_ n 0 2 。一n 2 0 n 2 反硝化菌是兼性细菌，它以游离氧( 0 2 ) 和硝酸根( n 0 3 ) 作为电子受体，当两者同 时存在时微生物优先选择游离溶解氧作为含碳有机物氧化的电子受体。为保证反硝 化的顺利进行，必须保持缺氧状态。 硝酸盐反硝化过程氮的转化如下： n 0 3 _ n 0 2 一n o 一n 2 0 一n 2 随着对生物脱氮机理研究的深入，其中生物法被公认为是一种经济、有效和最有 发展前途的方法，而脱氮菌种的发现为生物脱氮提供了新的思路，成为学者研究的热 点。 日本琉球大学比嘉照夫教授研制出一种新型复合微生物制剂：有效微生物群 ( e f f e c t i v e m i c r o o r g a n i s m s ，简称e m ) ，它是光合细菌、乳酸菌群、酵母菌群、放线 菌群、丝状菌群等5 科1 0 属8 0 余种微生物组成，具有高效、低价、无二次污染、制 造使用简便等特点，在环境保护领域中得到广泛的应用【2 3 彩】。在污水处理过程中，e m 菌易流失、生物活性不稳定，必须定期投入e m 菌，限制了e m 技术在污水处理方面的 应用矧。 固定化技术的出现使废水生物处理的效率得到了很大的改善。固定化微生物技 术【韧是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域，以提高微生物细 胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。由于该技术既不需要把 酶从细胞中提取出来，又不需要加以纯化，因而酶活性损失小。研究和应用表明， 固定化微生物技术有微生物密度高、保持高效菌种的稳定性、反应速度快、微生 物流失少、处理设备小型化、反应易于控制等优点【2 酊。 固定化微生物的制备方法【2 9 ，3 0 】主要有吸附法、包埋法、交联法等，其中包埋法应 用最广泛。 吸附法【3 1 】又称载体结合法，原理是细胞和载体间形成共价键、离子键或分子吸引 力，是比较经济有效和常用的方法。吸附法分为物理吸附法和离子吸附法两种。物理 吸附法是使用具有高吸附能力的物质，如活性炭、碎石、硅胶、木屑、硅藻土、多孔 砖、陶瓷片等吸附剂将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附法是在解离状态下利 用微生物离子键合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有 c m 纤维素、d e a e 纤维素等。吸附法制备简单，但牢固性差，微生物菌体易脱落。 包埋法【3 2 】其原理是微生物细胞通过扩散作用进入多孔性载体内部，或将细胞包埋 到凝胶中，是目前工业化应用上最为广泛的微生物固定方法。常用的包埋剂有琼脂、 海藻酸钠和聚乙烯醇等。包埋法操作简单、条件温和、对微生物活性影响小、固定化 离子强度高，适合于小分子底物与产物的反应。 6 第一章绪论 交联法 3 3 1 是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使微生物发生分子间交联而 得到固定的一种方法。常用的交联剂有戊二醛和双重氮联苯胺等。该方法生物反应活 性损失大，且采用的交联剂大都比较昂贵，因此应用受到一定的限制。 1 3 硝化细菌的研究进展 废水生物脱氮是水处理领域关注和研究的热点，城市污水处理厂采用的废水生物 脱氮工艺由硝化和反硝化作用共同完成。硝化作用囝】分为两个阶段，首先由氨氧化细 菌把氨氮氧化为亚硝酸盐氮，然后由硝化细菌把亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。硝化细 菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌两类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自 养型硝化细菌是参与生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污 水处理系统的硝化效果，是污水生物脱氮的限制性因素【3 5 】。 硝化细菌主要有4 个不同的类群，分别为硝化杆菌属、硝化刺菌属、硝化球菌属、 硝化螺菌属【3 6 1 。其具体特征、生长环境和1 6 sr d n a 情况见表1 1 ： 表1 1 硝化细菌各属的特征比较 t a b l e1 - 1c o m p a r i s o no ft h en i t r i f y i n gb a c t e r i a sc h a r a c t e r i s t i c s 目前，硝化细菌的文献报道集中在富集培养、异养菌的纯化分离培养和混合菌群 的多样性研究方面f 3 1 1 ，对废水生物脱氮起主要作用的完全自养型硝化细菌纯化分离 报道不多，主要是因为【4 2 4 6 1 ：( 1 ) 自养型硝化细菌大部分是化能自养菌，不能利用有机 7 北京化工大学硕士学位论文 物，生长世代时间长，平均在1 0h 以上，生长速率慢；( 2 ) 硝化细菌好氧生长消耗溶 解氧使培养过程溶解氧含量不稳定，生长环境不易控制；( 3 ) 形态极其微小不易观察； ( 4 ) 对环境因子变化敏感易受损；( 5 ) 生长迅速的伴生异养菌会掩蔽目标菌群；( 6 ) 分离 纯化困难，现在常用的选择性平板法等不能有效的分离纯化出硝化细菌，主要是因为 硝化细菌生长速率慢，对亚硝酸盐的去除效率差，而易形成致密的菌胶团，这给自养 型硝化细菌的深入研究带来困难，有必要富集培养、分离鉴定纯的自养型硝化细菌， 为进一步研究自养硝化细菌的作用机理奠定条件。 若要使硝化细菌真正为污水脱氮做出贡献，必须清楚单株硝化细菌的生理生化特 性、起硝化作用的基因等，这是目前硝化细菌研究的难点和热点，也是本研究的目的 之一。 