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内蒙古大学硕士毕业论文 低能n + 离子注入及真空作用对酶蛋白分子构象及活性的影响 摘要 低能离子辐照生物技术经历了几十年的发展，已被成功地应用于农作物改 良、细胞刻蚀和转基因工程等方面。目前，对其机理的研究多集中在细胞水平 上，对分子水平上的辐照损伤如d n a 链的断裂、核甘酸和碱基损伤的研究也取 得了一定的进展。但关于离子注入对酶蛋白大分子构象及其活性的影响研究还 未见报道。 本文应用圆二色光谱技术研究了低能矿离子注入和真空作用对辣根过氧化 物酶和超氧化物歧化酶二级结构含量的影响，同时测定了不同剂量低能盯离子 注入和真空作用对酶活性的影响，并对它们的二级结构含量变化与活性之间的 关系进行了初步讨论。 研究结果表明：辣根过氧化物酶和超氧化物歧化酶经不同剂量的低能离 子注入和真空处理，酶蛋白二级结构单元的含量及其酶活性都发生了不同程度 的改变。它们的变化规律均呈非单调型关系，且对于不同种类酶其变化趋势、 程度也完全不同。各种酶的活性变化与其二级结构单元含量存在一定的相关性。 低能盯离子注入和真空作用均使辣根过氧化物酶的活性增加，活性的增加与其 二级结构中1 3 一折叠含量增加存在相关性；低能旷离子注入和真空作用均使超 氧化物歧化酶的活性增加，活性增加与其二级结构中a 一螺旋含量增加存在相 关性。 我们认为，低能离子注入生物体，改变了酶蛋白分子构象，从而影响了酶 内蒙古大学硕十毕业论文 的催化功能，因此产生宏观生物学效应。研究结果为阐明酶蛋白分子结构与功 能之间的关系，揭示低能离子注入对生物体的作用机理提供了实验基础和理论 支持。 关键词：离子束，真空，圆二色光谱，酶蛋白，二级结构，酶活性 内蒙古大学硕士毕业论文 s t u d yo ft h ee f f e c t so fl o we n e r g yn + i o n s i m p l f 州1 ：f 盯i o na n dv a c u u mo nt h ee n z y m e c o n f o r m 蜘o na n di t sa c t l v i t y a f t e rs e v e r a l d e c a d e s d e v e l o p m e n t ，i o n b e a mr a d i a t i o n t e c h n i q u e h a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e do ns e v e r a lf i e l d s ，s u c ha sp l a n ti m p r o v e m e n t ，c e l le t c h i n ga n d g e n et r a n s f e r a tp r e s e n t ，t h es t u d yo nt h em e c h a n i s mo fb i o l o g i c a le f f e c tm o s t l y f o c u s e so nc e l l t h er e s e a r c ho nd a m a g et od n as t r a n db r e a k s ，n u c l e o t i d ea n db a s e h a sm a d eg r e a tp r o g r e s si nt h em o l e c u l el e v e l b u ti th a sn o tb e e nr e p o r t e df o rt h e e f f e c to fl o we n e r g y i o n si m p l a n t a t i o no nm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dt h ea c t i v i t yo f e n z y m ep r o t e i n t h i sp a p e rs t u d i e st h ee f f e c t so fl o we n e r g y i o n si m p l a n t a t i o na n dv a c u u m t r e a t m e n to nt h e s e c o n d a r y s t r u c t u r eo fh r p ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) a n d s o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) b yc d ( c i r c u l a rd i c h r o i s m ) t e c h n 0 1 0 9 y ，m e a n w h i l et h e e f f e c t so fd i f f e r e n td o s eo fl o we n e r g yn + i o n si m p l a n t a t i o na n dv a c u u mt r e a t m e n to n e n z y m a t i ca c t i v i t ya r ed e t