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硕士学位论文 y 5 7 14 79 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 摘要 细胞工程用微针是微注射系统的重要组成部分，其制作与测量的精度对微注射性 能起关键的作用，直接关系到微注射的成败。本文较详尽地论述了微针的制作原理， 经过大量试验，总结出了工艺参数对微针几何参数的影响规律：在深入分析、比较各 种测量方法的基础上，设计出一套基于c c d 的微针显微测量系统；对显微测量软件 各子模块的设计原理和实现方法进行了详细讨论，并且用v i s u a lc + + 6 0 实现了各个 模块的功能；系统经过标定后，对部分微针进行了实测，实验结果表明测量系统运行 良好；论文最后采用“气泡最大压力法”测定出微针内径，同时对实验结果进行了一 定的分析和总结。 关键词：细胞工程，微注射，微针，测量软件，c c d ，图像处理 硕十学位论文细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 a b s t r a c t a sa k e yp a r t o fm i c r o i n j e c t i o ns y s t e m ，t h e m a n u f a c t u r i n g a n dm e a s u r i n g p r e c i s i o no fm i c r o p i p e t t eu s e db yc e l le n g i n e e r i n gm a k ea ni m p o r t a n tr o l ei n t h ep e r f o r m a n c eo fm i c r o i n j e c t i o n ，s om u c ha sd e t e r m i n i n gw h e t h e ri tc o u l db e s u c c e s s t h em a n u f a c t u r i n gt h e o r yo fm i c r o p i p e t t ei sd i s c u s s e di nt h i sa r t i c l e t h el a wo fm i c r o p i p e t t eg e o m e t r yp a r a m e t e re f f e c t e db yt e c h n o l o g yp a r a m e t e r i sa l s os u n u n a r i z e da f t e rl o t so fe x p e r i m e n t o nb a s eo fv a r i e t yo fm e a s u r e m e n t s b e i n ga n a l y z e da n dc o m p a r e dt h o r o u g h l y ，t h em i c r o m e a s u r es y s t e m b a s e do nc c d f o rm i c r o p i p e t t ei sd e s i g n e d 。t h ed e s i g nt h e o r ya n di m p l e m e n to fe a c hm o d u l e o ft h em i c r o m e a s u r es o f t w a r ea r ed i s c u s s e di nd e t a i l ，a n dt h es o f t w a r e i s d e v e l o p e db y v i s u a lc + + 6 0 t h er e s u l to fe x p e r i m e n t si n d i c a t e t h a tt h e m i c r o m e a s u r es y s t e md e m a r c a t e dr u n ss t a b l ya n dr e l i a b l y a tl a s t ，an e w m e t h o d n a m e db u b b l em a x i m u mp r e s s u r ei sa d v a n c e dt om e a s u r et h ei n n e rd i a m e t e ro f m i e r o p i p e t t e ，f u r t h e r m o r e ，t h ee x p e r i m e n t d a t aa r ea n a l y z e dt os o m ee x t e n t k e y w o r d s ：c e l l e n g i n e e r i n g ，m i c r o i n j e c t i o n ，m i c r o p i p e t t e ，m e a s u r e s o f t w a r e ，c c d ，i m a g ep r o c e s si n g 硕士学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 1 绪论 1 1 细胞微注射技术原理 随着人类迈入2 l 世纪，作为前沿技术的生物工程技术得到了较大的发展。