目前，对硝化细菌的研究报道主要集中在传统的微生物学计数和分子生物学研 究，如最大可能计数法( m a x i m u mp o s s i b l en u m b e r ，简称m p n ) 、实时定量p c r ( r e a l t i m e p c r ) 、荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o ，简称f i s h ) 、变性梯度凝胶电 泳( d e n a t u r e d 黟a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，简称d g g e ) 等，而对硝化细菌的实验室分 离筛选、鉴定、n o r b 基因的克隆、表达、基因工程菌构建等鲜见报道。常见分子生物 学方法在环境样品中的应用如图1 2 的图示： m p n 法又称为最大可能数法，在不能使用平板计数时才采用。m p n g r i e s s 法常用来硝化细菌的计数，g r i c s s 试剂检测n 0 2 。硝化细菌由于其形态极其微 小，不适合平板计数等方法，因此在研究中多采用最大可能数计数法。 作为一种使用最为广泛的传统的硝化细菌计数检测方法，m p n g r i c s s 法也 存在一些缺陷 4 7 1 ，如：由于硝化细菌在自然环境中常常聚集生长，因此，实验前 必需将待测样品充分分散。如果没有做好分散工作，必然导致检测出的硝化细菌 结果偏低，而在实际操作中待测样品( 尤其是生物膜或活性污泥样品) 的充分分散 往往难以做到。研究表明，自然环境中存在的可培养的硝化细菌仅占硝化细菌中 很小一部分，大部分的硝化细菌是不可培养的。这些不可培养或处于休眠不活跃 状态、或在所用的计数培养基中不易生长的硝化细菌，它们在计数培养时可能无 法大量繁殖，就不可能在计数培养基中产生足够的可供化学检测的生物量，而导 致m p n g r i e s s 计数法的检测的硝化细菌结果低于样品中实际存在的硝化细菌数 量。当然作为一种传统计数检测方法，m p n g r i c s s 法只能检测氨氧化菌总数和 硝化细菌的总数，而不能将硝化细菌的种类分别进行检测。因此，传统的 m p n g r i e s s 硝化细菌计数法操作容易、简单、对仪器设备和操作人员的要求较 低，但测定时间长，检测结果可能偏低，而且其确切或是最优的操作方法( 如培 养时间、培养基中亚硝酸盐浓度等) 还需进一步的探索。 8 第一章绪论 图1 2 以1 6 sr d n a r n a 为基础的微生物分子生物学技术 f i g 1 - 2m i c r o b i a lm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e sb a s e do n1 6 sr d n a r n a 由于上文中提及的问题，很难对硝化细菌用传统的研究方法进行更进一步的 深入研究，必须采用新的研究试验方法，才能对自然环境、污水、生物膜中的硝 化细菌进行更进一步的研究，而迅速发展的分子生物学技术正为此提供了良好的 工作基础和方法。 目前利用分子生物学方法对硝化细菌菌群的研究在国外已得到相当广泛应 用，但在国内的报道还相对较少。下面对日渐广泛使用的实时定量p o r ( r e a l t i m e 9 北京化工大学硕士学位论文 p c r ) 、荧光原位杂交( f i s 田、变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 等技术在硝化细菌研究中的 应用进行一一介绍。 ( 1 ) 实时定量p c r 技术( r e a l t i m ep c r ，简称r t 4 c r ) r e a l t i m ep c r 技术是指把荧光基团加入p c r 反应体系中，利用荧光信号累积实时 监测整个p c r 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 近年来，实时定量p c r 技术迅速发展，在指数扩增期间该技术通过连续监测荧光 信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目，通过与加 入已知量的标准品进行比较，实现实时定量。目前已经广泛应用到d n a 、m r n a 和病 毒荷载量的定量、基因突变分析、核酸多态性分析等多个领域，近来也已经开始用于 环境样品中的特定微生物的数量检测。+ r t - p c r 技术作为一种核酸定量的手段，克服了以往p c r 技术存在的假阳性污染 和不能进行准确定量的缺点，以实时性、高灵敏性、高特异性、污染少等优点，在环 境微生物中逐渐得到广泛的应用。 ( 2 ) 荧光原位杂交技术( f i s h ) 荧光原位杂交( f i s h ) t 4 8 】是直接法杂交的一种，其原理是以标记有荧光分子的- d , 段d n a 或r n a 序列为探针，与合适的温度和盐离子浓度条件下，在原位与组织细胞内 染色体上的互补序列特异性地退火结合而不破坏染色体的整体形态，以便在显微镜下 观察到此特异的核酸序列及其在染色体上的位置的一种基因定位方法。f i s h 技术分为 4 个主要步骤：( 1 ) 将染色体、细胞或组织进行固定；( 2 ) 标记探针；( 3 ) 将探针与固定材 料上的靶序列d n a 或r n a 杂交；“) 检测杂交结果。 f i s h 技术具有高的特异性和灵敏度，探测的灵敏度可达到l 啦2 0 个m r n a 拷贝细 胞。在分析环境样品中与传统方法相比具有不可比拟的优势，它快速便捷，不仅可以 定性，而且可以对环境中的细菌进行直接计数，是研究环境系统中细菌类群的空间分 布和数量分布提供了有效的检测工具。 表1 2 中为废水生物处理中常用细菌类探针，表1 3 为研究生物脱氮中硝化细菌常 用的探针： 1 0 第一章绪论 表l - 2f i s h 常用细菌类探针 t a b l e1 - 2c o n v e n t i o n a lb a c t e r i ap