（环境科学专业论文）基于酶活性的海洋环境中多环芳烃重金属复合污染的生物毒性效应研究.pdf

摘要 出对活性诱导的趋势。 本论文建立了基于微孔板检测系统的e r o d 酶活性测试方法，具有高效、 快速、灵敏等特点。可作为生物标志物来研究海洋环境中复合污染的生物毒性效 应，在海洋环境中生化监测工作方面具有应用前景。并以e r o d 酶活性为指标 探索性研究了海洋环境中的复合污染问题，开创性地研究了不同污染物的联合作 用，在测试、评估典型污染物毒性效应，真实反映客观环境方面具有重要的指导 性意义。 关键词：重金属；多环芳烃；复合污染 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep o l l u t i o ni nm a r i n ee n v i r o n m e n ti sn o ta ne f f e c to fap a r t i c u l a rp o l l u t a n t ， r a t h e rac o m p l i c a t e d ，c r o s s i n t e r a c t e dc o n s e q u e n c er e l a t e dw i t hv a r i o u sf a c t o r s a s i n g l ep o l l u t a n tm e c h a n i s mc a nn o te x p l a i nt h em i x e de f f e c t so fm u l t i - p o l l u t a n t s ，a n d e v a l u a t i o ns t a n d a r d sb a s e do ns i n g l ep o l l u t a n te f f e c t sc a nn o to b j e c t i v e l yr e f l e c tt h e e n v i r o n m e n t a l q u a l i t y t h e r e f o r e ，t h eo n l yw a yt o t h es o l u t i o no fm a r i n e e n v i r o n m e n t a lp r o b l e m sa n dt oe l i m i n a t et h ep o l l u t i o ni st ou n d e r s t a n dt h eo c e a n p o l l u t i o nf r o mt h ev i e w p o i n to fc o m b i n e dp o l l u t i o n b a s e do nt h i s ，t h i sp e p e r c o n d u c t e da ne x p l o r i n gs t u d yo nt h ep o l l u t i o ne f f e c to ft h ec o m b i n a t i o no ft w ot y p i c a l p o l l u t a n t s ：p a h sa n dh e a v ym e t a l si nt h em a r i n ee n v i r o n m e n t t h em a i nr e s e a r c hc o n t a i n so ft h ep r e s e n tp a p e ra r e ：f i r s t l y , w ee s t a b l i s h e dt w o m e t h o d st o t e s tt h ea c t i v i t yo fe t h o x y r e s o r u f i n o - d e e t h y l a s e ( e r o d ) b a s e do n t r a d i t i o n a lm e t h o da n dt h ep l a t er e a d e r t h r o u g hc o m p a r i n gt h et w oo p p r o a c h s ，w e f o u n dt h a tt h ep l a t er e a d e r - b a s e di sm o r ee f f i c i e n t ，a n dt h e nw eu s e dt h i sm e t h o dt o c o n d u c tas e r i e so fs i n g l e a n dc o m b i n e d p o l l u t i o nt e s t s s e c o n d l y , u n d e rl a b c o n d i t i o n s ，u s i n gt i l a p i aa sr e s e a r c ho b j e c t s ，a n df o u rh e a v ym e t a l s ( c d 2 + ，c u 2 + ，h 9 2 + ， z n 2 + ) a n df o u rp a h sm o n o m e r ( b a p , i p , p h e ，f