许多 细胞级操作：如植物细胞的染色体切割，细胞融合，动物卵细胞转基因注射等均成为 当前生物工程的研究热点。目前，经常用到的细胞操作技术主要包括细胞核移植、细 胞内药物注射，细胞核内d n a 注射、胚胎注射及细胞单个分离等。按操作性质分，细 胞操作主要分成两大类：细胞注射，细胞切割“。 细胞微注射技术现在已经成为向活细胞体内引入物质的最佳方法之一，微注射使 得我们能够使用单细胞为研究对象，来研究体内复杂的细胞过程、结构和功能。可以 用于微注射的分子很多，如蛋白质、核酸等，都可以注射到细胞里面，并分析它们在 细胞内的活动情况。微注射可以应用在细胞学、细胞生物学、生理学、分子生物学、 发育生物学和药理学等领域。可以分析酶与酶系统的功能、细胞结构蛋白、激素的控 制机制、细胞内和细胞间的调控机制、信号传递与细胞周期研究、转运过程、蛋白质 生物合成和遗传信息的翻译与转录等“1 。 “工欲善其事，必先利其器”，随着细胞微注射技术的广泛应用，对实验手段和 实验设备也提出了较高的要求。比如，设备操作的容易程度以及微注射量的控制精度 等问题。在细胞微注射过程中，微注射的量一般要求不超过细胞总体积的2 0 ，因 此，对微注射量的可控性提出了较高的要求。”。 目前，定量微注射常用的有如下几种方法”“： 1 、包被针尖法 在包被针尖方法中，将针尖f 密闭针) 浸到即将导入到细胞的物质溶液中。然后将 浸蘸有样品液的微注射针刺入细胞，样品在细胞质中溶解。这种方法虽然既快又简单， 但对实际上导入细胞中样品的量是难以控制的。 2 、被动注射法 在被动注射方法中，针中充满注射溶液。溶液的填充是依赖虹吸的作用，即将针 管术端插入溶液中使其针头充满溶液。也可将针头置与一定体积的样品中，使针的开 放端由于虹吸作用而充满。将针刺入细胞中，样品被动地流入细胞中。这种方法避免 了包被针尖方法所遇到的许多问题，包括由于针尖干燥使样品变性问题。另个优点 是导入到细胞中的物质的浓度是已知的，但控制注射的量极为困难。这是由于时间、 位置以及导入样品进入细胞的速度无法精确控制。 砸【1 学位论文 细胞工程用徽针的拉制与测量技术研究 3 、直接压力法 相对于以上两种方法而言，直接压力法微注射应用较为广泛。它对大量的特异分 子如细胞骨架蛋白质是很有效的。这种方法有如下两种不同的方式： 恒定流动显微注射 恒定流动显微注射方法最初是由g r a e s s m a n ( g r a e s s m a r m1 9 7 0 ； c r l a e s s r l l a n 和 g r a e s s m a r m1 9 8 3 ) 开发成功的。他提出一种非常优秀的方法将相对恒定量的物质导入 到生长与玻璃器吼内的培养细胞中。注射物质的量取决于注射液中样品浓度、通过针 尖的速度和针尖停留在细胞质中的时间。然而由于该方法要精确的测定样品溶液流过 针尖的速度是有一定困难的，因此，想精确测定最后注射入细胞中的溶液量是不可能 的。另陔方法所需注射物质较多，因此对于十分宝贵的样品是不适合的。 脉冲流动注射 脉冲流动注射方法可能是当前最为广泛使用的方法。其主要原理是利用压力控制 装置导入可控的脉冲气流来驱动小份溶液通过针尖，从而实现定量注射。 本课题所用微注射原理与上述几种微注射方法是截然不同的。其微注射基本原理 主要是利用压电陶瓷的逆压电效应。我们知道，在压电陶瓷电介质极化方向加电场， 压电陶瓷会产生机械变形，当去掉外加电场，压电陶瓷的变形随之消失。微注射正是 利用这种效应产生的惯性力将微针中的液体喷射到细胞中的，如果在压电陶瓷上加上 周期性的脉冲信号，微针中也将周期性地喷射出定量的液体，从而实现量可控。 l 。2 细胞微注射技术发展状况 对活细胞的显微操作起始于2 0 世纪的前半叶，首先应用于电生理的研究。在4 0 年代后期，建立了细胞内记录的可靠方法。在以后不到十年间，使用类似的技术直接 将生物物质转送到细胞i t ( c h a m b e r s & c h a m b e r s1 9 6 1 ) 。起初微注射的目的是向培养的 受体细胞中转移哺乳动物的细胞核( r a e s s m a n n1 9 7 0 ) 署d 染色体( d i a c u m a k o s1 9 7 3 ) 。随 着物质的提纯和设备的改进，已经能够向细胞内转移不同来源的大分子溶液，比如病 毒r n a ( g r a e s s m a r m & r a e s s m a n n1 9 7 6 ；s t a c e y e ta 1 1 9 7 7 ) ，纯化的蛋白质和病毒d n a 。 人们采用同样的方法，利用微注射把d n a 转移到受精卵中。不久，人们把重组基因 稳定地引入到鼠生殖细胞系中。从此以后，微注射成为转基因动物研究的常规方法， 广泛地应用于活细胞的研究中，如基因表达、信号转导或细胞骨架研究等“a 当今世界的其它国家对微注射技术的研究方兴未艾。美国、目本、加拿大、瑞典 等国家都有不同类型的微注射机器人的出现，其中特别著名的有美国的s u r e r 公司和 只本的尼康公司，但他们共同的特点是微注射时通过对气体压力的控制来实现对注射 量的控制的。