（环境工程专业论文）产pva降解酶混合菌系的筛选、发酵条件优化及酶学特性研究.pdf

摘要 摘要 聚乙烯醇( p v a ) 是一种人工合成的水溶性高分子聚合物。因其具有p h 稳定、混溶性及乳 化能力强等优良特性，同时对天然纤维和一般的合成纤维具有较好的粘附性、成膜性和耐磨 性，是目前涤棉织物经纱上浆中的主要浆料。采用p v a 上浆的织物，必须经过退浆处理才能 增加其吸水性。传统的退浆方法是使用7 0 9 0 的热水对棉织物进行洗脱，洗脱下的p v a 随废 水排出。由于p v a 化学耗氧量大，可生化性较差，给水体造成了严重的污染。而利用酶法退 浆，在退浆的同时对高聚合度的p v a 进行降解，提高了退浆废水的生物可降解性，从退浆过 程中的水耗、能耗及对废水的处理费用看，酶法处理较常规方法有较大的优势；同时酶法退 浆条件温和，对棉织物的损伤小，因此对p v a 降解酶的研究越来越受到重视。本论文研究了 一个能够降解p v a 的混合菌系的筛选、该菌系的产酶特性、摇瓶发酵的营养条件和p v a 降解 酶的性质，对酶进行了初步分离纯化，并应用p v a 降解酶进行退浆的小试研究。主要研究结 果如下： ( 1 ) 于宜兴军达纺织厂退浆车间的下水管道的污泥中分离出一个能完全降解1g lp v a 2 0 5 的 混合菌系。该混合菌系完全降解1 9 l p v a 2 0 5 所需的时间大约为2d ，所产的p v a 降解酶胞 内外都有分布，大约比例为4 7 比5 3 。 ( 2 ) 通过平板稀释涂布从该混合菌系中分离出三株可以利用p v a 的菌株，两株细菌和一株霉 菌，其中一株细菌和霉菌能产生胞外p v a 降解酶，但它们产生的胞外酶只能部分降解p v a ， 把三种菌两两混合培养或三者混合培养并不能彻底降解培养基中的p v a 。并对这三株单菌 在p v a 2 0 5 培养基上生长的菌落形态和细胞电镜照片进行研究。 ( 3 ) 对混合菌系的发酵摇瓶培养基进行优化，适宜的发酵培养基组成为( g l ) ：p v a4 ， 酵母 粉3 ，n a n 0 32 ，k e h p 0 41 6 ，k h 2 p 0 4o 2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 ，c a c l 20 0 5 ，f e s 0 4 - 7 h 2 00 0 2 ， n a c l0 0 2 ：p h7 2 。 ( 4 ) 采用了硫酸铵分级沉淀及d e a e 纤维素阴离子交换柱对混合菌产生的p v a 降解酶进行了 分离。发现p v a 降解酶主要集中在硫酸铵饱和度为3 0 4 0 之间，用离子交换柱分离时， 出现两个峰，第一个峰没有酶活，第二个峰的比酶活与最初发酵上清液相比提高了7 倍左 右。 ( 5 ) 混合菌系所产的p v a 降解酶作用的适宜p h 范围为6 0 8 0 ，适宜温度范围为3 0 - - 4 0 4 c ； 最适p h 为7 o ，最适温度为3 5 。 ( 6 ) 对酶法退浆工艺研究中发现，酶法退浆必需满足以下几个条件：1 。合适的温度，2 足 够的酶液，3 足够的氧气，4 p v a 处于溶胀状态。此时上浆棉织物的退浆率是1 0 0 。 但酶法退浆时，随着酶作用时间延长，退浆废水中p v a 的分子量逐渐降低，说明p v a 降 解酶能切割p v a 的分子链。 关键词：聚乙烯醇降解酶，混合菌系，发酵条件优化，酶法退浆 a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) i sak i n do fw a t e r - s o l u b l es y n t h e t i cm a c r o m o l e c u l a rp o l y m e r i tw a s w i d e l yu s e di nt h et e x t i l ea sas i z i n gr e a g e n t i np r e t r e a t m e n to ft e x t i l e ，t h es i z i e dc o t t o nf a b r i c s m u s tb ed e s i z e dt oi n c r e a s ew a t e ra b s o r p t i o n i n 仃a d i t i o n a ld e s i z i n gm e t h o d c o t t o nf a b r i c sw e r e w a s h e dw i t hh o t w a t e r ( 7 0 - 9 0 。c ) t or e m o v ep 溺。