l u ) a so b j e c t i v ep o l l u t a n t s ，w e c o n d u c t e das e r i e so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n ( 5 0n g l 一10 0u g l ) ，s i n g l ea n dp a i r - w i s e nv i t r oe x p o s u r ee x p e r i m e n t s t h r o u g ht e s t i n ga n dc o m p a r i n gs i n g l ep o l l u t a n te f f e c t o nh e p a t i ce r o da c t i v i t yi nt i l a p i a ，w es t u d yt h ee f f e c t so ft h ec o m b i n e d p o l l u t i o n t h er e s u l t ss h o w st h a t ， ( 1 ) f o rs t r o n g - r e s p o n s eo fp a h sm o n o m e r s ( b a p , i p , p h e ) a l o n e ，w h e nh e a v y m e t a li o n s ( c u 2 + ，z n 2 + ，c d ：+ ，h 9 2 + ) a r ea l s op r e s e n t ，t h es t r o n gi n d u c t i o ne f f e c to f p a h ss i n g l e p o l l u t i o nw a so b v i o u s l yi n h i b i t e d ，e x c e p tf o rn g + a n db a p p h e c o n e f f e c tg r o u p ( 2 ) f o rt h ec o e f f e c to fh e a v ym e t a l ( c u 2 + ，c d 2 + ，h 9 2 + ) a n dp a h sm o n o m e ri p , t h ec h a r a c t e r i s t i c so f s i n g l e - p o l l u t i o ng e n e r a l l yp e r s i s t s ( 3 ) u n d e rt h ec o m b i n e dp o l l u t i o no fp a h m o n o m e rf l u a n dh e a v ym e t a l ，n o l i l a b s t r a ( ? r i n h i b i t i o no ne r o da c t i v i t y , a so b s e r v e du n d e rc o e x i s t e n c eo fp a h sm o n o m e r a n dm e t a li o n s ，w a so b s e r v e d ，i nc o n t r a r y , ai n d u c t i o ne f f e c to ne r o dw a ss h o w n ( 4 ) f o rt w ok i n d so fp a h sm o n o m e r ss h o w i n gi n d u c t i o na n ds u p p r e s s i o ne f f e c t s o nt h ee r o da c t i v i t i e s ，t h e i rc o m b i n a t i o nw i t hh e a v ym e t a lb a s i c a l l ys h o w sa c o n v e r s et r e n dc o m p a r ew i t hp a h ss i n g l e p o l l u t i o n b r i e f l y , p a h sm o n o m e r s s h o w i n gi n d u c t i o ne f f e c t s u n d e rs i n g l e p o l l u t i o n s ( b a p , i p , p h e ) o f t e ns h o w s u p p r e s s i o no nt h ea c t i v i t yw h e nt h e yc o e x i s tw i t hm e t a li o n s ；t h o s ep a h sf l u s h o w i n gs u p p r e s s i o na c t i v i t i e s ，s h o wa ni n d u c t i o nt r e n dw h e nt h e yc o - e x i s tw i t h m e t a l i o n s t h i sp a p e re s t a b l i s h e dt h et h