“。相比较而言，在国内，关于这方面的研究就非常的少，南开大学机 硕士学位论文细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 器人与信息自动化研究所主要对细胞染色体切割的微操作机器人进行了一定的研究， 并且也取得了一定的成绩。 综合而言，与国外相比，国内微注射领域研究队伍比较薄弱，资金投入不足，有 待于进一步的发展。 1 3 论文背景和主要工作 本论文的研究背景是江苏省高技术研究计划细胞工程用微操作机器人系统及其 配套微工具制造设备的研制( 项目编号b g 2 0 0 1 0 2 3 ) 。南京理工大学机械工程学院 微系统研究室承担了该课题的研制任务。如前所述，由于我国在细胞微操作方面的研 究还不够，因此，目前细胞工程中的微操作设备全部依赖进口，外商一般将微注射器 极其附属设备微拉针仪、磨针仪等进行捆绑式销售。世界上较著名的制造商有美国的 s u t t e r 公司和日本的n i c o n 公司。微拉针仪的售价约在3 0 0 0 美元左右，配售专用拉针 所需的毛细玻璃管，单只售价近1 元人民币，由于所售微拉针仪在拉制微针时是根据 该配售毛细玻璃管材料及规格制定的，拉伸工艺参数制作成数个模式固化到机器的控 制芯片中，当我国用户试图利用该拉针仪用国产毛细玻璃管为原材料拉制微针时达不 到微注射的基本要求，只能购买进口毛细玻璃管，所耗费用极高( 微注射针极容易折 断) ，因此微注射系统及微针技术国产化是一个非常紧迫性的课题。1 。但微针的国产 化问题就牵涉到微针制作设备的设计、工艺参数对微针几何参数的影响、微针各种几 何参数的测量等问题。在微注射过程中，微针几何参数对微注射性能起到至关重要的 影响作用，如果不能准确地制作、测量出微针几何参数，微注射注射量是根本无法得 到有效控制的。因此，微针技术对本课题来说是个重点、难点，本人正是在这样的背 景下致力于本课题的研究。 在此课题研究过程中，本人主要完成的工作如下： 1 、参与了拉针仪的研制工作。 2 、完成了对微针材料分析与选择。 3 、在大量实验的基础上，总结出工艺参数对微针几何参数的影响规律。 4 、对微针几何参数的测量方法进行了深入的分析、探讨与研究，最终设计出一 套基于c c d 的显微测量系统，并且用v c + + 6 0 实现了显微测量软件部分。 5 、设计出“气泡最大压力法”的实验方法对微针的内径进行了测量。 硕l 学位论文 细胞工程用徽针的拉制与铡量技术研究 2 微针的制作原理与工艺参数的控制 2 1 微针材料的选择n 7 2 。2 1 3 2 1 1 细胞微注射对材料性能的要求 根据细胞微注射的特点，对细胞微注射用的微针提出7 如- f 的几点的要求。： ( 1 ) 一定的化学稳定性：在细胞微注射时，由于细胞培养皿中的培养基溶液要 具有细胞正常的生存环境，因此会具有一定的酸性或碱性，且微针中的样品溶液也可 能具有一定的酸性或碱性。因此，对微注射用微针材料就有特殊的要求，需具有较强 的化学稳定性，能够抵抗一定的酸、碱性。 ( 2 ) 较好的工艺温度特性：细胞微注射对微针的直径提出了较高的要求，一般 在几个微米左右，如此小的直径一般只能采用拉制的方法，而拉制时要涉及n ；b n 热温 度的问题，因此，这种材料要适于采用拉制的方法，且工艺温度一定要恰当，不能太 高，否则很难加工。 ( 3 ) 一定的机械强度：首先微针需要与注射器联接，另外，微注射时，微针需 要扎入细胞核内，细胞本身具有一定的韧性，因此，对微针就提出了一定的机械强度 要求。 2 1 2 材料的性能分析 综合上述三个方面的要求，考虑到各种材料的性能，粗略选择玻璃为微针的材料， 但是玻璃由于成分的不同，其物理、化学性能相差很大，因此，在玻璃的组成成分上 还要进行选择，当然，玻璃成分的选择还要从成分对上述几个方面性能的影响上进行 入手。 1 、化学稳定性方面 ( 1 ) 从玻璃结构影响的角度 大量的学者对玻璃的化学稳定性进行了较为长时间的研究结果有些学者认为玻 璃的化学稳定性是和玻璃的结构密切联系在一起的，斯达威尔斯等认为化学稳定性是 由玻璃结构的化学键来决定的。化学稳定性好的玻璃，必须具有强大的结构网能量， 而同时具有大的机械强度与硬度。 而帕立需等认为化学稳定性好的玻璃必需有两个条件：i 、玻璃网状形成物比例 要多；i i 、网状结构形成物的阳离子电荷要多，直径要小。 从这两种假说出发，化学稳定性好的玻璃成分应该是： i 、由于s ，与旷能形成玻璃中的网状形成物，因此，s i4 + 与b 3 + 比例应该多些， 坝上学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 也就是应采用高硅氧与高硅硼硅酸盐玻璃。 i i 、考虑到阳离子的高电荷和小体积，在网状形成物中，应采用s i 4 + 与旷。因 s i 在四价的网状形成物中，半径是较小的( 如s r 之半径r = 3 9 纳米，而g e 4 + 之r = 4 4 纳米) ；而b “在同电荷的阳离子中，半径也是较小的( 如b 3 + 之半径r = 2 5 纳米 而v ”之半径r = 6 5 纳米，a s “之半径r = 6 9 纳米，s b “之半径r = 9 0 纳米) 。 ( 2 ) 从受侵蚀的机理来考虑 玻璃防止被侵蚀的机理是保护膜( 凝聚物) 的生成，不同成分的玻璃其凝聚物情况 是不同的，可分为下列三个类型： i 、不形成保护膜的凝聚物。如磷酸盐玻璃及石英玻璃。磷酸盐玻璃继续溶解， 故其化学稳定性很差。石英玻璃根据邦达威金的研究，在3 1 0 。c 时，石英玻璃的溶解 速度比其它玻璃大得多。 i i 、形成多孔状保护膜的凝聚物。如m r ，d n s i o ，玻璃，在水解时，r ，0 溶解于 水，而$ i 0 。也有部分溶解，但大部分形成多孔状的保护膜，这种保护膜仍不够稳定。 i i i 、形成复杂保护膜的凝聚物。如硼硅酸盐玻璃，在硼硅酸盐中，根据研究，认 为加入氧化硼达8 1 5 ，此时在，o b ，0 3 一s i 0 2 系统中形成 x n a ，0 y b 2 0 3 z s i o ，凝聚物，则以x = 0 0 8 l o 1 3 、y = o 0 6 1 o 0 8 7 、z = 0 8 0 8 5 比较稳定。复杂的凝聚物常常会分解为简单的凝聚物，这些过程是很复杂的， 所以从生成保护膜的稳定性看来，在玻璃中加入适量的氧化硼能够大大提高其化学稳 定性。 2 、工艺温度特性方面 一般玻璃成分中，通常包括两部分氧化物，及网状形成物与改良物，而不同的形 成物与改良物对玻璃的稳定性、熔点有较大的影响。 从网状形成物来看，对我们有用处的是s i4 + 与b 3 + 。其它一些网状形成物如p ”的 稳定性不够。 s ，可以单独形成玻璃，此种玻璃即是石英玻璃，键的强度很高，所以其性能很 好，但比较难熔，成型也困难。b 3 + 也可单独形成玻璃，此时是 b o 。 的结构。其化 学稳定性及热稳定性都不好的，所以不会采用单纯的b 。0 3 的玻璃。在s i 0 2 与b 2 0 。二元 系中，当二氧化硅含量在5 0 以上，熔化就困难了。即使二氧化硅含量在2 5 ，在 1 5 0 0 。c 下熔化也需要4 5 小时。二氧化硅含量再多，则粘度更大，同时其性质并不 理想，且熔化困难，显然不宜采用。 因此，我们可以看出单独使用网状结构形成物来制造玻璃，还存在很多问题。在 玻璃中必须加入一些网状改良物。加入的改良物，希望阳离子电荷小，而离子半径较 大，使m e o 键减g g ，起助熔作用，同时也可得到所需要的性能。考虑到这一点，故 在玻璃中可加入网状改良物，成为多元系统。最常用的是在b ：o a - - s i o z 系统中加入 硕士学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 n a + ，成为b ：o 。- - s i o ：- - n a 2 0 系统。在这种情况下，b 3 + 的配位数改变了，既有 b 吼 也有e b o ， ，且e b o 。 与e b o 。 按一定的比例，使玻璃结构变得很紧密和稳定。由于 n a 的加入，使得玻璃易熔，即具有较好的温度工艺性能，如有a 1 。0 。少量的加入，更 能构成具有高度稳定性的玻璃，此种玻璃较含有同量二氧化硅的其它玻璃具有较低的 熔点。 2 。1 3 材料的选择结果 综合上述的分析，细胞微注射用微针的材料适宜选用硼硅酸盐玻璃，且其中的成 份需控制在一定的范围内，我们选用的硼硅酸盐玻璃的组分如下所示： s i o ，7 4 8 a 1 ：0 ，8 5 b 2 0 1 4 5 n a 2 0 4 5 k 。0 - * - 0 5 其软化温度为7 7 0 c 1 06 c 。 2 。2 微针的拉制 2 2 1 微注射对微针外形的具体要求 根据细胞微注射的实际情况需要，对微针的外形提出了如图2 2 1 所示的要求： 卜脚忻，一鲥籼忏一 ij一一_ 二型 1 j 一彩驴 针尖斜角徽针内径 图2 2 1 微注射用微针外形图 2 2 2 拉针仪的工作原理 由玻璃成型理论可知，玻璃液的粘度值决定了玻璃成型的温度范围；固化速度值 决定了玻璃成型中各个操作工序的延续时间：拉制工艺的控制失调，将导致针管弯曲， 在针管处出现气隙、条纹、结石、析晶等现象2 “。拉制的加热温度、加热时间、拉 硕 学位论文 细胞工程用微针的拉制与测孽茎术研究 伸速度、加热和拉伸之间的顺序和时间间隔以及加热线圈的长度都是关键的工艺参 数。 经实验证明采用等速拉伸不能满足要求，玻璃加热的溶化时间也不能精确控制， 这意味着通过测量玻璃管熔化温度控制拉伸的开始时间，通过电机及螺旋传动使卡头 下移拉制微针的工艺方案不可行。实验表明，只有拉伸速度逐渐加快才能拉制出如此 细的针头( 且为锥形) 。由于拉制时间仅1 秒左右，靠机械调速方式达不到如此快的反 应速度。电磁卡头变速拉伸和重物拉伸符合变速拉伸要求。电磁卡头变速拉伸可通过 调节卡头线圈电流来改变拉伸速度及拉力，但成本高且结构复杂。而重物拉伸的速度 变化唯一且可知，拉伸力可以通过增减砝码来调节以适应不同规格的玻璃管，结构简 单、成本低且工艺稳定。为此南京理工大学微系统研究室研制了可改变各项工艺参数 的的微拉针仪”“。其外形如图2 2 2 所示： 图2 2 2 拉针仪外形图 拉针仪原理图如图2 2 3 所示： 图2 2 3 拉针仅原理图 豪一 轾燃 醒蕈。