w h i c hc a u s e de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nd u et ot h e l o wb i o d e g r a d a b i l i t yo fp v a l i l ep v ac o u l db ep a r t i a l l yd e g r a d e dd u r i n gt h ee n z y m a t i cd e s i z i n g p r o c e s s t h ep o t e n t i a la d v a n t a g e so fe n z y m a t i cd e s i z i n gp r o c e s si n c l u d e dl e s sw a s t e w a t e rt r e a t m e n t c o s t ，m o r ee n e r g ya n dw a t e rs a v i n g s ，a n dt h eq u a l i t yi m p r o v e m e n to ft e x t i l ep r o d u c t s i nt h i ss t u d y , am i x e dc u l t u r e ，w h i c hc o u l dd e g r a d elgl 。1p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) ( p v a ) c o m p l e t e l y , w a ss c r e e n e df r o mas o i ls a m p l e ，t h en u t r i t i o n a lc o n d i t i o n s ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e p v a d e g r a d i n ge n z y m e s ( p v a a s e ) a n dt h ep u r i f i c a t i o no fp v a a s ew e r ei n v e s t i g a t e d t h ee n z y m a t i c d e s i z i n gt e s tw a sa l s oa n a l y z c d t h em a i nr e s u l t sw e r eg i v e na sf o l l o w s ： ( 1 ) am i x e dc u l t u r e ，w h i c hc o u l dd e g r a d e1gl 吐p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) ( p v a ) c o m p l e t e l y , w a so b t a i n e df r o m as o i ls a m p l ef r o mj t m d at e x t i l ef a c t o r y i tt a k e sa b o u tt w od a y st od e g r a d e1gl 吐p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) c o m p l e t e l y 5 3 o fp v a a s ea r ee x t r a c e l l u l a re n z y m e s ( 2 ) t h r e es t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h ep v a - d e g r a d i n gm i c r o b i a lp o p u l a t i o nt h r o u g hd i l u t i o nm e t h o d a m o n gt h e m ，t w ob e l o n gt ob a c t e r i aa n do n ei sm o u l d o n eo ft h eb a c t e r i aa n dt h em o u l dc o u l dp r o d u c e e x t r a c e l l u l a rp v a d e g r a d i n ge n z y m e ，b u tn o n eo ft h e mc o u l dd e g r a d ep v ac o m p l e t e l ya l o n e ( 3 ) t h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm e d i u mc o n t a i n e d ( g t 0 ：p v a2 0 54 ，y e a s t - e x t r a c t3 ，n a n 0 32 ， k 2 肿0 41 6 ，k i - 1 2 p 0 40 2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 ，c a c l 20 0 5 ，f e s 0 4 。