e r m i n e d a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec h a n g e so ft h e s e c o n d a r ys t r u c t u r ec o n t e n ta n dt h ee n z y m ea c t i v i t yi st e n t a t i v e l yd i s c u s s e d t h i sr e s e a r c hs h o wt h a tt h eh r pa n ds o da r et r e a t e dw i t hd i f f e r e n td o s el o w 3 内蒙古大学硕七毕业论文 e n e r g yi o n sa n dv a c u u m ，b o t ht h ec o n t e n to fp r o t e i ns e c o n d a r ys t r u c t u r ea n dt h e a c t i v i t yo fh r pa n ds o dc h a n g e di n v a r i o u sd e g r e e s t h ec h a n g e dp a t t e r n so f s e c o n d a r ys t r u c t u r ea n da c t i v i t yo fh r pa n ds o d a r en o n m o n o t o n i ca n da l s ot h e t r e n da n dt h ed e g r e ea r ed i f f e r e n t t h ea c t i v i t yc h a n g eo fe a c he n z y m ei sr e l a t e dt o t h ec o n t e n to ft h e i rs e c o n d a r ys t r u c t u r e t h ea c t i v i t yo fh r pa n ds o db o m b a r d e d w i t hl o we n e r g yi o n sa n dt r e a t e db yv a c u u mi si n c r e a s e dw h i c hi sr e s p e c t i v e l yr e l a t e d t ot h ei n c r e a s e dc o n t e n to f1 3 s h e ea n do fa h e l i xi nt h e i rs t r u c t u r e i ti ss u p p o s e dt h a tt h ep r o c e s so fl o we n e r g yi o n si m p l a n t a t i o no r g a n i s mc h a n g e s t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fe n z y m ep r o t e i na n dt h ec h a n g eo fs e c o n d a r ys t r u c t u r e l e a d st oc h a n g e da c t i v i t ya n dp r o d u c ed i f f e r e n tb i o l o g i c a le f f e c t so nm i c r o s c o p y t h i s r e s e a r c ho f f e r st h ee x p e r i m e n ta n dt h e o r yb a s i sf o rg i v i n gt h ee x p o s i t i o no ft h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t r u c t u r ea n dt h ef u n c t i o no fe n z y m ep r o t e i na n do ft h e m e c h a n i s mo fl o we n e r g yi o ni m p l a n t a t i o no nb i o l o g i c a lm a t e r i a l k e y w o r d s ：i o nb e a m ，v a c u u m ，c i r c u l a rd i c h r o i s m ，e n z y m e ，s e c o n d a r ys t r u c t u r e ， e n z y m ea c t i v i t y 4 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也 不包含为获得内篮直太茎及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者硌边i 鎏 日期；窟：i 里 指导教师签名： 日 艘 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定即：内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允 许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文 为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后 使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果须征得内蒙古大学就读期间导师的同意：若用 于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：盗! 