ep l a t er e a d e rb a s e dd e t e c t i o ns y s t e mo fe r o d a c t i v i t y , w h i c hc o u l db eu s e da sb i o m a r k e r st os t u d yt h eb i o l o g i c a lt o x i ce f f e c t so f e n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s ，a n dh a v eab r o a dp r a c t i c a lf u t u r ei nt h eo c e a nb i o c h e m i s t r y i n s p e c t i o nw o r k w h a t sm o r e ，w ec o n d u c t e dt h ep i o n e e rr e s e a r c ho nt h ec o m b i n e d e f f e c to fd i f f e r e n tp o l l u t a n t s ，w h i c hh a si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ei nt h et e s t i n ga n d a s s e s s i n gt h et o x i c e f f e c to ft y p i c a l p o l l u t a n t s ，a n dt r u l yr e f l e c t i n gt h e r e a l e n v i r o n m e n t s k e t w o r d s ：h e a v ym e t a l s ；p a h s ；c o r n i v 缩略词 缩略词 a h r ：a r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o r ，芳烃受体 b a p ：b e n z o ( a ) p y r e n e ，苯并 a 】芘 b s a - b o v i n es e r u ma l b u m i n ，牛血清白蛋白 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e ，二甲基亚砜 e r f ：7 - e t h o x y r e s o r u f i n ，7 乙氧基异吩嗯唑酮 e r o d e t h o x y r e s o r u f i n 一0 - d e e t h y l a s e ，7 乙氧基3 异吩嗯唑酮脱乙基酶 f l u ：f l u o r a n t h e n e ，荧蒽 p a h s p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，多环芳烃 p h e ：p h e n a n t h r e n e ，菲 i p ：i n d e n o 1 ，2 ，3 - c d p y r e n e ，吲哚芘 r f ：r e s o r u f i n ，异吩嗯唑酮 5 7 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，本人依法享有和承担由此论文产生的权 利和责任。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组)费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：岳宏伟 2 0 。 年7 月9 日 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文著作权使用声明 本人同意国家海洋局第三海洋研究所根据中华人民共和国学位 条例暂行实施办法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或 其指定机构送交学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进 入本所图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意国家海洋局第三海 洋研究所将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或者其它方式合理复制方式保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： ) 1 在年月日解密，解密后适用上述授权。 ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经国家海洋局第三海洋研究所保密委员会审定过的学位论文， 未经本所保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不 填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。) 