体外细胞实验方法.doc

_细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司(12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反H2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和anti-H2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-actin抗体购买的。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。CRISPR / Cas9敲除(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5-GCCGCTGGAGGCCAATCCCGAGG-3)和sgUCHL3-2(5-GCCCCGAAGCGCGCCCACCTCGG-3)。gRNA序列被克隆到载体中。LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染sgRNA-puro随后与2g /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。重组蛋白表达和下拉试验。构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化分别是GST和GST- uchl3蛋白。体外GST-UCHL3拉试验,50g重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA在4C 2 h其次是孵化与50g His-UCHL3额外2 h在4C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95C。用单克隆抗his抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解L 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺;煮15分钟;用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mm NEM和1mm碘乙酰胺进行测定10次;然后离心分离细胞碎片。细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。为了制备大量泛素化蛋白作为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和His-Ubexpression载体一起转染。在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中7.8, 137毫米NaCl, 10毫米NaF, 1毫米EDTA, 1% Triton X-1000.2%萨科齐，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶抑制剂)。重组GST-UCHL3和UCHL3 CA在BL21细胞中表达，按照标准方案纯化。deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3 eubiquitination缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4 h 30C。芯片通过转染I-SceI表达质粒，在U2OS DR-GFP细胞中诱导单个DSB。转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。加入甘氨酸(0.125 M) 5分钟，停止交联。细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH值8.0,85毫米氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽1g /毫升,1g /毫升抑肽酶,1毫米PMSF。核在2000克的离心作用下，5分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 mM Tris在pH.1，10毫米EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1毫米PMSF），并将染色质切成平均大小为0.6 kb的染色质。用三文鱼精子DNA/蛋白-琼脂糖浆液预先清除裂解物。每个上清液的10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。其余的上层清液与5g孵化表示抗体在一夜之间在4C。珠被洗了四次:一次在高盐缓冲(50毫米Tris-HCl pH值8.0,500毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA),在氯化锂缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,250毫米氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA),和两次TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA,pH值8.0)。然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转20分钟。洗脱样品孵育0.2 M氯化钠一夜之间在65C到反向交联。样本孵化与核糖核酸酶为30分钟37C其次是蛋白酶K 1 h在37C。然后使用PCR清理试剂盒对DNA进行纯化，并用于定量PCR分析。芯片的PCR引物,220个碱基对远离I-SceI削减网站如下:向前,5-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3;和反向5-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3。HR分析我们使用来自Maria Jasin博士(纪念斯隆凯特琳癌症中心)的U2OS DR-GFP细胞，通过CRISPR系统产生控制或UCHL3敲除U2OS DR-GFP细胞系。将ISceI表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。在I-SceI转染后2 d采集细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI消化诱导的重组。采用pEGFP-C1平行转染法对转染效率进行归一化处理。统计数据对于细胞存活试验和HR试验，数据