垒 指导教师签名： e t期：塑2 ：；! i e 期： 内蒙古大学硕 ：毕业论文 第一章绪论 1 1 离子束生物工程及其应用研究 1 9 2 7 年，美国遗传学家m u l l e r 首先用x 射线诱发了果蝇基因的突变。以后人们不断的 将x 射线、b 射线、y 射线、中子、质子等辐射应用于生物诱变，获得生物新类型方面取得 了显著的效果“1 。但与此同时辐射在生物品种改良方面存在的缺点也显示出来了，诸如普遍 存在m 代存活率低，m 2 代突变谱窄，重复性和方向性差等方面的缺点。因此，开发新的诱变 源，提高突变率，扩大突变谱，成为了广大育种工作者的当务之急。随着低能加速器和核物 理的发展，低能离子与物质相互作用的研究在半导体产业，微电子技术和材料科学等方面取 得了可喜的成绩。2 0 世纪8 0 年代初，中国科学家开始了注入离子与生物体系相互作用过程 研究的探索。1 9 8 6 年，中国科学院等离子体物理所研究人员发现了离子注入对水稻的诱变 效应。1 此后，离子束生物技术被广泛的应用于诱变育种，细胞加工和基因转移，开辟了遗 传改良的新途径。 1 1 1 离子束的特点 离子束是指一束具有能量的带电粒子流其具有高传能线密度( l e t ) 、尖锐的电离峰 ( b r a g g 峰) 及低氧增比，可精确控制其入射深度和部位。离子束物质能量的传递特征是，离 子通过物质时，在物质中的局部引起高密度的电离和激发。用以描述离子束与物质相互作用 过程中有不同的参数( 或参量) ，包括：不同种类( 例如：1 h 、h e 、“n 、”a r 等) 、电荷态 ( 原子被剥离的电子数) 、剂量( 单位质量中吸收辐射的能量) ，剂量率( 单位时间、单位 质量内吸收辐射的能量) 、注量( 穿过单位截面积微分球的入射粒子数) 和流强( 单位时间、 单位截面积微分球的入射粒子数) 等。不同种类、电荷态、能量和剂量的离子束可以根据需 要进行组合，对生物体系( 例如：作物种子、微生物、动物等) 作不同模式的处理，有可能获 得人类不同需求的多种类型突变体( 例如：丰产、优质、抗病、矮杆、耐早、耐寒、耐热、早 熟、不同穗型、不同粒型、不易退化等) ，有利于拓宽突变谱。 已有研究表明：离子注入与生物体相互作用存在峰值，在峰值范围内，注入离子与生物 塑鍪鱼查兰堕主兰些堡苎 体相互作用是局部的、双重的和不易修复的。因此，离子注入用于植物诱变有可以在损伤轻 的情况下获得较高的突变率和较宽的突变谱“1 。 1 1 2 离子注入装置简介 离子注入机一般由离子源、质量分析器、加速器、四极透镜、扫描系统和靶室、测控系 统等基本部分构成。如图1 1 所示。注入离子的种类和束流强度直接由离子源来决定，它的 作用是把需要注入的元素电离成离子。目前所用的轰击粒子一般为电子，来源于离子源的直 流放电或高频放电。当外来电子的能量高于原子的电离电位时，通过碰撞使元素发生电离， 碰撞后除原始电子外，还会产生正离子和二次电子。正离子经由质量分析器后选出所需的离 子，再经加速器加速获得较高的能量( 或先加速后分析) ，最后再由四极透镜聚焦后进入靶室。 一般室内装有一个五维可调的样品架，便于样品多方位的分析。如今，伴随着各个领域技术 的飞速发展，现代的离子注入机可准确地将单一或精确数量的粒子射入细胞或细胞不同部位， 如细胞核、细胞质或被检测细胞的相邻细胞。 图1 1 离子注入装置 f i g u r e1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ea s i p pi o nb e a md e v i c e 1 1 3 离子束在生物品种改良的应用 1 1 3 1 在诱变育种方面的应用 自从发现了离子注入生物体所引发的生物效应以来，离子束便广泛的被用于生物品种的 改良，其中开展较早的是在植物品种的改良方面。 从1 9 8 6 年开始将离子束应用于水稻，小麦，棉花，玉米，甜菊，大豆，烟草等品种的改 良。安徽省农科院利用这一技术已育成$ 9 0 4 2 、s 9 0 5 5 、中粳6 3 、m 3 1 2 2 g 共4 个水稻新品种， 并相继通过安徽省农作物品种审定3 年来在省内外累计推广6 6 7 万多公顷。新增社会经济 效益8 亿多元“1 。安徽农业大学的郑冬官”1 等利用离子注入棉花种子，选育出高产、优质、抗 病虫和早熟的新品系4 个。程备久”3 等利用三种离子作用于棉花种子，发现离子注入在诱导 2 堕茎直盔兰堡兰兰些堡奎 棉花变异的产生方面效果很好。刘志生”3 利用2 o w e v 氦离子束在不同的剂量下注入玉米自交 系4 7 8 干种子胚，其结果表明，玉米自交系4 7 8 以1 0 “i o n s c , , 的剂量处理后，其后代主要性 状变异明显，出现了比亲本早熟2 3 天的自交系和籽粒产量特高的自交系。