论文作者签名：岳耘伟 日期： 指导老师签名：五幽盘 日期： 2 0 。 年 卅年 j - 7 月罗e l 1 具7 e t 第一章绪论 第一章绪论 1 1 海洋环境中复合污染研究进展 海洋是人类赖以生存的重要自然环境，海洋又是世界上一切废污的最后“收 容所 。随着社会经济的迅速发展、人口的骤增，大量工农业废水以及生活污水 排入海域，给海洋环境造成了很大的压力，污染问题日益突出。目前科学工作者 对环境中重金属【1 1 、多氯联苯圆、有机氯农药【3 1 等污染物的环境化学行为做了一 定的研究。但是这些研究大多着重于单个污染物，对多种污染物共存于同一环境、 并相互作用所形成的复合污染环境效应重视不够。然而，单个污染物的作用机制 根本不能解释几种污染物的联合效应，而且依赖单一效应制定的有关评价标准无 法真实客观地反映环境质量要求。在此背景下，b l i s s 于1 9 3 9 年首次提出研究两 种毒物联合作用的毒性，并根据作用效应，或者说是联合作用强度这一角度划分 为拮抗作用，加和作用，协同作用1 4 j ，至此污染物的联合效应【5 1 ( 或称为复合污染 【6 】) 才开始被人们所认识，并逐渐发展成为环境科学重要方向之一【7 1 。 1 1 1 复合污染研究内容 1 1 1 1 重金属的复合污染 在自然环境中，重金属离子的种类与含量都不可能是单一的和固定不变的， 离子间的相互作用往往会使离子毒性出现放大、缩小和基本不变3 种基本情况。 当然，有时也会随实验时间的延长而出现离子相互作用的更迭现象。由于不同离 子间的毒性强度并非等价，致毒机理也不尽统一，因此在分析两种离子对生物联 合毒性效应时，从静态角度来看，其联合致毒效应可分为加和、协同、拮抗和相 互独立作用4 种基本方式；从动态角度来看，随着实验时间的延长，其联合致毒 效应也可能会因毒性强度配置的不同而产生一定的消长变化【8 】。 不同的重金属组合得出不同的研究结论。修瑞琴等【9 】以斑马鱼为实验生物， 采用相加指数法进行了联合毒性实验。结果表明，c d 2 + 与z n 2 + 的联合毒性主要为 毒性剧增的协同作用。而r i b e y r ef 等对鱼b r a c h y d a n i or e r i o 研究中得出a g h g 存在着拮抗作用【1 0 1 。王莹等【1 1 1 进行了p b 、c d 和z n 等3 种重金属离子对水螅的 基于酶活性的海洋环境中多环芳烃重金属复合污染的生物毒性效应研究 联合毒性研究，发现p b 与z n 联合呈拮抗作用，p b 与c d 联合及c d 与z n 联合 呈协同作用。m a t a sh 等【1 2 】研究了近海大型藻中铜和镉的生物积累，发现高浓度 的铜对镉的生物积累表现出抑制作用，与对照监测点相比，受c u 污染水域的大 型藻组织中的镉浓度很低。 1 1 1 2 有机复合污染 随着现代化工农业的发展，越来越多的有机污染物共存于海洋环境中，因此 科学工作者逐渐开展了对多种有机物的复合污染研究。a r r h e n i u s 等研究了三种 抗污涂料( - - 丁基锡、s e a - n i n e 和i r g a r 0 1 ) 联合作用对海洋微藻的光合作用和繁殖 机能的影响。实验证明，复合污染对海洋微藻具有很强的毒性【1 3 】。b a r a t a 研究了 十种多环芳烃单体对浮游动物的联合毒性效应【1 4 1 。发现除二甲基菲之外的所有污 染物在低于它们在水中的溶解度的浓度时都对o d a v i s a e 菌的存活产生不利影 响，萘显示较强的麻醉效应，菲次之。l a n g ejh 等则以海洋中的一种发光细菌 作为受试生物，研究了两种有机污染物硝基苯和三硝基苯的联合毒性。实验表明， 毒性大小与污染物浓度相关【1 5 1 。 李永祺等以海洋微藻为研究对象，以半数有效浓度e c 5 0 为指标，研究了丙 溴磷农药( 一种有机磷农药) 和多环芳烃单体蒽【l6 。，丙溴磷浓药与重金属c u 的联 合毒性。结果表明，前者复合污染效应呈协同作用，而后者则表现为拮抗作用【l 。 王重刚等以褐菖鲇为实验生物，系统地研究了三丁基锡( t b t ) 与多环芳烃单体苯 并( a ) 芘( b a p ) 对鱼类抗氧化防御系统( 包括：谷胱甘肽转化酶活性( g s t ) 、谷胱甘 肽过氧化物酶活性( g p x ) 、谷胱甘肽( g s h ) 含量等指标的影响。实验结果显示这些 指标在联合暴污下没有明显的变化，因而可能不适合于作为监测复合污染生物效 应的生物标志物18 1 。王教授课题组还研究了t b t 和b a p 对鱼类单加氧酶系统【19 1 、 性腺激素水平的影响【2 0 1 。有关单加氧酶的实验证实，7 乙氧基异吩恶唑0 脱乙 基酶( e r o d ) 可作为t b t 与b a p 复合效应的生物标志物。而在后一个实验中，t b t 与b a p 以1 ：1 浓度混合对雌二醇水平存在拮抗作用。这种拮抗作用可能是由于 t b t 对b a p 的生物活性存在拮抗作用，以及b a p 能够刺激t b ti i 相代谢反应， 或胆汁的排泄造成的。 1 1 1 3 无机一有机复合污染 无机和有机污染物共存时的复合污染是当前复合污染研究的方向和重点。在 2 第一章绪论 第5 章中再做详细介绍。 1 1 2 复合污染毒性效应研究 1 1 2 1 竞争结合位点 根据“受体 学说口1 1 ，化学物质在生物体内都有特异性的活性反应靶位。