7 i - 1 2 00 0 2a n dn a c lo 0 2a tp h7 2 ( 4 ) p v a a s ew a ss e p a r a t e db ya m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o na n dd e a e c e l l u l o s e ( 5 ) t h es u i t a b l ep ha n dt e m p e r a t u r ef o rp v a a s ep r o d u c e db ym i x e dc u l t u r er a n g e df r o m6 0t o 8 0 ，a n df r o m3 0 * ct o4 0 c t h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ef o re n z y m a t i cr e a c t i o nw e r e7 0a n d3 5 。c ， r e s p e c t i v e l y ( 6 ) d u r i n gt h ee n z y m a t i cd e s i z i n gp r o c e s s ，p v am u s tb es w e l l e n p v aw a sp a r t i a l l yd e g r a d e da n d t h eb i o d e g r a d a b i l i t yo fp v ai nw a s t e w a t e rw a si n c r e a s e d k e y w o r d s ：p v a a s e ，m i x e dc u l t u r e ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，e n z y m a t i cd e s i z i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 壁迦堕 日 期： 关于论文使用授权的说明 伽z 哦 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：生逝堕 导师签名：堑叠鲤 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 聚乙烯醇( p v a ) 在纺织工业中的应用及存在的问题 聚乙烯醇是一种人工合成的水溶性高分子化合物，在纺织工业中，p v a 可用于织物上浆， 经纱上浆后粘合力大，成膜力高，膜柔软强韧，不发生化学变化及腐败。 在纺织前处理过程中，经p v a 上浆的棉织物必须经过退浆处理，以增强其吸水性。传统 的退浆方法是使用7 0 9 0 的热水在棉织物表面进行洗脱，有时使用氧化剂如n 出r 0 2 等。不 仅水耗、能耗大，而且在此过程中，必须严格控制操作条件，否则会因高温和氧化作用对棉 纤维造成损伤；更为重要的是其对环境所产生的负面影响：纺织厂排出的废水中含有大量的 p v a 和氧化剂，由于p v a 的可生化性较差( b o d c o d = 0 0 7 ) ，进入水体后大大增加了纺织废 水处理的难度。 随着人们对纺织工业清洁生产的关注，研究者们考虑能否在退浆工艺中就实现对p v a 的 生物降解，即将p v a 降解酶运用于纺织工业的退浆工艺。如果能在退浆工段就实现对p v a 的生物降解，不仅能大大减少p v a 废水的排放，还能避免化学退浆过程中高温和氧化造成的 棉纤维损伤。 1 1 2p v a 的微生物降解 实现对p v a 生化降解的关键在于筛选到能够高效降解p v a 的微生物，从二十世纪七十 年代开始，国内外在筛选能够降解p v a 的微生物方面就进行了大量的研究，但研究结果表明： 与能够降解其它脂肪族高聚物的微生物相比，p v a 降解菌在种类和分布上要少得多，主要存 在于被p v a 长期污染的污水和土壤中。 迄今为止，文献报道的p v a 降解菌主要集中于假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) ，并且其中大 部分细菌呈共生关系。已报道的p v a 降解菌主要分为两种类型：一种是单一的能降解p v a 的细菌。1 9 7 3 年，s u z u k i 等人【l 】首次分离到一株假单胞菌( p s e u d o m o n a s0 3 ) ，它能在以p v a 为唯一碳源的培养基上生长。h a s h i m o t o 等人【2 】分离到一株假单胞菌必须在有酪氨酸、亮氨酸 和半胱氨酸等三种氨基酸和硫胺素的情况下才能降解p v a 。但是单一菌株降解p v a 的效率很 低，难以达到彻底降解的目的。对于单菌，除了p s e u d o m o n a s0 3 【l 】和p s e u d o m o n a sv e s i c u l a r i s v a r p o v a l o l y t i c u lp h t 3 1 ，其余的细菌都不能单独彻底降解初始培养基中的p v a ，p v a 的不彻底 降解造成p v a 降解酶的提取困难，因为在提取过程中p v a 和蛋白会形成一种乳白色的凝胶 状物质【4 5 】，使p v a 降解酶无法提取。并且这些细菌都存在培养周期长，酶活低的问题。 另一种是通过协同作用降解p v a 的共生菌。其中一株菌不直接降解或利用p v a ，但它能利 用由其共生菌降解p v a 所释放出来的一些代谢产物维持生长。