林国平州等利用离 子束注入烟草种子发现在一定程度上可以提高烟叶的品质。舒世珍“”等利用氮离子、碳离子 注入甜菊品种的干种子，发现在合适的能量、剂量的情况下可促进干叶产量提高和糖甙产量 的提高。此外，对于果树、花卉和无性繁殖的作物而言，用茎尖、芽和愈伤组织在高剂量下 进行离子束诱变育种或介导转基因也将成为可能“”。 离子束在植物诱变育种上的应用，为微生物的诱变育种提供了借鉴。离子束注入微生物 体内可以产生可见的生物效应，离子束辐照不仅可以引起细胞的死亡，而且可以导致突变的 发生。因此，作为一种有效的诱变方法，离子注入技术也被广泛的应用于微生物领域中，其 诱变效果明显。自1 9 9 8 年以来，离子束在微生物改良方面取得了丰硕的成果。中国科学院等 离子体物理研究所对单宁酶“”、麦角甾醇“”、花生四烯酸“”、福霉素和v c 1 生产菌种进行 了改良。其中单宁酶和麦角甾醇的效价( 效价的高低是衡量抗生素质量的标准) 分别提高2 8 9 和6 0 。姚建铭“”等通过诱变筛选，得到一株从高产菌i 廿n 。，其花生四烯酸的得率摇瓶、 小试和2 5 0 l 中试均可达到4 5 9 l 。据国外专利( 9 6 1 9 2 0 0 2 5 ) 文献报道，从得率最高可达 2 2 8 9 l ，该高产菌从得率提高近l 倍。姚建铭“”等通过诱变筛选，获得的利福霉素发酵水 平提高3 5 ，7t 罐发酵试验中，效价最高达6 8 6 3 u m l 。虞龙o ”等通过诱变筛选，获得的v c 已通过工业化生产试验，在3 0 0 m 3 和1 8 0 m 3 的发酵罐上通过近三百批次的生产，表现良好，最 高罐批糖酸( 克分子) 转化率达9 4 8 ，平均罐批达9 1 ，为企业带来显著的经济效益。内蒙古 大学自爱枝“”以黑曲霉a 3 为出发菌，利用离子注入技术选育出一株遗传性状稳定的木聚糖酶 高产突变株a n 4 9 7 ，其产酶水平较出发菌从野生型菌株的4 0 5 6 i u m l 提高到 5 8 6 2 i u m l ，即酶产量增加了“5 ；通过发酵条件的优化，高产菌株的产酶活力最高可达 6 7 1 1 i u m l ，比出发菌株的产酶量提高了6 5 5 。 离子注入技术在植物和微生物的诱变育种方面蓬勃发展的同时，却在动物领域的应用研 究进展较为缓慢。这主要是由于动物的可操作性较差造成的。这方面的研究主要在家蚕方面， 李圣“”等利用n + 注入到蚕卵和蚕蛹，不仅观察到一些特殊的生物效应，而且自1 9 9 0 年以来在 离子注入后代中选育了一批有利用价值的优良的基因型品系。随着单离子束精确定位照射技 术的不断完善和发展，相信离子束会在动物改良领域得到越来越广泛的应用。 1 1 3 2 在克服远缘杂交不亲和方面的应用 植物的远缘杂交是指种以上分类单位的生物类型之间的杂交，包括同属植物的种间杂交 3 塑鍪直查兰堡兰些堡皇 和不同属植物的属问杂交。通过植物的远缘杂交可将其它种的有益性状( 如抗病、抗虫、抗逆 性强、优质) 的基因资源导入栽培种，在作物、蔬菜和花卉育种中广泛应用啪1 。因而在解决目 前种质资源日趋匮乏，创造新物种和向异源物种转移有利基因等方面具有重大的理论和实践 意义。但由于亲缘关系较远的物种间存在生殖隔离，会出现远缘杂交中的不亲和现象，使杂 种不结实。因此，打破远缘杂交中的不亲和现象的研究无疑是十分有意义的陈义纯。o 等利 用”c oy 射线辐照小麦的雄配子结果提高了杂种的结实率，打破远缘杂交中的不亲和现象取 得了成功。甘肃农大孙雪新。1 等利用y 射线辐照花粉有效地克服了箭胡毛杨和卢甜毛杨间的 杂交不亲和性，获得了人工杂种，并从中筛选出优良无性系，在我国河西走廊试种推广。同 样离子注对小麦远缘杂交结实率有明显的影响，可在一定程度上克服杂交不亲和性，提高了 杂交结实率旧1 。宋道军1 等利用离子束将银杏与西瓜分子杂交，在当代获得叶内表达银杏内 脂的西瓜植株。吴丽芳啼1 等利用离子束将大豆品种的全基因转入小麦皖9 2 1 0 和扬麦5 号中， 获得蛋白含量都超过2 0 的高蛋白小麦株系。李玉峰涵1 等利用低能n + 将大豆全o n a 转入紫花 苜蓿种子后，m z 总性状突变率达到1 9 8 9 6 ，其中3 株叶粗蛋白质含量比对照高约0 5 ，1 株叶 绿素含量比对照高3 3 3 。 1 1 3 3 在介导转基因方面的应用 离子束介导转基因是余增亮、杨剑波等利用低能离子束对细胞的刻蚀作用原理设计出的 一种新的转基因方法。低能离子束对生物体表面的刻蚀加工为外源基因转移提供了通道。由 于离子束射程的可控性和可聚束的特点，能精确控制被刻蚀受体表面形成转基因通道的直径 和深度。在不影响细胞正常生命活动的情况下，既可转移基因片段，又可转移裸露活性d n a 大分子。由于离子刻蚀形成的通道壁和底部积累过多的正电荷而变成正电性，吸引了欲转入 细胞内的负电性外源d n a 主动进入。即使转基因通道局部电性未曾改变极性，但由于受体负 电性下降，减小了两个带负电的静电斥力，也有利于基因的导入。另一方面，离子刻蚀加工 一般在真空内进行，成熟胚内部分水分被排出体外。当干燥的胚被放入d n a 溶液中，由于吸 胀作用加强，使外源d n a 进入更加容易。离子注入使生物体形成一些长寿命自由基，同时造 成细胞内染色体损伤，诱导和激发受体细胞d n a 的修复和重接，有利于外源d n a 插入并整合 到宿主基因组中去，从而提高了转化效率啪1 。 