物 理化学性质相近的污染物在细胞表面及代谢系统的活性部位存在着竞争作用。在 吸附位点的竞争会导致一种污染物从结合位点上取代另一种处于竞争弱势的污 染物，这种竞争的结果在很大程度上取决于参与竞争的各污染物的种类、浓度比 和各自的吸附特性。而在结合位点上的竞争一般会发生在生物体对污染物的吸 收、转运、蓄积和消除过程中，也会发生在酶通道和受体蛋白上。s t e w a r d 等【2 2 1 研究发现，c u 、z n 、p b 、n i 等会与c d 一起竞争植物表面的吸收位点，从而影 响植物组织对c d 的吸收。s h a r m a 等2 3 1 认为高浓度混合的重金属在生物体蓄积过 程中发生很强的拮抗作用，生物体内的各种位点竞争常发生在各种表面，尤其是 细胞膜和胞外结构( 如粘液、细胞衣) 上的结合位点。刘清等【2 4 】发现锌和锡等毒性 混合共同作用于青海弧菌( q 6 7 菌株) 时，锡的浓度大，可以占据细胞表面的结合 位，降低了锌的结合机会，从而毒性降低，显示出拮抗效应。同时认为这种竞争 的结果很大程度上取决于参与竞争的各污染物的种类、浓度比和各自的吸附特 性。 1 1 2 - 2 影响酶的活性 对海洋生物体酶活性的影响，是目前海洋环境中复合污染毒性效应广泛研究 的内容。朱毅等研究了砷、汞、苯酚联合作用对鱼类肝、肾脏脂酶活性的影响【2 5 1 ， 钱芸等以乙酰胆碱脂酶活力为指标，研究了有机磷农药对硫磷与氧乐果、甲胺磷 涕灭威之间的联合毒理效应，结果表明，这些农药之间均产生较强的协同作用【2 6 】。 王重刚等研究了苯并( a ) 芘和三丁基锡对褐菖鲇谷胱氨肽转化酶、谷胱甘肽过氧化 酶和单加氧酶的影响【1 8 j 。 复合污染物影响酶活性的同时，酶活性的改变也影响复合污染物在体内的含 量，体现在对复合污染物直接的代谢影响，包括增毒作用和减毒作用。其中研究 最多的是金属结合蛋白( 如m e t a l l o t h i o n e i n ) ，混合功能氧化酶系和过氧化保护酶 系。例如，p o s t h u m a 等口7 1 将金属结合蛋白被特定金属激活后表现出的作用视作 金属间的复合作用，这种作用可以降低某些金属的毒性中。反之，缺少这些金属 3 基于酶活性的海洋环境中多环芳烃重金属复合污染的生物毒性效应研究 会增加其它某些金属的毒性。而w e l t j e 等【2 8 】发现c d 可以诱导m e t a l l o t h i o n e i n 的 产生，而这一点可使众多重金属的吸收量增加，从而增加这些金属的毒性。 特定酶( 系) 在某种污染物作用下的诱导表达会改变生物体对另一类化合物的 代谢行为，这可作为共同脱毒的理论基础。w i l l u l m 等【2 9 】发现溶液中浓度为 0 1 m g l j 的c d ( 其l c 5 0 为9 0m g l d ) 会诱导生物体中c r p 蛋白( 一种非金属硫蛋 白) 编码基因的表达，从而减轻c u 的毒性。另外，很多化合物可阻抑生物体内自 由基的产生，从而减低过氧化胁迫，使其它共存的毒物的毒性降低。如t e i s s e i r e 等【3 0 】认为d c m u ( 敌草隆，一种除草剂) 与c u 之间的拮抗作用在于前者可消除由 c u 诱导产生的氧化胁迫，同时d c m u 可促进如谷光甘肽还原酶( 9 1 u t a t h i o n e r e d u c t a s e ) 、抗坏血酸( a s c o r b i ca c i d ) 、过氧化物酶( p o d ) 等抗过氧化作用酶的活性， 提高了细胞抗氧化的能力，且这些物质还可作为叶绿素中有害自由基的消除剂。 1 1 2 3 干扰生物大分子的结构与功能 有毒化学物质通过抑制生物大分子的合成与代谢，干扰基因的扩增和表达对 d n a 造成损伤或使之断裂，并影响其修复。例如多环芳烃单体苯并( a ) 芘在体内 被细胞色素p 4 5 0 单加氧酶( p 4 5 0 m o n o o x y g e n a s e ) 氧化为具有活性的双醇环氧化 合物( b p d e ) ，其转化为带正电性的三醇正离子与d n a 结合，形成b a p d n a 加 合产物( a d d u e t ) t 3 1 1 ，这种加合产物最终导致机体癌变【3 2 1 。s e i k e 等【3 3 1 也证实多环 芳烃单体苯并蒽( b a ) 可诱导c u 媒介的d n a 的氧化损伤。唐学玺等【3 4 】通过多环 芳烃对海洋细菌的毒性研究，发现多环芳烃化合物的毒性作用就是破坏细胞的 d n a ，引起畸变、死亡。杜秀英等【3 5 1 研究发现因为硝基多环芳烃具有亲电子性， d n a 的碱基有亲核性，易于结合，造成d n a 的损伤，所以2 硝基芴与其他硝 基多环芳烃共存时直接致突变性增强。朱琳等【3 6 l 认为虽然铜和锌是生物生长所必 需的微量元素，在生物体内与一系列重要的酶结合，同时也可与一些结构蛋白结 合，但是当它们的浓度过高，生物体原始的稳态即受到威胁，铜可对诸如d n a 和蛋白质等生物大分子的结构和功能产生不利影响。 虽然与d n a 生成化学加合物常被视作致毒的重要机理，但复合污染物在与 d n a 结合的过程中也存在着拮抗作用。