王银善等人 4 1 分离出的p v a 降 解菌s b l 是p s e u d o m o n a ss p s b l r 和a l c a l i g e n e ss p s b l s 的共生体系，其中菌株s b i r 为s b l s 降 解p v a 提供生长因子；k i m 6 】等人也分离到p v a 降解菌共生细菌s a ，s a 2 为鞘氨醇单胞菌 s a 3 降解p v a 提供生长因子。另外，c o r t i 等【7 】对混合体系对p v a 的降解进行了研究。并发 现p v a 的聚合度、醇解度和构型对混合体系的降解能力有很大的影响。m o r i 引等研究了用混 江南大学硕士学位论文 合菌所产的酶进行退浆试验。 1 1 3p v a 降解酶性质及其催化降解p v a 的反应机理的研究 要想利用生物处理工艺高效降解p v a ，首先需要了解p v a 降解酶的性质及其对p v a 降 解的机理。目前为止，国内外对p v a 降解酶的分离纯化及其性质方面的研究已开展了一定的 工作。目前已报道的p v a 降解酶主要包含三个种类【9 】：聚乙烯醇氧化酶( 仲醇氧化 酶) ( e c l 1 3 3 0 ) 、聚乙烯醇脱氢酶( e c l 1 9 9 2 3 ) 和p 双酮水解酶( 氧化型聚乙烯醇水解 酶) ( e c 3 7 1 7 ) 。 ( 1 ) p v a 氧化酶( 伸醇氧化酶) p v a 氧化酶最初是从p v a 降解菌p s e u d o m o n a s0 3 的发酵液中分离纯化出来的 1 0 , 1 1 】。该 酶呈淡粉红色，分子量大约是2 6 ，0 0 0 ，每分子酶含一原子铁，酶溶液最大吸收峰分别在2 8 0 、 3 6 5 和4 7 0n l t l ；酶活受c 0 2 + 、n i 2 + 、e d t a 、羟胺和水杨基羟肟的轻微抑制。 m o r i t a 1 2 】从另一株p v a 降解菌p s e u d o m o n a s 的发酵液中也分离到p v a 氧化酶，对该酶 的研究除了其大部分特性与前一种p v a 氧化酶相似外，还发现该酶是单肽链，分子量5 0 ，0 0 0 ， 等电点为p i l l 0 3 ，每个酶分子含一原子非血红素铁。该酶酶活最佳的p h 为7 0 ，最佳温度为 5 0 c ，酶活受到h 9 2 + 、p b 2 + 、z n 2 + 、邻菲哕啉和e d t a 的轻微抑制。s a k a i ”】后来从该菌发酵 液吸附于离子交换色谱柱上的另一活性组份中提纯了又一p v a 氧化酶，该酶等电点p h 为4 5 ， 分子量约4 0 ，0 0 0 ，由免疫扩散反应实验发现，该酶与前者属共同抗原，推断该酶可能是前者 在培养过程中产生的衍生物。 k a w a g o s h i 等【3 】从p v a 降解菌p s e u d o m o n a sv e s i c u l a r i s 培养液中分离纯化的p v a 氧化酶， 该酶无色，分子量约7 5 ，0 0 0 - - 8 5 ，0 0 0 ，等电点p h 为5 7 ；酶活的最佳p h 较宽，约在6 0 - - 1 0 0 之 间，且在4 5 条件下可稳定2 4h 。最重要的是，该酶比其它已报道的p v a 氧化酶有较宽的底 物作用专一性：对碳链大于4 庚醇的底物，该氧化酶仍具有较高的活性，而且该酶对环己醇 和苯基醇的作用活性也较高。因此该酶又叫做宽底物范围的仲醇氧化酶。国内陈明洁等【1 4 j 也 对共生细菌s b l 产生的p v a 氧化酶进行了分离纯化及性质的初步研究。 上述大部分p v a 氧化酶都是胞外酶，但膜结合p v a 氧化酶也是存在的【1 5 j ，细胞产生的 这种p v a 氧化酶9 5 以上分布于细胞的外周质空间，该酶的这种分布被认为可能与细胞更容 易吸收利用p v a 的降解产物有关，而且也可能有利于和细胞膜上的电子传递链相耦合。 综上所述，就所报道的p v a 氧化酶来看，尽管理化特性不尽相同，但它们都具有相同的 催化特性：对p v a 的催化要求碳链较长( 分子量约大于3 0 0 d a ) ，且有暴露的羟基基团，在 0 2 的参与下，羟基基团被氧化成酮基基团，并产生h 2 0 2 。更为有意义的是，当所作用的底物 为除p v a 以外的羟基化合物时，该酶具有较高的底物选择性( 见表1 1 ) ，表中可见该酶主要 对五碳以上的仲醇有催化活性，因此p v a 氧化酶又叫做仲醇氧化酶。 表1 - 1p v a 氧化酶对底物的选择性 t a b 1 - 1p v ao x i d a s ea c t i v i t yt ov a r i o u ss u b s t r a t e s 底物相对活性( ) 底物相对活性( ) p v a1 0 0 伯醇类( 甲醇癸醇) 0 2 第一章绪论 仲醇类 2 丙醇 3 5 2 丁醇 4 7 3 2 戊醇 3 6 3 3 戊醇 1 4 6 2 己醇 6 5 4 3 己醇 4 7 - 3 2 庚醇 7 5 1 3 庚醇 6 8 8 4 庚醇 9 6 6 2 辛醇8 2 9 4 癸醇 1 0 0 1 ，2 一丙二醇 3 2 l ，3 丁二醇 1 5 2 ，2 - 戊二醇 1 9 3 2 5 己二醇 3 8 1 ，2 ，3 一丙三醇0 叔醇类 叔丁醇0 9频哪醇 o 环烷醇类 环己醇 4 1 8 l ，4 环己醇 o 芳香族化合物 苯甲醇 1 3 7 儿茶酚 4 4 其他 甘露糖醇 0 山梨糖醇 o 乳酸0苹果酸 0 柠檬酸 0 乙二酸 0 葡萄糖 o 蔗糖 0 果糖0 ( 2 ) p v a 脱氢酶 到目前为止所发现的p v a 脱氢酶主要是一类需要吡咯并喹啉醌( p q q ) 作为辅酶的脱氢 酶。