幸蜜 肭霎| 颁i7 学位论文 细胞工程用徽针的拉制与测量技术研究 拉针仪的工作原理如下：硼硅酸盐玻璃管装夹在固定卡头和活动卡头之间，活动 卡头的底部配有可改变重量的砝码块，当加热丝通电时，硼硅酸盐玻璃管将受热变形， 当温度达到硼硅酸盐玻璃的塑性加工工艺温度时，在砝码的重力作用下，硼硅酸盐玻 璃管将被拉长，最终可形成半成品的微针。通过调整调压器可以调整加在线圈上的电 压值，从而可以调整加热温度。调整时间继电器初值，可以改变加热时间。而加热线 圈的圈数及砝码重量均为可调的，从面可以改变微针的几何参数。 图2 2 4 为拉制后的微针在c c d 下的显微图像。 2 3 微针的磨制 图2 2 4 拉制后的微针 2 3 1 微针磨制的必要性 拉制后的微针需要在针尖处磨制出一斜角是由以下三个原因决定的“： 1 、拉制后的微针，有些针尖是处于不通的状态，因此，需要采用磨制的手段才 可以使其通畅。 2 、磨制出斜角的微针更有利于扎入细胞内。 3 、某些黏度较大的样品( 如大d n a 或r n a 分子，或大分子蛋白质及亚细胞碎 片) 采用磨制斜角的方法可以在不增大针颈部的截面积( 即增大针尖直径) 情况下，增大 弯曲部位出口腔的面积，从而更有利于注射( 阻力变小) 。 2 3 2 微针磨制的原理 南京理工大学微系统研究室研制的磨针仪采用的是旋转磨制的方法，其基本磨制 原理如图2 3 1 所示枷： 硕士学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 砂轮面 砂轮面 针 角度 图2 3 1 微针磨制原理图 磨针仪上的砂轮面由可调速的电动机带动不停地旋转，通过一个微进给机构将微 针以某一个角度( 角度可调) 向砂轮面进给，最终依靠砂轮与微针之间的相对运动在针 头处磨制出斜角。 图2 3 2 为经过磨制后的不同角度的微针在c c d 下的显微照片。 ( a ) 3 0 度( b ) 4 5 度 ( c ) 6 伊度 图2 3 2 磨制出的不同角度的微针 2 4 工艺参数对几何参数的影响 2 4 1 研究影响规律的目的与方法 在细胞微注射过程中，微针的某些几何参数对系统的性能影响较大，甚至是决定 性的作用，因此对微针的某些几何参数提出了定量的要求，也即在微针的制作过程中， 要能控制住微针的几何参数。这就需要研究工艺参数对微针几何参数的影响规律。 对微针而言，需被控制的几何参数为： 微针的针尖内径值d ( um ) 微针的针尖外径值d ( pm ) 微针针尖半锥度t ( 。) 微针针尖处的斜角a ( 。) 。 由微针的制作过程可知，微针的针尖内径值d 、微针的针尖外径值d 、微针针尖 颂i ：学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 锥度t 均是由拉针工艺所决定的，而微针针尖处的斜角a 是由磨针工艺所决定的。我 们知道，微针磨制时可通过调整磨针仪的角度调整机构来实现对微针针尖处的斜角a 的调整，因此，斜角n 的影响因素是单方面的，获得某一个值是比较简单的。因此， 对工艺参数影响规律的研究主要是针对拉针的工艺参数而言的。 由拉针仪的原理可知，在制作过程中，影响微针几何参数的工艺因素很多，且每 个工艺影响因素都可能会影响几个不同的几何参数，因此这样就会使得问题的复杂 化。欲得到一定几何参数的微针时，将面临不知调整些什么样的工艺参数，且具体调 整到什么样的数值等问题。因此，要想完全控制住微针的几何参数，必须找出各影响 因素对微针几何参数影响的规律，这样才能按照影响规律制作出完全符合实验需要的 微针。 经过对拉针仪深入的研究以及大量的试验后发现拉制微针时影响针尖几何参数 的工艺参数主要包括：1 ) 加热电压( u ) ；2 ) 电阻丝的加热长度( 1 ) ；3 ) 活动卡头上砝码 的重量( g ) 。固定一组参数，只改变其中一个参数拉制微针，测出微针的相关几何尺 寸，通过对实验数据的曲线拟合可以得到这一参数对微针几何参数的影响规律，对其 它工艺参数采用同样的方法，从而实现对工艺参数有效控制的目的。 2 4 2 影响规律的研究与总结 加热长度( 1 ) 对微针的影响 固定合适的电压( u ) 和砝码重量( g ) 值，改变加热范围( 1 ) ，可分别得到微针内径 d ( “m ) ( 表2 4 1 ) 、半锥度to ) ( 表2 4 2 ) 的原始数据。 实验参数为：电压( u ) ：1 2 v ；砝码重量( g ) ：1 5 k g ；硼硅酸盐玻璃管：外径1 6 姗， 内径1 o m m ，长9 0 唧。 表2 4 1 微针内径和加热长度关系的原始数据 微针编号 加热长度l ( m m ) 微针内径d ( u m ) 0 1 #2断 0 2 #39 7 0 3 #49 9 0 4 #59 5 0 5 #69 6 0 6 # 79 4 0 7 #89 8 0 8 #99 6 一1 0 硕t 学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 表2 4 2微针半锥度和加热范围关系的原始数据 微针编号 加热长度l ( m m ) 半锥度t ( 。) 0 1 撑2断 0 2 #31 5 0 3 #4 1 4 0 4 #51 6 0 5 #6 1 3 0 6 #7 1 5 0 7 #8 1 7 0 8 #9 1 4 分别画出上述两表中的原始数据的曲线走势图如下 1 0 9 5 皇 j 9 一 q 8 5 8 o 5 0 。