杨剑波1 等利用这一原理把潮霉素基因( h t p ) 导入水稻种子胚细胞中，获得了转基因水 稻株。姬生栋啪1 等利用离子束介导外源d n a 获得的小麦在第3 代个别株系中分离出部分雄性 不育变异体。李红啪：等采用4 0 个随机引物对低能离子束介导紫玉米全d n a 转化水稻早籼2 1 3 获得的8 个玉米稻株系基因组d n a 进行r a p d 检测。其中3 6 个随机引物得到扩增图谱，说明 4 堕茎重查兰堡! 兰些丝塞 外源d n a 导入受体细胞引起后代基因组d n a 的显著变异。卞坡3 等利用3 0 k e y 的离子束在1 5 x1 0 ”i o n s c m 2 的注入剂量下介导外源甘蓝全d n a 导入模式植物拟南芥菜，在9 4 株转化当代 植株中，有6 株表型产生变异。宋道军。”等以氯化钙制备感受态受体细胞转移法为对照，用 离子束介导基因转移技术，将具有高效d n a 损伤修复系统的耐辐射异常球菌( d r a d i o d u r a n s ) 的基因组d n a 片段转入对紫外( u v ) 辐照敏感的大肠杆菌中。结果表明，转入d n a 后的菌株对 u v 辐射的抗性不仅高于其对应的敏感菌株，而且也高于其对应的敏感菌株的产生菌株，表现 为转入d n a 后的菌株受紫外辐照的存活率明显提高，代表修复合成的非按期d n a 合成( u d s ) 能力大为增强。吴丽芳旧1 等利用低能氩离子将绿色荧光蛋白基因( m g f p ) 导入小麦的成熟胚细 胞，获得了转基因株接着吴丽芳啪1 等又利用离子束介导法将几丁质酶基因转入小麦，获得 抗病的小麦植株 1 1 4 低能离子与生物体系相互作用研究 自离子束用于生物品种遗传改良的实践以来，迫切要求研究离子注入的生物学效应的诱 变机理。到目前为止低能暂齐融晚披啦嗍理仍哟艮不清楚，但还是取得了定自q 进展，1 9 8 9 年， 余增亮等m 1 提出了注入离子与生物体相互作用原初过程的三因子效应。即能量沉积效应、质 量沉积效应和电荷交换效应，引起了物理学家和生物学家的兴趣。 1 1 4 1 离子注入的生物学效应过程 陈宇幛1 等通过对离子注入微生物的生物效应的研究发现离子注入后的一段时间内，微生 物的生物效应是不明显的，须经一到数天的潜伏期后才变的明显，离子注入微生物的生物效 应存在一个或几个过程，使“分子辐射损伤”扩大，直至产生终点生物效应。离子注入的生 物效应的过程按顺序可划分为以下几个阶段： ( 1 ) 物理阶段。入射离子同靶原子发生碰撞，导致原子激发、电离，能量损失，同时慢化 的原初入射离子也以高斯分布形式沉积下来。 ( 2 ) 化学阶段。能量的传递、原子的解离及入射离子的沉积可能导致d n a 分子的断裂、重 排，引起基因突变和染色体畸变。 ( 3 ) 生物阶段。分子损伤不能通过细胞的代谢功能得到修复，表现出下列生物学效应：细 胞死亡、细胞突变以及后代的遗传变异。 离子注入所引发的生物效应是一个连续变化的过程，很难截然分开。离子注入同时向照 射机体内输入能量、离子和电荷，原初过程变的极为复杂且有特异性。例如移位原子、沉积 离子和本底元素的重排与复合，不仅与注入离子的能量、质量数、电荷数有关，也与离子的 化学活性有关。这种依赖关系深刻地影响生物阶段的变化。同时离子注入所诱发的生物学效 塑鍪直查兰堡主兰些笙苎 应非常显著。例如，陈宇m 等利用离子注入技术作用于红霉素产生菌的诱变工作中，诱变效 果明显，其突变范围和突变程度要高于紫外线诱变。宋道军m 1 等在n + 束和y 射线对两种微生 物生物膜辐射损伤效应的比较研究中发现n + 束可直接导致生物膜的损伤，而y r a y 辐照则看 不出直接的损伤效应。吴兰佩旧1 等研究初步证实n + 束可以和y - r a y 一样可以作为染色体畸变 和基因重组的有效诱变源王相勤啪1 等对2 5 k e y 氩离子束辐照尿嘧啶引起其分子结构的变化 进行了研究，进行紫外光谱分析，发现尿嘧啶受到了一定程度的损伤。从单个细胞看，离子 注入后细胞的细胞壁受到不同程度的剥离，有的细胞壁被削去一部分，露出了胞质，甚至出 现胞质外流。从整体细胞来看，离子辐照区域的细胞排列紊乱，细胞被拉长、扭曲和绞连， 胞间质被严重刻蚀，留下很深的沟槽和孔洞。从生物个体来看，离子注入可引起生物体的多 种生理变化和损伤，例如叶绿体的损伤、呼吸代谢、自由基以及自由基清除酶的变化等。 1 1 4 2 能量沉积效应 当离子束作用于生物体表面时，一部分离子能量将随着动量方向指向表面并到达表面，引 起生物体表面的二次离子发射，即溅射。溅射粒子可以是原子、分子或碎片离子。另外，入 射粒子在单次碰撞时直接把动量传给表面粒子，也会发射较高能量的二次离子。另一方面， 由于入射离子能量转移给靶原子电子，引起入射离子径迹上靶原子电离，这种瞬时的电荷积 累在库仑斥力作用下，引起“库仑爆炸”，将生物分子或碎片抛射出来，这就是所谓的电子 溅射。离子束的溅射好比一把手术刀，对生物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原 来不连通的通道在一定距离内连通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上， 从而对细胞造成严重的刻蚀。