产生这类酶的p s e u d o m o n a ss p s t r a i nv m l 5 c 1 6 l7 】需要以p q q 作为生长因子，因此该菌 需要与另一产生并分泌p q q 的菌株共生时，才能对p v a 进行降解。该酶属膜结合酶类，主 要催化p v a 脱氢反应；同时在膜上还存在膜结合p v a 氧化酶，其催化活性也是催化p v a 脱 氢反应，但该酶并不以p q q 作为辅酶。因此认为聚乙烯醇脱氢酶可能是寡聚酶类，膜结合 p v a 氧化酶是其亚基，p q q 可能参与构成另一亚基。就所催化的底物而言，p v a 脱氢酶主要 催化仲醇和p v a 脱氢反应，对伯醇则无催化活性，因此该酶与乙醇脱氢酶的醌类酶是不同的。 h a t a n a k a 等【1 8 】报道的p s e u d o m o n a ss p 1 1 3 p 3 能够单独生长在有p q q 存在的p v a 培养基中， 但该菌产生的p v a 脱氢酶不能以伯醇、仲醇和其他二元醇为底物。 另外，编码p v a 脱氢酶的基因 1 9 2 0 】已克隆出来，根据对该基因的核苷酸序列分析，推 断出该酶的结构不同于其它醌类脱氢酶；此外，从该基因中还推断出原血红素c 的结合位点， 说明原血红素c 参与了p v a 的脱氢反应。在编码p v a 脱氢酶基因的上游还发现有编码p v a 水解酶的基因，两者共同构成了一个操纵子，由此可见该细菌编码的两种酶对于聚合物的降 解是必要的。 ( 3 ) 1 3 双酮水解酶 1 3 双酮水解酶又叫做氧化型p v a 水解酶，最初是从可利用p v a 做唯一碳源的 p s e u d o m o n a s 菌株发酵液中分离出来的【2 l 】。该酶溶液无色，属单肽链酶，分子量约为3 8 ，0 0 0 ， 其n 、c 末端氨基酸分别是丙氨酸和苏氨酸，等电点p i l l 0 0 ；酶活最佳p h 6 5 ，最佳温度4 5 ； 3 江南大学硕士学位论文 酶活可受到h 9 2 + 的抑制，但经过还原型谷胱甘肽处理可恢复活性；从该酶作用底物来看，该 酶仅对氧化型p v a 有催化活性，而对许多低分子量酮类化合物并无催化活性。 另外还发现 2 2 1 ，该酶可催化分子量较大的酮类化合物，尤其是4 , 6 壬二酮作为模式的化 合物，可被酶水解成丁酸和戊酮。因此起初对该酶的酶活测定主要是以聚乙烯醇溶液粘度的 降低来表示，目前也有人通过测定酶催化反应的产物来表示该类酶的酶活【2 引。 对这三类酶的催化反应机理目前已了解得较为深入。但菌种不同，所产生的p v a 降解酶 的组合种类也不相同。一种组合是细胞产生聚乙烯醇氧化酶与d 双酮水解酶，另一种组合是 细胞产生聚乙烯醇脱氢酶与b 双酮水解酶，因此对p v a 降解酶催化p v a 降解机理方面也存 在异议。其中较为一致的观点是：聚乙烯醇须经两步酶催化才能得以降解。第一步由p v a 氧 化酶在有氧作为电子受体或由p v a 脱氢酶在有p q q 作为电子受体的情况下，聚乙烯醇氧化 脱氢为酮基化合物。对第二步的反应，一种观点认为第一步反应形成的p 双酮类化合物再由 p v a 水解酶催化裂解；而另一种观点则认为氧化型p v a 的水解反应是自发进行的。f u j i t a 等 【l5 】通过单独与联合使用p v a 仲醇氧化酶和p v a 水解酶对p v a 降解进行了研究，结果认为氧 化型p v a 的自发水解主要是由于酮基型p v a 分子结构的不稳定性造成的，但p v a 水解酶可 能加速了氧化型p v a 的裂解反应。作者将p v a 降解酶催化p v a 降解的可能途径整理见图1 1 。 为了进一步确定p v a 降解酶的作用机制和分泌机制，s h i m a o 等【z o j 在克隆出p v a 氧化酶 的结构基因p v a a 的基础上，又克隆出编码p v a 水解酶的基因p v a b ，并通过大肠杆菌表达出 其基因产物。研究认为，两种基因编码的蛋白质氨基酸顺序与脂蛋白的信号顺序较为相近， 表明p v a 降解酶可能主要附着于细胞膜上，而这种酶的分泌方式对聚合大分子的降解是必须 的；p v a a 基因和p v a b 基因构成了一个操纵子，启动子在p v a b 基因的上游，终止子在p v a a 基因的下游；p v a 仲醇氧化酶可能的功能是优先氧化聚乙烯醇分子中两两相邻的羟基基团， p v a 氧化型产物的化学结构很不稳定，容易自发水解，而p v a 水解酶可加速该水解反应。 一忆c 一彳h 一洲2 一彳h 一洲2 一 oh o h p 篙p q q 纠陷h 2 0 化2 酶 一h 2 c i i c h2 一f i h c h2 0 0 自发反应il 口一双酮水解酶 一忆卜i 叫 0 + o h f l c h 2 0 图i - i 酶催化聚乙烯醇降解的可能反应途径 f i g 1 - 1p v ad e g r a d a t i o np a t h w a yb ye n z y m a t i cr e a c t i o n 4 第一章绪论 1 1 4p v a 降解酶在纺织棉织物退浆中的应用进展 在纺织工业中使用生物酶已经有很多年的历史，包括淀粉酶和果胶酶等。