d o n n e l y 等【3 7 1 发现，随着t n t ( 三硝基甲 苯) 加入量的增大，苯并( a ) 芘的毒性逐渐降低。其原因在于前者干扰了后者与 d n a 的结合。 4 第一章绪论 1 1 2 4 改变细胞膜结构与功能 污染物质在生物体内的各个过程，大多涉及其必须首先通过的各种生物膜。 典型的生物膜为蛋白质镶嵌的磷脂双分子层，具有脂类的流动特性，是生物体或 有关内含物与外界环境隔离开的第一道生物学屏障，也是污染物相互作用的优先 部位。在生物膜上存在着一些作为特殊物质分子出入门户的通道蛋白，因此，生 物膜具有选择透性或半透性，可有选择地让物质通过。一旦膜结构改变，其通透 性也会发生相应变化，从而影响到物质在生物体内的运输。复合污染可以引起各 种生物膜在结构和功能上的扰动，从而改变其透性及主动、被动转运能力。 s t e w e r t 等【3 8 1 发现c u 可改变原生质膜中可溶性部分的渗滤性，而造成细胞膜 的损伤，使得膜体变得很脆弱，使重金属更易进入。另外，g o g o l e v 3 9 1 等发现多环 芳烃单体荧葸可以改变细胞膜的通透性，提高重金属的毒性。低剂量的荧葸和重 金属单独污染时，对生物无影响，而复合污染时，则毒性明显增加。e n s e n b e c h 等 4 0 1 发现暴露于3 ，4 二氯苯胺的鱼肝细胞中粗面内质网穿孔，线粒体膨胀，溶酶 体数量增多，加入林丹后，肝细胞变得更加肥大。s i k k e m a 等】研究了p a h s 复合 污染体系后认为p a h s 等一些脂溶性化合物可以同细菌细胞膜上的脂溶性分子结 合，从而影响了细胞膜的结构和穿透性，在此基础上提出了毒作用麻醉假设 ( n a r c o t i cm o d eo f t o x i ca c t i o n ) 学说。上述实验均论证了由于一种污染物的存在， 破坏了细胞膜，使另一种污染物容易通过，从而增加了污染物的毒性。 1 1 2 5 干扰正常生理过程 复合污染通过干扰生物体的正常生理活动和改变有关生理生化过程而发生 相互作用。污染物间的相互作用还会影响生物体对特定化合物的转移、转化、代 谢等生理过程。k a r g i n 等【蚓认为z n 抑制c d 在鱼体中蓄积的机理在于前者可以 抑制鳃对c d 的吸收，而这一点是通过加速己摄入的c d 向体内器官转移来实现 的。n i r m a l a 等认为三丁基锡( t b t ) 和多氯联苯( p c b s ) 对鱼体繁殖率表现出的拮抗 作用与毒物在鱼体中的蓄积和向卵中转移有关【4 3 】。 1 1 3 毒性效应影响因素研究 1 1 3 1 生物因素 复合污染的生理生态效应受生物种类、作用部位、生物营养状况以及生物年 龄及性别等因素的影响。在c u 一乙草胺复合污染胁迫下，低铜具有缓解乙草胺对 基于酶活性的海洋环境中多环芳烃重金属复合污染的生物毒性效应研究 赤子爱胜蚓的毒害作用，而对于海洋对虾来说，情况正好相反，低铜增强了乙草 胺对海洋对虾的毒害作用【删。 1 1 3 2 污染物因素 污染物因素包括污染物种类、污染物化学结构与性质、处理方式、污染物浓 度、污染物之间浓度比等。王桂燕等【4 5 1 研究对二氯苯和镉对草鱼种的联合毒性作 用，当采用毒性1 ：l 进行试验时，暴露时间分别为2 4 、4 8 、7 2 、9 6h 时a i ( 相 加指数) 0 ，联合作用结果为协同作用，而当采用浓度1 ：1 进行试验时，暴露时 间分别为2 4 、4 8 、7 2h 时a i 0 ，联合作用结果呈协同作用，即随着暴露时间的增加，对二氯苯和镉 的联合毒性作用从拮抗作用转变为毒性剧增的协同作用。 污染物化学结构与性质影响污染物在环境与生物体之间的迁移，从而影响对 生物的毒性效应，c d 2 + 和z n 2 + 离子半径、原子核外层的电子结构相似，因而它们 对核酸代谢有相似的影响方式，但后者是植物生长必需元素，故二者在剂量效应 上有所不同；p b 2 + 、h g + 同c d 2 + 、z n 2 + 相比，离子特征、螯合性能有较大的差异， 因而它们对核酸代谢的影响较c d 2 + 、z n 2 + 差异也大 4 6 1 。 v i r k 等以鱼体中蛋白质含量高低为毒性指标，对同时加入n i 和c d 和先加 n i 再加c d 两个处理进行比较，发现前者毒性更强【4 7 1 ，s t r a t t o n 研究发现h g ，c d 和n i 对蓝绿藻的复合污染效应取决于金属元素加入顺序、金属离子浓度、检测 指标的选择等三个因素【4 8 1 。 1 1 3 3 环境因素 环境因素主要包括温度、湿度、光照、p h 、有机质含量等。许多环境参数如 p h 、温度、营养物质浓度、螯合剂及生物的生理条件都会影响污染物对浮游生 物的毒性【4 9 】。b o d i n 等刚研究了地中海的p a h s 污染状况，发现冬季鱼体内积累 的p a h s 是其他季节的6 倍。p h 值是影响水体中重金属迁移转化的重要的理化 因子。在酸性条件下，f e 和m n 以容易溶解的f e 2 + 和m n 2 + 的形式共存，其联合 作用毒性较大；而在碱性条件下时，则以不溶性f e ”和m n 4 + 的氧化物和氢氧化 物形式共存，毒性降低。同时p h 值对有机物的毒性也有影响。s i l l a n p a a 等【5 u 发现在高铁离子溶液中加入螯合剂e d t a ，其毒性增大了3 倍。 