由于生物组织具有疏松的、分布不均匀的结构，由活泼的有机 分子构成，是热和电的不良导体，因此在大剂量率的低能离子的大剂量注入会使样品中薄弱 部分被刻蚀贯穿，逐渐形成较深的直通孔道。使部分离子能够穿过这些孔道，直接作用于作 物种胚，产生独特的离子诱变生物效应。 1 9 8 9 年，余增亮“o 等发现离子束对细胞的“加工”作用，随即提出了离子束介导外源基 因转移的设想。基于这一原理，从1 9 9 0 年起，先后把全玉米基因，c a t 和g u s 基因成功的转 移到带壁细胞、成熟胚和种子。 1 1 4 3 质量沉积效应 在注入离子与生物样品的相互作用中，最初的入射离子能量较高，它与靶分子、原子的 相互作用主要是非弹性碰撞过程( 电子阻止过程) ，使生物分子电离或激发，导致电离损伤。 以后入射离子能量逐渐降低，弹性碰撞将起主要作用( 核阻止过程) ，通过碰撞、级联和反冲 碰撞，导致靶原子移位，留下断链或缺陷。随着入射离子能量进一步降低，核阻止本领急剧 内蒙古大学硕士毕业论文 上升，能量损失达到峰值。这时，慢化的原初离子也将以高斯分布的形式沉积下来。如果注 入离子是活性离子，它们在沉积过程中将与生物分子键合、置换，形成新的分子基团，这就 是质量沉积效应。其直接的证据来自n + 注入a 一萘乙酸。q 一萘乙酸分子本身由c ，h ，0 三 种元素组成的，不含n 。因而含氮稳定产物的检出就是“质量沉积效应”的最好证据。氮原 子作为生物体和有机物的主要组成元素之一，通过离子束注入的氮原子，能够结合到生物体 内的分子上。经光电能谱分析发现氮离子束注入胸腺嘧啶产生了注入的氮原子和其他原子结 合形成的新键元素分析得到氮原子含量增加了3 3 1 1 4 4 电荷交换效应 入射离子在生物样品中慢化后，与生物样品的每一次碰撞，有一定的几率失去电子或从 生物样品中俘获电子，这种现象就是离子在物质中的电荷交换效应。目前研究的细胞和绝大 部分生物分子都是负电性的。注入离子的电荷交换效应，可使生物体电性发生改变。注入负 离子，使负电性增加，注入正离子，使负电性降低，甚至使生物电性的极性改变。一般的， 细胞膜是电的不良导体，电荷在细胞表面的积累，导致细胞跨膜物理场的畸变，深刻影响着 细胞内外物质交换、信息传递和代谢调控等各种生物学过程。同时还通过影响d n a 碱基的质 子涨落、电子转移、对d n a 起保护和损伤双重作用邵春林m 1 等以酪氨酸( t y r ) 分子晶体和腺 嘌呤核苷( a r ) 分子晶体为对象，用毛细管电泳法研究荷能离子注入对其表面电荷的影响。实 验发现，分子的泳动情况与注入离子的剂量有关。 综上所述，离子注入生物体既存在能量沉积( 包括动量传递) 过程，又存在质量沉积和电 荷交换过程，即同时向生物体某个局部输入了能量、物质和电荷。这与我们所熟知的辐射效 应原初过程有较大的区别。作用原理的差异为离子束遗传改良方法学的创新打下了基础这 些过程差不多在1 0 1 l 一1 0 1 秒中同时发生，很难区分各自独立的作用“。 1 1 3 离子束生物工程中有待研究的问题 离子束生物技术是由我国研究人员独立发展起来，具有中国自主知识产权的新的交叉领 域。经过十余年的努力，其已成为许多国家竞相开展的国际前沿课题。然而，低能离子束生 物工程在其进一步的发展中还有一些难题有待于进一步研究和探索，例如，在靶室内低能离 子束的均匀性和可控性、低能离子束束线直径的最小化、低能离子定点注入的装置系统和技 术体系、离子定点注入装置的小型化、靶室内温度的可控性、从物理学角度提高被注入材料 成活率的技术研究等问题都急待解决。离子注入生物效应机理研究，虽已有一些研究结果，但 其结论多是推测性的，缺乏较多的实验依据。另外，离子注入生物体是在真空中进行的，因此 离子注入过程中真空作用对生物体的影响也是一个新的研究课题。综上所述，离子束生物工 内蒙古大学硕士毕业论文 程技术是一门很有发展前途的技术，相信在生物学家和物理学家的共同努力下，这一领域的 发展前景将会更广阔。 1 2 本课题研究意义和主要内容 低能离子束生物效应用研究经历了几十年的发展，取得了巨大的成功。例如，低能离子 注入生物技术已被成功地应用于农作物改良、细胞刻蚀和转基因工程等方面“1 。目前，对 其机理的研究多集中在细胞和个体水平上1 ，对分子水平上的辐照损伤如d n a 链的断裂、核 甘酸和碱基损伤的研究也取得了一定的进展“”删。但低能离子注入对生物大分子的分子构象 及其活性的影响研究尚未见报道，同时由于离子注入过程是在真空条件下进行的，那么，真 空本身对生物体特别是生物大分子是否存在影响，也是值得研究的一个问题。 分子生物学发展至今，我们知道，核酸的一级结构( 即核苷酸序列) 及其空间结构( 构 象) 决定物种的遗传特性，而同一种蛋白质其构象不同，则生物功能也不同。酶在生命活动 过程中，扮演着极其重要的角色。理论研究表明咖1 ，酶蛋白的分子构象( 空间结构) 对酶的 功能至关重要，即使及其细微的扰乱，也能够极大地影响酶的活性。而且，蛋白质不是刚性 分子，它的功能依赖于结构的这种运动性。研究离子注入及其真空作用对蛋白分子构象的影 响，对解释宏观离子束生物效应以及推动离子注入机理研究具有重要的意义。 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，简称p o d ，e c1 11 1 7 ( x ) ) 是一类广泛存在于各种植物、动物 和微生物体内的氧化还原酶，催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机物和无机物的氧化作 用”。