而采用p v a 降 解酶进行棉织物的退浆目前还不成熟，仅仅停留在实验室研究阶段，国内外大型酶制剂公司 至今未推出p v a 降解酶的商品酶，该市场尚处于空白状态。 采用酶法进行p v a 退浆较传统退浆方法有很多优势。m o r i 8 】等进行了酶法退浆与常规热 水退浆的比较，结果表明，由于酶法退浆温度较低并且退浆过程中酶对p v a 进行了降解，因 此该工艺不仅大大降低了退浆过程的能耗，而且由于退浆过程中p v a 得到部分氧化降解，可 生化性得到提高，易于被微生物所利用，这样就为退浆废水的后续生物处理提供了便利的条 件，同时采用酶法退浆也大大减少了常规退浆工艺中氧化剂的使用量。 本实验室先后有三位研究人员进行了酶法退浆与常规热水退浆的比较，也得到相似的结 果。 要从根本上改变纺织工业中传统退浆方法造成的高消耗、高污染，必须大力推动和发展 纺织工业清洁生产技术，实现纺织工业废水的污染防治由“末端治理”向“源头预防”的转变。 因此现在对于退浆废水的治理焦点主要放在退浆方法的改善上。即通过采用高效生物催化剂 处理工艺替代传统退浆方法，以实现：降低水耗、能耗，减少后续废水处理难度；提高 棉织物的品质；操作安全、简便。因此，p v a 降解酶的研究成为目前纺织工业清洁生产技 术的一个重要研究方向。研制具有自主知识产权的p v a 降解酶，对于加强市场竞争，减轻环 境污染将具有重大的意义。 1 1 5 发酵法生产p v a 降解酶研究进展及存在的问题 实现对p v a 生化降解的关键在于筛选到能够高效降解p v a 的微生物。目前关于微生物 发酵产p v a 降解酶的研究有很多的报道，国内外陆续有筛出新菌种的报道，同时对微生物发 酵产p v a 降解酶的发酵条件也有一定研究。文献f 2 4 】考察了发酵条件即碳、氮、磷等营养元素 和浓度以及环境因子温度、转速、氧的传递速率等对细菌产p v a 降解酶的影响。王银善等【4 j 考察了碳源( p v a ) 浓度、氮源种类及通气量对菌株产p v a 降解酶的影响。k i m 等人【6 】对鞘氨 醇单胞菌s a 3 及其共生菌进行了氮源及初始p h 和培养温度的考察。 单菌株发酵产p v a 降解酶存在最大的难题是培养基中的p v a 不能被完全降解。p v a 的 不彻底降解造成p v a 降解酶的提取困难，因为在提取过程中p v a 和蛋白会形成一种乳白色 的凝胶状物质【4 5 1 。得不到纯酶会影响p v a 在纺织工业中的应用，上浆织物含有大量p v a ， 如果在退浆过程中，添加酶制剂的同时又加入p v a ，增加退浆难度，影响退浆效果。 本实验室已筛出四株能降解p v a 的菌株，分别是青霉菌( p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 ) 瞄j 、 放线菌( s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a eg y l ) 1 2 6 1 、紫色杆菌( j a n t h i n o b a c t e r i u ms p w s h 0 4 0 1 ) 【z 7 j 和枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l u sw s h 0 6 2 ) 【2 8 】，但这些菌株都不能单独彻底降解初始培养基中 的p v a 。本实验室张颖【2 9 j 用h p l c 、i r 、h p g f c 等方法分析p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 、 s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a eg y l 和j a n t h i n o b a c t e r i u ms p w s h 0 4 0 1 降解p v a l 7 9 9 的过程，发现 这三种微生物降解p v a 过程比较相似。p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 、s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a eg y l 和j a n t h i n o b a c t e r i u ms p w s h 0 4 0 1 产生的p v a 降解酶存在底物选择性，只能作用一定聚合度 5 江南大学硕士学位论文 的p v a ：p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 产生的p v a 降解酶能作用平均分子量在7 5 7 5 3d a 以上的 p v a ，s t r e p t o m y c e sv e n e z u e i a eg y l 产生的p v a 降解酶能作用平均分子量在6 5 8 5 3d a 以上的 p v a ，d a n t h i n o b a c t e r i u ms p w s h 0 4 0 1 产生的p v a 降解酶能作用平均分子量在7 6 5 1 1d a 以上 的p v a 。 