6 第一章绪论 1 2 细胞色素p 4 5 0 的研究进展 1 2 1 细胞色素p 4 5 0 的概念 细胞色素是一个酶系，又被称为多功能氧化酶、细胞色素p 4 5 0 酶系、单加 氧酶等。该酶系由多种组分组成。目前己知，细胞色素p 4 5 0 酶系主要组分包括 细胞色素p 4 5 0 和细胞色素b 5 、两种黄素蛋白以及磷脂等，其中细胞色素p 4 5 0 和细胞色素p 4 5 0 还原酶最为重要。 细胞色素p 4 5 0 在1 9 5 8 年被发现，它是一类以还原态与c o 结合后在波长4 5 0 n n l 处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质【5 2 1 。细胞色素p 4 5 0 不同于一般的酶的性 质，可以催化的底物范围比较广泛，专一性较低。通常根据细胞色素p 4 5 0 催化的 底物和作用的差别将其表示：7 乙氧基3 异吩嗯唑酮脱乙基酶( e r o d ) ，7 乙氧 基香豆素o 拖乙基酶( e c o d ) ，芳烃羟化酶( a h h ) 等。 一 1 2 2 细胞色素p 4 5 0 的分类 细胞色素p 4 5 0 家族成员之间的一级结构差异较大，相互之间的保守性小于2 0 ，但空间结构却有着较大的相似性，含有由含铁血红素和半胱氨酸组成的活性 中心，在活化氧方面有共同的机带j j t 5 3 1 。目前发现的p 4 5 0 酶有5 0 0 0 多种，在细菌， 真菌，植物和动物中都有分布刚。细胞色素p 4 5 0 是个超家族，依次可分为家族、 亚家族和酶个体三级。一般命名通则如下：细胞色素p 4 5 0 缩写成c y p ( d , 鼠和果 蝇用c y p ) ，c y p ( c y p ) j e 体表示酶，c y p ( c y p ) 斜体表示相应的基因。凡p 4 5 0 基因 表达的p 4 5 0 酶系的氨基酸同源性大于4 0 的视为同一家族，以c y p 后标一阿拉伯 数字表示，! t l i c y p l ( c y p l ) 在哺乳动物的亚家族中氨基酸同源性大于5 5 为同一亚 族，在家族的表达后面加一英文大写字母( 或小鼠和果蝇用小写英文字母) ，如 c y p l a ( c y p l a l ) ，每一亚族中的单个p 4 5 0 酶根据被鉴定的顺序用阿拉伯数字编 序，如c p y l a l ( c y p l a l ) 。 1 2 3e r o d 作为鱼类生物标志物研究进展 1 2 3 1 背景 2 0 年前，就有把单加氧酶亚科的细胞色素p 4 5 0 1 a 作为受p h h s 和p a h s 污 染的生物标志物【5 5 1 。细胞色素p 4 5 0 在反应循环中通过为底物提供一个单原子氧 7 基于酶活性的海洋环境中多环芳烃重金属复合污染的生物毒性效应研究 参与化合物的氧化、水解和还原【5 6 1 。在鱼体内，细胞色素p 4 5 0 酶主要是集中在 鱼体的肝脏中、肾脏，胃肠道和腮中也有报道【57 1 。它们存在于光滑内质网的组织 内，参与内源性和外源性物质的代谢( i 相反应) ，通常可以增加底物的水溶性， 易于排出体外p 引。这种方式下，细胞色素p 4 5 0 例如c y p l a 对药物、杀虫剂、 致癌物质等起到解毒作用。然而，i 相反应中一些p a h s 的代谢物，可能比原物 质的毒性更大【5 圳。 c y p l a 作为生物监测的目的最有效的方面，是因为当受到污染物污染的时 候，酶的活性会相应的升高。c y p l a 的诱导是通过异生物质和细胞溶质的 a h r ( a r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o r ) 的结合为中介。a h r 配体一般都具有和 2 ，3 ，7 ，8 t c d d ( 2 ，3 ，7 ，8 t e t r a c h l o r o d i b e n z o p d i o x i n ，即一种c y p l a 模式诱导剂) 相 似的结构。如图1 1 。受体结合后紧接着是一系列的分子现象，诱使某些基因的 表达( 包含c y p l a 在内) ，被称为“a h g e n eb a t t e r y ”【6 0 】。p h h s $ 1 ：i 结构相似的化合 物的毒性效应认为是由a h r 为介导的，通过诱导蛋白改变了细胞的稳态结构【6 1 1 。 对于哺乳动物，这些效应包括：衰弱综合症，促癌，和胸腺萎缩【6 2 1 。对于鱼来说， 生命的早期阶段会对a h r 配体更为敏感【6 3 1 ，最近的证据表明，在毒性反应里有 c y p l a 酶的参与【6 4 1 。 使用c y p l a 作为一项评估技术近年来有所增加。这主要是由于使用e r o d 这 种快速和相对便宜的测试其催化活性的方法，是比较好的选择【6 5 1 。通过指示 c y p l a 的诱导，e r o d 为鱼体内存在具有a h r 活性的化合物提供了一个铁证。历 史上，评估鱼体内摄入这些化合物的程度是非常复杂的，是因为这些化合物的种 类繁多，还有它们的生物利用率各不相同。即使可以分析出鱼体内有机污染物的 种类和浓度【6 6 1 ，对于生物效应仍不能提供一个直接的迹象。