二：舞。j 。1 ：塞验焦散点 。? 篁誊；蠹i 鞭黪j 囊鹜。鬻鹱麓骥器。冀烹，。j o ” 。j 警群麓蓦嚣重1 鞴搿! 薯肇l 署 t ，霭譬拦：i 曩* 1 一二= _ ，。1 一奠j 。- _ z 曩誊舅、棼嚣。：_ _ i _ ”i 誊j f 臀薹宰搿”复：3 7 j j ；纂 r 冉? ：7 0 羔m ：置；”一，o i tlif 1i l 0123456 7891 0 l ( m m ) 图2 4 1 微针内径和加热长度关系实验数据散点图 0l234 5678 91 0 l ( m m ) 图2 4 2 微针半锥度和加热长度关系实验数据散点图 由图中散点分布趋势可明显看出，加热长度对微针内径、半锥度的影响不明显。 碳i = 学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 图中的散点波动是由于工艺参数的波动、拉针器的精度以及测量精度的误差所造成 的。 加热电压( u ) 对微针的影响 固定合适的加热长度( 1 ) 和砝码重量( g ) 值，改变加热电压( u ) ，可分别得到微针内 径d ( pm ) ( 表2 4 3 ) 、半锥度t ( 。) ( 表2 4 4 ) 的原始数据。 实验参数为：加热长度( 1 ) ：5 m m ；砝码重量( g ) ：1 5 k g ；硼硅酸盐玻璃管：外径 1 6 m m ，内径l _ o m m ，长9 0 r a m 。 表2 4 3 微针内径和加热电压关系的原始数据 微针编号加热电压u ( v )微针内径d ( um ) 0 1 撑61 3 0 2 #81 2 t 2 0 3 #1 0 1 0 3 0 4 #1 2 9 5 0 5 #1 49 0 0 6 #1 6 7 5 0 7 #1 8 7 0 8 #2 06 1 表2 4 4微针锥度和加热电压关系的原始数据 微针编号加热电压u ( v )半锥度t ( 。) 0 l 撑 61 0 2 # 81 1 0 3 #1 0 1 4 0 4 # 1 21 6 0 5 #1 4 1 9 0 6 # 1 62 0 7 #1 8 2 4 0 8 #2 0 2 9 同样画出上述两表中的原始数据的曲线走势图如下 硕士学位论文细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 1 4 1 2 售1 0 直 苦8 6 4 024681 01 21 41 6 1 82 02 2 u ( v ) 3 2 1 o 图2 4 3 微针内径与加热电压关系实验数据散点图 宴验信散点 。7 j 。：_ 、 - 7 譬。： = 。j 蘩! 、 争。” 一* 葛二一_ _ _ 澄j 螬粤一一，1 j 。! 。”7 1 ”磐 f 。 ：= 。，t ：* ，= o r x _ 。、j) ：一 鼋t ! 誊i 鬟墓滚鹣铺g 谶i j 墨j ；” ：| 一曩 ， 7 二 1 14 f 3 群 竹_ j = “ ni ：一：1 _ 1 _ i j 盘忍，臻冀譬i 鼋鼍挥z 蝌r # 、 滞 “ 一 一、j 。 4681 01 21 41 6 1 82 02 2 u ( v ) 图2 4 4 微针半锥度和加热电压关系实验数据散点图 由散点走势图可明显看出，微针内径与加热电压为反比关系，且基本上是线性的。 而微针锥度与加热电压之间成正比关系，基本上也为线性的。 为了拟合出图2 4 3 中的函数关系，可假设其函数关系为： d = 口“+ 6( 2 4 - 1 ) 其中口和6 为待定系数，采用最小二乘法的原理进行拟合1 2 州。 由最小二乘法的定义，要使得下式取得最小值： 8 2 s = d f 一( 口”i + 6 ) 】 ( 2 4 2 ) f = 1 只要使得下两式成立： 詈羔掣州叩刎= 。 ( 2 4 3 ) 坝士学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 面o s = _ 2 f 三8 1 v i - ( a u i + 6 ) 】= 。 ( 2 删 将原始数据代入( 式2 4 3 ) 、( 式2 4 4 ) 可解得： a = - 0 4 9 5 b = 1 5 7 6 其函数关系为： d = 一0 4 9 5 u + 1 5 7 6 ( 2 4 5 ) 同理可得微针半锥度和加热电压之间的函数关系： t = o 1 3 u + 0 0 9 7 ( 2 4 6 ) 砝码重量( g ) 对微针的影响 固定合适的加热长度( 1 ) 和加热电压( u ) 值，改变砝码重量( g ) ，可分别得到微针内 径d ( um ) ( 表2 4 5 ) 、半锥度t ( 。) ( 表2 4 6 ) 的原始数据。 实验参数为：加热长度( 1 ) ：5 m m ：加热电压( u ) ：1 2 v ：硼硅酸盐玻璃管：外径 1 6 m m ，内径1 o m m ，长9 0 m m 。 表2 4 5 微针内径和砝码重量关系的原始数据 微针编号砝码重量g ( k g )微针内径d ( um ) 0 1 撑1 1 9 6 0 2 #1 t 39 4 0 3 #1 5 9 5 0 4 #1 79 3 0 5 #1 99 6 0 6 #2 19 8 0 7 #2 39 9 0 8 #2 59 6 表2 4 6微针半锥度和砝码重量关系的原始数据 微针编号砝码重量g ( k g )半锥度t ( 。) 