c h i e l l i n i 等【8 】【3 0 】【3 l 】认为要靠单一微生物实现对p v a 的彻底降解是非常困难的，只有通过 驯化混合菌群才能达到对这种高聚物的彻底降解。本实验室张颖已经筛出一个能彻底降解 l g l p v a l 7 9 9 的混合菌系，但其的胞外酶活很低，最大酶活只有0 0 4 u m l ，胞内( 破碎上清 液) p v a 降解酶酶活( 0 0 4 2u ，m 1 ) 和细胞膜上( 碎片复溶液) 的p v a 降解酶酶活( o 2 2u m 1 ) 略大于胞外酶活【2 9 1 。中国科学院成都生物研究所【3 2 1 曾筛出一个能完全降解p v a 的共生菌 b i + b 2 ，取发酵4 8h 的发酵液1 0 m l 左右，在4 c 下经超声波破碎1 5 m i n 左右，制成粗酶液( 包 含胞外酶和胞内酶) ，粗酶液的最大酶活为1 5 8u m l 。 1 2 本论文的主要研究内容 本研究受教育部新世纪优秀人才支持计划资助，江苏省高技术研究项目( 编号： b g 2 0 0 5 016 ) ，主要研究工作包括： ( 1 ) p v a 降解酶产生菌的筛选、鉴定。于宜兴军达纺织厂退浆车间的下水管道 采集的污泥中分离出一个能完全降解l g l p v a 2 0 5 的混合菌系。 ( 2 ) p v a 降解酶高产菌株的鉴定及其产酶特性研究。通过平板稀释涂布从该混合菌系中分离出 三株可以利用p v a 的菌株，两株细菌和一株霉菌，其中一株细菌和霉菌能产生胞外p v a 降 解酶，但它们产生的胞外酶只能部分降解p v a 。随后对这三株单菌在p v a 培养基上的生长 的菌落形态和细胞电镜照片进行研究，并研究了混合菌产生的p v a 降解酶在细胞内外的分 布。 ( 3 ) 混合菌摇瓶发酵条件优化。研究不同培养基条件对酶活的影响，以确定最佳产酶条件。 ( 4 ) p v a 降解酶的分离，采用了硫酸铵沉淀及d e a e 纤维素阴离子交换柱对混合菌产生的p v a 降解酶进行了初步的分离，比酶活比最初发酵上清液提高了7 倍左右，p v a 降解酶得到了 初步提纯。 ( 5 ) p v a 降解酶粗酶液酶学性质的研究及酶最佳作用条件的确定。考察混合菌所产的p v a 降 解酶作用的适宜温度、p h 及温度和p h 的稳定性，在此基础上确定p v a 降解酶的最适反 应条件； ( 6 ) p v a 降解酶的退浆小试研究。分别采用酶法和热水退浆两种方法进行退浆处理，并对棉织 物的退浆效果进行比较。 6 第二章降解聚乙烯醇混合菌系的筛选及产酶特性研究 第二章降解聚乙烯醇混合茵系的筛选及产酶特性研究 2 1 引言 本实验室前期研究中筛选出的三株菌产生的p v a 降解酶不能够彻底降解p v a 。作者曾对 这三株菌不能彻底降解p v a 的原因进行了初步研究，了解是否由于培养中后期营养不够造成 的，在采用紫色杆菌( j a n t h i n o b a c t e r i u ms p w s h 0 4 0 1 ) 和枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l u s w s h 0 6 2 ) 在发酵的第三天、第四天和第五天分别加入1 0m l 营养液( 发酵培养基中除p v a 的其它成分) ，并每天测p v a 的含量，发现在发酵结束后，p v a 的含量并没有很大变化。说 明这两种菌降解p v a 到一定程度即使加营养也不会继续降解。本实验室【2 9 】用p v a l 7 9 9 培养 p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 ，结束培养后离心去除培养体系中的细胞，用丙酮将培养基中剩余的 p v a 沉淀出来，用去离子水洗涤3 次后，再用来配制培养基；将p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 接 种至用沉淀出来的p v a 配制的培养基中进行培养，发现p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 的生长情况 很差。这说明新接种的p e n i c i l l i u ms p w s h 0 2 2 1 不能利用上一次培养结束后培养体系中剩余 的p v a ，它分泌的胞外酶不能作用上一次培养结束后培养体系中剩余的p v a 。对s t r e p t o m y c e s v e n e z u e l a eg y l 和d a n t h i n o b a c t e r i u ms p 。w s h 0 4 0 1 进行同样的实验，得到相同的结果。 国外有筛到只作用于小分子量的p v a ，而不降解大分子量p v a 的报道。