e r o d 活性的诱导对 于环境的改变是一个及其敏感的指示剂，受到污染物污染以后通常是第一个被检 测和量化。此外，不管这些可诱导的污染物是否能被检测到，e r o d 代表了所有 可诱导的污染物的累积影响。 8 第一章绪论 三，颞贩三 a d ( 1 ) 2 ，3 ，7 ，8 - t e t r a c h l o r o d i b e n z o - p d i o x i n ( 2 ) 2 , 3 ，7 ，8 一t e t r a c h l o r o d i b e n z o f u r a n s (pcdds)(pcdfs) ( 3 ) p o l y c h l o r i n a t e dd i b e n z o f u r a n s ( p c b s )( 4 ) b e n z o ( a ) p y r e n e ( p a h s ) 图1 - 1a h r 配体代表 1 2 3 2e r o d 活性分析 e r o d 的活性描述了c y p y l a 为中介的底物7 乙氧基异吩嗯唑酮 ( 7 - e t h o x y r e s o r u f i n ，e r f ) 的去乙基化形成一个羟基化产物异吩嗯唑酮( r e s o r u f i n ，r f ) 的速率，如图1 2 。此活性是用每毫克蛋白样品里每分钟产物r f 的生成量来衡 量 6 7 】，单位是n m m i n m gp r o 。由于通常肝中的代谢最高，所以该法一般用鱼肝 作为材料。e r o d 活性的测定包括两个步骤，第一步是鱼的捕获( 通常是每个站 点7 1 0 条) ，接着是取肝并低温保存。取出的肝组织经过匀浆和离心得到含有内 质网碎片的上清液。这个上清液包含我们感兴趣的c y p l a 酶【6 7 】。取肝时方法的 致性，超低温保存技术的使用、微粒体的制备过程等都是减少个体差异的重要 方面 6 9 】。第二步，是酶活性的测定，反应液包括酶液、底物e r f 和n a d p h ， 然后使用荧光方法测量产物r f 的生成量。然后测得酶液里蛋白含量即可求出 e r o d 酶的活性【7 0 1 。 9 基于酶活性的海洋环境中多环芳烃重金属复合污染的生物毒性效应研究 c 2 h 5 0 e r f oh o c y p l a 图1 2e r f 和r f 的结构式c y p y l a 为中介的底物e r f 的去乙基化产生荧光 产物r f 1 2 3 3 影响鱼体内e r o d 诱导的因素 和大多数生物现象一样，e r o d 会受到大量的内部的，外部的和时间上的因 素的影响。可以影响e r o d 活性的生物因素有物种【7 l 】鱼的大小和年龄【7 2 1 ，和生 殖状况 7 3 1 。包括室内和室外实验在内的不用处理也会显著影响e r o d 的测量。 污染物的污染途径7 4 1 ，鱼的饮食7 5 1 等应该经过仔细的设计。环境因素例如温度 和p h 的变化也都会明显地影响到e r o d 的诱导，因此这些因素在实验过程中应 该进行定期的测量【7 6 1 。污染物的暴污时期和持续时间对于室内或者室外实验都是 至关重要的【7 7 1 。 已知大量的化学物质或者是混合物都可以抑制鱼体内e r o d 酶活。这些化 学物质包括：有机物，有机金属，金属化合物。例如有机锡【7 8 1 。除了拮抗类化学 物以外，还存在大量的具有生物源特性的a h r 激动剂，包括植物代谢物和生物 毒素7 9 1 。简言之，某个站点测量的鱼体内的e r o d 活性的高或者低，并不能代 表这个地区的污染程度或者缺少传统的a h r 激动剂，所以研究设计中整合一系 列生物对污染物响应的检验，将会产生更多具体的信息。 1 2 3 4e r o d 在环境监测技术中的价值和用途 作为一个监测工具，e r o d 活性提供了一个快速的检验鱼体内对有毒的平面 化合物的摄入情况的指示。由于这个原因，e r o d 经常被称为“早期预警系统” 【8 0 】。迄今为止，数以百计的实地研究应用e r o d 来确定水生生态系统污染物时 空分布。这些研究已经在大量的不同栖息类型的鱼种中检测到了e r o d 活性的 诱导。 1 0 o 第一章绪论 c y p l a 的诱导( 使用e r o d 活性来估计) ，虽然本身不是一个毒性反应，但 确实表明了a h r 配体诱导体内生化变化的一种潜力。c y p i a 的诱导和对鱼的不 利影响之间，除非建立一种更为直接的联系，那么对于污染物污染而不是产生的 影响来说，e r o d 活性还是被认为是一个最好的指示剂。随着更多的e r o d 活 性和对鱼产生的不利影响之间的信息被获得，这个生物标志物或许可以作为污染 风险评估的预测工具。同时，e r o d 诱导对于环境管理者来说，可以作为一个经 济评估工具。使他们能够优先选择某些地区的生物体或者沉积物，做一些更为昂 贵的、相关联的、具体的实验分析。 应用鱼体e r o d 诱导和其他方法的结合( 例如h 4 1 e 生物测定，d n a 损伤) ， 将会对鱼的污染水平提供一个综合的评估。 1 3 本论文的研究内容和意义 本论文的主要研究内容是海洋环境中两种代表性污染物多环芳烃重金属 复合污染生物效应的初步研究。主要包括以下内容：首先，建立了包括传统方 法和基于微孔板检测系统在内的两