0 1 撑1 11 0 2 #l - 31 3 0 3 #1 5 1 6 0 4 #1 71 6 0 5 #1 91 8 0 6 #2 12 2 0 7 #2 32 5 0 8 #2 52 7 坝j 学位论文 绑胞工程用徽针的拉制与测量技术研究 其曲线走势图分别如下 1 0 9 5 一 暑 j 9 一 口 8 5 8 3 2 5 ，、 2 乙l _ 5 _ 1 0 5 0 ；i 藜溪器i 鬻：粪藜攀鬻菱i ；i l i 蘩j 量毒i 誊! 誊i 譬素； 。，曩薯籀，豢囊黼熬豢壅萋糍j 粪辫囊慈 ：蕊豢麓豢纛鬻缫麟鬻- - 鬣霪漤蒸 i 慧零誊霉鬻鋈攀鬻鬻豢鬻辫蠢曩譬i ：鋈1 羹i 鬻 11 - 21 41 61 822 2 2 42 6 g ( k g ) 图2 4 5 微针内径和砝码重量关系实验数据散点图 i 空蛤信散点 。 ”， ：1 ： ”| ，。 一 薯j 鬟j 1 ”。? ； 。 一0 。二 叠_ ：拦，。_ _ 。 1 _ i一 ， 一一0 0 、_ | = = 。一，i 。i “。 ， 一 、 一，- ， 。 ， 11 21 41 61 822 2 2 42 6 g ( k g ) 图2 4 6 微针半锥度和砝码重量关系实验数据散点图 同样出散点图可知，砝码重量对微针内径的影响不明显，而与微针半锥度成线性 正比关系。同样地利用最小二乘法可以拟合出微针半锥度和砝码重量之间的函数关系 为： t = 1 1 8 g 一0 2 8 6( 2 4 7 ) 虽然拟合出了工艺参数与微针几何参数之间的函数关系，但由于工艺参数的波 动、拉针器的精度以及微针材料不均匀性等因素的影响，因此这只能作为一个参考， 用于大致的调整工艺参数之用，最终微针的几何尺寸还是要利用后面将要介绍的显微 测量系统来测量。 2 5 本章小结 本章主要讨论了如下几方面的内容： l 、对微针材料进行了充分的分析与选择。按照微注射的要求，从化学稳定性、 硕士学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 工艺特性、强度等方面对微针材料进行了充分的分析，最终选择出各方面性能都较佳 的硼硅酸盐玻璃作为原材料。 2 、阐述了微针拉制、磨制的目的及原理。 3 、在大量实验数据的基础上，采用最小二乘法的曲线拟合技术总结出了工艺参 数对微针几何参数的影响规律，为微针的制作提供了依据。 预十学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 3 微针测量方案的分析与设计 3 1 微针被测量的参数 根据细胞微注射实际的需要，对微针提出了如下几个需被测量的几何参数，具体 如下： 微针针尖外径值d ( um ) ； 微针针尖内径值d ( u ) ； 微针针尖锥度t ( 。) ： 微针针尖处的斜角n ( 。) 。 3 2 常用微小尺寸测量方法的比较 3 2 i 激光测量法 激光由于其单色性以及较短的波长，被广泛地应用在微小尺度的测量中。我们知 道，在用光作为微小尺度的测量方法，主要是利用光的波动性中的干涉和衍射效应。 而单色性正是干涉产生的必要条件，且只有较短的波长才能让微小尺度障碍使光产生 比较明显的干涉、衍射效应，激光正是由于具有单色性好、波长短的特点才得以在微 小尺度检测中得以广泛的应用。但是，由于要测量的对象微针的材质为玻璃，也就是 说障碍物本身也是透明的，他同样会引起光的透射和折射，这些透射、折射过去的光 一起和其它衍射过去的光叠加产生衍射条纹“，因此最后得到的衍射条纹就不再单 独是由于障碍物原因所得到的衍射条纹。也即据此衍射条纹无法计算出微针的尺寸， 因此，此方法对微针的测量是不适用的。 3 2 2 透射式电子显微镜测量法 透射式电子显微镜是利用电子柬作为照明源，在电子柬通过聚光镜系统后使得电 子束聚焦在样品上，电子束穿过样品后，再利用电子束经过磁场的聚焦特性，用一磁 场成像系统使得电子束聚焦成像。在电子显微镜中，由于光源是电子束，因此，具有 很高的分辨率。但是由于透射式电子显微镜在工作过程中，作为照明源的电子要穿透 过样品酬，因此，样品要做的很薄，显然这是不适合这种测量的。 3 2 3 扫描电子显微镜测量法 扫描电镜是一种观察表面微观世界的全能分析显微镜，它是用聚焦得非常细的电 硕士学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 子束作为照明源，以光栅状扫描方式照射到试样表面上，由于电子是种带负电的粒 子，它同物质的相互作用十分强烈，当入射电子接触到试样表面上时，将分别与试样 中的原子核、核外电子、晶格以及晶体中的电子云相互作用，从而引起散射，且伴随 着其它各种能量的产生，如：x 射线、光、二次电子发射等。因为所获得各种信 息的二维强度分布是同试样的表面形貌等因素有关因此，通过接受和处理这些信息， 就可以获得表征试样形貌的扫描电子像，进而对图像作进一步的处理，从而得到需要 的信息。 但由于受到扫描电子显微镜工作原理的限制，被测量对象必须为导体“，因此， 对材质为玻璃的微针的表面还必须采取镀层的处理，因此，每次测量完一根也意味着 破坏了一根，且价格昂贵，每根测量需要5 0 0 6 0 0 元，因此，此种测量方法不太适合。 