同时它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切的关系，在植物生长发育过 程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 迄今研究最深入的是植物辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，简称，h r p ) 嘲。它的 晶体结构已获知旧1 ，其活性中心主要催化残基是h i s 4 2 ，a r 9 3 8 ，h i s l 7 0 “1 。目前，过氧化 物酶作为一种商品化试剂广泛用于免疫测定技术、电镜技术和免疫印迹等生物学研究。 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 缩写为s o de c1 1 5 1 1 ) ，是一种具有特定生 物催化功能的蛋白质，由蛋白质和金属离子组成，广泛存在于自然界的动物、植物以及一些 微生物体内。s o d 主要功能之一是催化超氧自由基发生歧化反应生成过氧化氢和氧气，因而 它可清除机体内的超氧自由基，使生物大分子免受损伤，增加抗逆性。目前，s o d 临床应用 主要集中在抗炎症方面。 塑鍪鱼查兰堡主兰些丝塞 酶的功能与其结构有着极其紧密的关系，本文以h r p 和s o d 标样酶为研究对象，实验研 究低能n + 离子注入及其不同真空处理条件对其二级结构含量的变化和活性的改变，通过探求 酶蛋白二级结构含量变化与活性的关系，为低能离子束宏观生物效应的机理研究提供实验方 法和理论依据。 1 3 蛋白质的结构层次 蛋白质是一种含有由d n a 编码的2 0 种l 型n 氨基酸，通过。碳原子上的取代基间形成 的酰胺键连成的，具有特定的空间构象和生物功能的肽链构成的生物大分子。蛋白质的结构 层次可分为一、二，三和四级结构。蛋白质的二、三和四级结构一般也统称为蛋白质的高级 结构呻1 。有些蛋白质在二级结构和三级结构之间，具有结构域和超二级结构的过渡结构。 蛋白质的一级结构( p r i m a r ys t r u c t u r e ) 一般指构成蛋白质肽链的氨基酸残基的排列次 序，有时也称为残基的序列( s e q u e n c e ) 。蛋白质的一级结构是靠共价键维持多肽的连接，而 不涉及其空间排列。蛋白质的一级结构是决定其空间结构的基础，而空间结构则是其实现生 物学功能的基础。 蛋白质的二级结构( s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构 象，不涉及侧链部分的构象，它们是完整肽链构象( 三级结构) 的结构单元，是蛋白质复杂 的空间构象的基础，故它们也可称为构象单元。通常将其分为a 一螺旋( a - - h e l i x ) 、b 一 折叠( 且一s h e e t ) 、b 一转角( b t u r n 或b - - b e n d ) 和无规卷曲( r a n d o mc o l l ) 。各类二级结 构的形成几乎是由于肽链骨架中的羰基上的氧原子和亚胺基上的氢之间的氢键所维系。其他 的作用力，例如范德华力等，也有一定的贡献。某一肽段，或某些肽段间的氢键越多，他们 形成的二级结构就越稳定，即二级结构的形成有一种协同的趋势。蛋白质的各二级结构是完 整肽链构象的结构单元，是蛋白质复杂空间结构的基础。 超二级结构( s u p e r s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常 常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。目前发现的超二级结构 有三种基本形式：o 螺旋组合( oo ) ：b 折叠组合( b8b ) 和n 螺旋b 折叠组合( b b ) ， 其中以bob 组合最为常见。 结构域( d o m a i n ) 是介于二级结构和三级结构之间的一种结构层次，是指蛋白质亚基结构 中明显分开的紧密球状结构区域，而且往往还具有特定的，但不完全的生物活性”7 。 9 堕鍪查查兰堡! 兰些堡塞 蛋白质的三级结构( t e r t i a r ys t r u c t u r e ) 是整个多肽链的三维构象，它是在二级结构的 基础上，多肽链进一步折叠卷曲形成复杂的球状分子结构。具有三级结构的蛋白质一般都是 球蛋白，这类蛋白质的多肽链在三维空问中沿多个方向进行盘绕折叠，形成十分紧密的近似 球形的结构，分子内部的空间只能容纳少数水分子，几乎所有的极性r 基都分布在分子外表 面，形成亲水的分子外壳，而非极性的基团则被埋在分子内部，不与水接触。蛋白质分子中 侧链r 基团的相互作用对稳定球状蛋白质的三级结构起着重要作用。 蛋白质的四级结构呻1 这个概念最早是由b e r n a l 于1 9 5 8 年提出的，四级结构被看成是蛋 白质一级结构、二级和三级结构的延伸。具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的 蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为蛋白质的四级结构 ( q u a r t e r n a r ys t r u c t u r e ) 。