例如m o r i 等【3 3 】 从纺织厂的污水处理车间分离出来的菌株b x l 就只作用高聚合度的p v a ，与菌株b x l 相反， m o r i 等 3 3 1 同时分离到的g e o t r i c h u mf e r m e n t a n sw f 9 1 0 1 产生的p v a 降解酶只作用聚合度在 5 0 以下的p v a 。在大分子物质降解过程中，酶和大分子物质的结合方式及大分子物质在水溶 液中的形状会影响降解速率【3 3 1 ，并且当大分子物质的聚合度小于某一数值时，会由于底物分 子太小不能和酶形成足够稳定的结合物而导致降解过程停止。 因此，如果能筛选到能高效降解分子量6 万d a 以下p v a 的微生物，并将它们与实验室 筛选的单菌共同培养，有可能达到彻底降解p v a 的目的。 本章以p v a 2 0 5 ( 聚合度5 0 0 ，醇解度8 7 8 9 ，大约分子量5 万d a ) 配发酵培养基， 期望能筛出完全降解小分子量p v a 的菌株。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 样品来源 取自无锡太平洋纺织厂和宜兴军达纺织厂退浆车间的下水管道处的污水、土壤和活性污 泥。 2 2 1 2 筛选培养基 p v a 2 0 51 g r l ，n i - h n 0 31g l ，酵母粉0 1g i l ，k 2 h p 0 41 6g l ，k h 2 p 0 40 2g l ， m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5g l ，c a c l 20 0 5g l ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 2g l ，n a c lo 0 2g l , p h 7 2 。 2 2 1 3 固体培养基 在筛选培养基成分的基础上，加入琼脂粉2 0g l 。 7 江南大学硕士学位论文 2 。2 1 4 发酵培养基 筛出混合菌系后，研究降解特性时采用发酵培养基： p v a1g l ，酵母粉1g l ，k 2 h p 0 41 6g l ，k h 2 p 0 40 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5g l ，c a c l 2 0 0 5g l ，f e s 0 4 。7 h 2 00 0 2g l ，n a c lo 0 2g l , p h7 2 。 考察其它型号p v a 对混合体系降解p v a 的影响时，用其它型号的p v a 代替发酵培养基 中的p v a 2 0 5 。 2 2 1 5 其他材料 p v a 2 0 5 ( 聚合度5 0 0 ，醇解度8 7 8 9 ) 由日本可乐丽株式会社生产，p v a l 7 9 9 ( 聚合度 1 7 0 0 ，醇解度9 9 ) ，四川维尼纶厂生产。其他化学试剂均为国产分析纯。 2 2 2 培养方法 2 2 2 1 降解p v a 混合菌系的分离 将由纺织厂退浆车间的下水管道处采集的污水、土壤和活性污泥等样品8 份各取少量置于 0 1m o l l 的n a c l 溶液中，混匀，再取适量置于筛选培养基中，于3 0 ，2 0 0r m i n 下振荡培养 3d 后，由摇瓶中吸取1m l 混合培养物移入新鲜的筛选培养基中，重复几次后，检测、比较不 同培养体系中p v a 含量的变化，选择其中p v a 含量下降最多的混合培养物继续培养。 2 2 2 2 降解p v a 单菌落的分离 将上述培养液涂布于固体培养基，在平板生长出菌落后倾入适量碘硼酸试剂( 2 5g l 硼酸 溶液：o 1m o l l1 2 k i 溶液= 1 0 ：1 ，v ：v ) ，察看菌落周围产生透明圈的情况，有透明圈产生的菌 落表示有p v a 降解酶酶活，透明圈越大，表示p v a 降解酶酶活越高。在对应的影印平板上 挑选透明圈大的单菌落至斜面传代保存，通过平板稀释涂布从该混合菌系中分离出三株可以 利用p v a 的菌株。 2 2 2 3 摇瓶培养 将在筛选培养基中培养3d 的混合体系吸取1m l 接入装有3 0m l 培养基的2 5 0m l - - - 角瓶 中，于3 0 ，2 0 0r r a i n 振荡培养3d 。菌系驯化好后改为发酵4 8h 转接。 研究分离得到的纯菌株降解p v a 的能力时，用接种环挑取2 环保存在斜面上的菌体接入装 有3 0m l 培养基的2 5 0m l - - - 角瓶中，于3 0 ，2 0 0r m i n 振荡培养。研究三种菌株组合降解p v a 的能力时，用接种环各挑取l 环保存在斜面上的菌体接入装有3 0m l 培养基的2 5 0m l - - 角瓶 中。 2 2 3 分析方法 2 2 3 1p v a 含量测定 j d 曼据f i n l e y t 3 4 】报道，通过比色法测定p v a 。在5 0m l 的容量瓶中，依次力l l x 1m l 待n p v a 溶液，1 5m l 2 5g l 的硼酸溶液和1 5m lo 1m o l l 的1 2 k i 溶液，加水至刻度，摇匀，1 0r a i n 后， 用1c r n l 匕色杯，以空白为参比，在6 9 0b i n 处测定吸光值，以吸光度值大小来表示p v a 含量的