3 2 4 光学显微镜测量法 光学显微镜主要分为透射式和反射式两种方式，常用的生物显微镜主要是透射式 的，而晶相显微镜主要为反射式的显微镜。透射式光学显微镜的光源从物镜的底部发 出，透过透明的载物台，最终进入目镜的视野；反射式显微镜则利用物体对光的反射 原理在目镜中成像。由于微针为透明的玻璃，因此，不适合采用反射式显微镜，只适 合采用透射式显微镜“。虽然此时，有些微针的直径是可以测量出的，但我们知道， 显微镜的测量值存在一个估计值的问题，无形中就降低- r 狈l l 量精度。况且，对于微针 来说需被测量的几何参数不仅仅是直径这个参数，还有：微针针尖锥度t 和微针针尖 处的斜角a 两个角度参数，显然此时普通的光学显微镜是无能为力的。因此，直接采 用光学显微镜测量看来还是不行的。 3 3 微针测量方法的选择 由3 2 节的分析可知，目前唯一可能可行的方法只有光学显微镜法，但若采用光 学显微镜必须解决如下三个问题：i 、测量精度的问题：2 、微针的两个角度参数的测 量；3 、显微镜的分辨率问题。 在深入分析上述几个矛盾，结合本教研室实际情况的基础上，本人提出了如下的 测量方法：采用光学显微镜和c c d 相结合，通过数据采集卡采集后再利用图象处理的 技术则可以解决这个问题。其主要原理如下；显微镜的物镜成了像之后，经过c c d 获取，将其转化成电信号，由图象采集卡采集信号，再由编制的图象处理软件对获取 的图象进行分析、处理。拟合出微针的外轮廓线，最终用解析的方法获得所需要的几 何参数尺寸。当然，在图像处理过程中精度还是有相当保证的，因为在图象的边缘测 硕：b 学位论文细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 量过程中采用的是s o b e l 算予对图象每个象素点的灰度求差分得到的，且边界拟合采 用的是经过改进后的高效的拟合算法来实现的。另外，因为该测量软件采用的是测量 象素值的方法，是一个相对值的概念，在经过标定后，系统误差是要被消除的。 另外，在i 蛩像处理中不得不考虑的一个物理概念就是分辨率的问题。我们知道， 光学仪器中所使用的透镜，边缘多数是圆形的，它就相当于一个透光的小圆孔，且透 过被测对象的光是具有一定波长的，由光的波动性原理可知，当一定波长的光照射到 小圆孔上时将产生衍射效应，也即每个发光的物点经有限的直径的透镜后，在像平面 上得到的是一个以几何像点为中心的环状衍射花纹。如果有另一物点也经同一透镜成 像，则在平面上产生另一个环状衍射花纹“。根据瑞利准则，如果一个发光物点的 爱里斑中心恰好与另发光物点衍射花纹的第一个暗纹重合时，就说这两个发光物点 刚好能够被分辨的。与分辨率相联系的物理概念是分辨极限，分辨极限的倒数就称为 分辨率，分辨极限是指显微镜可分辨的最临近两个物点间的距离或角度。根据瑞利判 据，显微镜的分辨极限可表达为： x = 辈不相干光照明( 3 3 1 ) 肝s 1 n 口 x = 0 7 百7 九。 相干光照明( 3 _ 3 2 ) 其中； 。 n 9 入射光在真空中的波长。 物方( 物镜和样品间的) 折射率； 显微镜物镜在物方的半孔径角。 ”s i n 0 也称作显微镜的数值孔径( n a ) 。 由于透射式显微镜采用自然光照射，因此， 。应取自然光的平均波长，即 x o = 5 5 0 n m ， 自然光属于不相干光，因此，计算时要采用( 3 3 1 ) 式计算，由2 0 倍物镜的数值孔径 n a = 0 6 5 可得其分辨极限为： a x = 0 5 1 6i x m 由此看来，这种情况下显微镜的分辨极限还是可以接受。 由以上的分析可知，采用这种显微测量系统的测量方法是完全可行的。但是，由 这种测量方案可知，要实现对微针几何参数测量的前提是要能获得微针相应部位一定 精度的图像。对微针针尖外径、锥度、针尖斜角参数而言，由于其所在部位全在微针 坝i ? 学位论文 细胞工程用微针的拉制与测量技术研究 的外侧，因此，测量是没有问题的。然而，对于微针的内径，就目前手段还无法做到 相对精确地获得其图像，采用此种方法还存在一定的困难，因此，还需采用另外间接 的方法来测量( 详见第五章) 。 3 4 显微测量系统的设计 3 4 1 显微测量系统的组成 经过3 3 节对微针显微测量方法的分析与选择可知，采用上述的测量方法是完全 可行的，显微测量系统的系统框图可表示如图3 4 1 所示。 图3 4 1 显微测量系统框图 3 4 2 显微测量系统硬件设计与选择 1 、光学显微镜的选择 我们知道，在选择显微镜时首要需考虑的问题就是显微镜的景深问题，因为它决 定着被观测物体的可视深度问题。 景深的定义为：当显微镜调焦于某一物面( 称为对准平面) 时，如果位于其前后 的物平面仍然能被观察者看得清楚，则该两平面之间的距离就称为显微镜的景深“”。 根据理论推算，显微镜的景深l 可按如下公式计算“” l = ( l ) 。4 - ( l ) m( 毫米) ( 3 4 1 ) 式中( l ) 。眼睛的调节状态不变时显微镜的景深数值， ( l ) 。可采斋( 其中n 为物镜和试样间介质的折射率：r 为显微镜的视放 大率，其绝对值即显微镜的放大倍数；n a 为物镜的数值孔径) ； ( l ) m _ 一由