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基( s u b u n i t ) 。 四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。亚基之间不含共价键， 亚基间次级键的结合比二、三级结构疏松，因此在一定的条件下，四级结构的蛋白质可分离 为其组成的亚基，而亚基本身构象仍可不变。 维持蛋白质空问结构的作用力主要是氢键、离子键、疏水作用力和范德华力等非共价键。 此外，在某些蛋白质中还有二硫键，二硫键在维持蛋白质构象方面也起着重要作用。 蛋白质的各二级结构是完整肽链构象的结构单元，是蛋白质复杂空间结构的基础。因此， 研究蛋白质二级结构是了解其更高级结构和功能特性的基本条件。 1 4 蛋白质二级结构的研究方法 目前、蛋白质结构分析的常用方法很多，包括x 射线衍射技术( x r a yd i f 红a c t i o n t e c h n i q u e ) 、核磁共振光谱( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，简写为n m r ) 、圆二色光谱( c i r c u l a r d i c h r o i s m ，简写为c d ) 、紫外光谱( u vs p e c t r a ) 、荧光光谱( f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ) 与红外光谱( f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ) 技术等。这些方法各有优缺点1 。 x 一射线晶体学技术是最早用于蛋白质结构测定的方法，也是唯一能给出高分辨率的技术。 它可以分辨到一个原子水平。它的缺点是实验中需要取得蛋白质的结晶，而不是所有的生物 大分子都能够获得良好的结晶，有些大分子的复合物晶体获得比较困难达不到测定的要求。 其次，分子在晶体中往往是被锁定于某状态，晶体培养的时间较长，所得到的晶体往往是 分子处于基态，而分子功能的行使多发生在激发态，过渡态，x 一射线晶体技术很难捕捉的分 i o 塑篓圭查兰堡兰些丝塞 子的功能状态。 n m r 是对x 一射线晶体衍射的有力补充，应用于蛋白质一蛋白质、蛋白质一d n a 等分子间的 相互作用方面，n m r 技术同样具有高分辨率的特点，仅次于x 一射线晶体学技术，可以在溶液 中操作，接近生理状态。缺点是所作样品的分子量要比较小，一般在5 0 k d 以下，而且分子量 越大所测到的谱线就越多，有时各谱线很难分辨，随着超导磁铁的发展，有可能分子量向大 分子挺进，但还是有一定限制。近年发展的高分辨n m r 可以测定分子量小于3 0 k d 的蛋白质溶 液三维结构。但是，对于分子量大于3 0 k d 的蛋白质，由于共振峰数目的增多，以及强的偶极 耦合作用和化学位移各向异性引起的谱线增宽，给n m r 谱峰归属和分子结构测定带来很大困 难。这种困难随着分子量的增加更趋严重。此外，在蛋白质等生物大分子的结构测定中，n m r 固有的低灵敏度，以及较长的实验周期，都在一定程度上限制了n m r 的普遍使用。 此外还有红外光谱与荧光和紫外光谱技术。虽然傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 技术是研 究氢键的强有力手段，此外还具有样品用量较少、蛋白质分子的大小几乎无影响，没有光散 射和荧光的影响及使动力学性质的研究成为可能等优点，但是在样品制备方面还存在这许多 问题：荧光和紫外光谱只能测定蛋白质分子中少数带有发色团的氨基酸残基( 如t r p ，t y r 等) 配】 相比之下，圆二色( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，简称c d ) 光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一 种快速、简单、较准确的方法。 本文采用圆二色光谱，研究低能圹离子注入和真空作用对酶蛋白分子构象及活性的影响。 内蒙古大学硕士毕业论文 第二章圆二色光谱基本概念及与蛋白质二级结构计算方法 1 9 6 9 年，g r e e n f i e l d 最早用圆二色光谱数据估计了蛋白质的构象1 ，相关的研究方法陆 续有报道呻4 1 。特别是近十几年来，用远紫外圆二色( f a r u vc d ) 数据分析蛋白质二级结构， 不但在计算方法和拟合程序上有了很大地发展”1 ，而且随着x 一射线晶体衍射与核磁共振技 术的提高，越来越多的蛋白质的精确构象得到测定，为c d 数据的拟合提供了更精确的数据库 嘲11 。研究者还发现用c d 光谱研究蛋白质三级结构具有独特优点，发展了用远紫# f c d 光谱辨 认蛋白质三级结构的方法及相关程序啡* 1 ：此外，近紫外圆二色( n e a r u vc d ) 作为一种灵敏 的光谱探针，可反映蛋白质中芳香氨基酸残基、二硫键微环境的变化呻。c d 光谱技术作为 研究溶液状态下蛋白质或多肽构象的一种重要手段，已受到研究者的广泛关注“1 。 2 1 圆二色光谱技术基本原理 2 1 圆二色光谱 2 1 1 1 椭圆偏振光的产生及光学活性物质的圆二色性 光波是横波，其电场