（发酵工程专业论文）强化聚唾液酸合成及唾液酸单体制备的研究.pdf

摘要 摘要 唾液酸是一类神经氨酸的衍生物，广泛存在于动物组织及微生物中，是细胞膜蛋白 的重要组成部分，参与细胞表面多种生理功能，在调节机体生理、生化功能方面起到非 常重要的作用。聚唾液酸是唾液酸单体以q 2 ，8 或a - 2 ，9 糖苷键连接的线性同聚物，是少 数几种细菌的荚膜多糖的主要组分。通过微生物合成聚唾液酸，然后将其水解制备单体 唾液酸是目前唾液酸生产的主要方法之一。 本文首先研究了聚唾液酸合成前体物质丙酮酸钠对e 疗c c t c cm 2 0 8 0 8 8 合 成聚唾液酸的影响。我们发现丙酮酸钠的添加剂量和添加时间均对聚唾液酸的合成产生 显著影响。为了最大程度强化聚唾液酸的合成效率，本文从摇瓶水平上优化出了丙酮酸 钠的最佳添加策略：发酵初始阶段，添加6g l 丙酮酸钠，可以最大程度地促进聚唾液 酸的合成，其最终产量达到3 4 7 0m g l ，相比对照提高了7 3 。将该策略在3 0l 发酵罐 水平上进行验证，聚唾液酸产量达到6 6 3 0m g l ，相比对照提高了5 3 。 另外，本文在摇瓶水平上考察了氧自由基胁迫对e 厅c c t c cm 2 0 8 0 8 8 合成聚唾 液酸的影响。h 2 0 2 可以有效地刺激聚唾液酸的合成，并且h 2 0 2 的添加时间、添加剂量 以及添加方式均对聚唾液酸合成影响显著。进一步的优化实验表明，在聚唾液酸发酵过 程中，采用三点添加法( 4h4 0m m o l l ( 终浓度) 、8h8 0m m o l l ( 终浓度) 、1 2h1 6 0 m m o l l ( 终浓度) ) 效果最好，聚唾液酸产量达到2 7 0 5m g l ，比对照提高3 5 。将此 策略在3 0l 发酵罐水平上进行验证，聚唾液酸产量达到5 5 0 4m g l ，与对照相比提高了 2 7 。 最后，在实现高效合成聚唾液酸的基础上，本文改进了聚唾液酸水解制备唾液酸的 工艺。对聚唾液酸的水解方法进行了优化，并对纯化唾液酸单体的各种方法进行了研究 和比较，最终确定了由聚唾液酸制备唾液酸单体的工艺流程：聚唾液酸溶解于o 0 5m o l l 的h 2 s 0 4 溶液中，8 0 水浴保持4h 。水解产物直接加入5 倍体积的冰乙酸，然后4 静置3 天，抽滤除去冰乙酸，即得唾液酸晶体，再用冰乙酸洗涤晶体，在5 0 0 0 9 5m p a 真空度的条件下保持4h ，即得终产品，利用该工艺得到的唾液酸纯度超过9 5 。 关键词：聚唾液酸；唾液酸；丙酮酸钠；氧胁迫；水解 a b s t r a c t a b s t r a c t s i a l i ca c i di saf a m i l yo fo fn e u r a m i n i ca c i d w h i c he x i s tm o s t l yt h ec e l lm e m b r a n e s u r f a c eo fm a m m a l sa n daf e wb a c t e r i aw i d e l yf o u n di na n i m a lt i s s u e sa n dm i c r o o r g a n i s m s a sa l li m p o r t a n tc o m p o n e n to fc e l lm e m b r a n eg l y c o c o n j u g a t e s ，s i a l i ea c i dp l a y sav e r y i m p o r t a n tr o l ei nt h er e g u l a t i o no fav a r i e t yo fv i t a lb i o l o g i c a lp r o c e s s e s p o l y s i a l i ca c i di sa p o l y m e ro fs i a l i ca c i dl i n k e db ya - 2 ，8o ra 一2 ，9 - g l y c o s i d i c ( k e t o s i d i c ) b o n d sw h i c hi st h e c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d eo faf e wo fb a c t e r i a s i ti ss u p p o s e dt ob eo n eo ft h em a i np r e p a r a t i o n m e t h o d sf o rs i a l i ea c i db yh y d r o l y s i so ft h ep o l y s i a l i ca c i d p y r u v a t ei st h em a i np r e r e q u i s i t ef o rt h es y n t h e s i so fp o l y s i a l i ca c i d e 任e c to fs o d i u m p y r u v a t ea d d i t i o no nt h ep r o d u c t i o no fp o l y s i a l i ca c i db yec o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8w a s i n v e s t i g a t e d n 圮r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eq u a n t i t i e sa n da d d i t i o n - t i m eo fs o d i u mp y r u v a t eh a d s i g n i f i c a n ti m p a c to nt h es y n t h e s i so fp o l y s i a l i ca c i d i no r d e rt om a x i m i z et h es y n t h e s i s e f f i c i e n c yo fp o l y s i a l i ca c i d ，t h eb e s ts t r a t e g yf o rs o d i u mp y r u v a t ea d d t i o nw a so b t a i n e di nt h e s h a k ef l a s kf e r m e n t a t i o n t h eo p t i m a lt i m ea n dc o n c e n t r a t i o nf o rs o d i u mp y r u v a t ea d d i t i o n w e r e0ha n d6g l a tt h ee n do ft h ef e r m e n t a t i o n ，p o l y s i a l i ca c i dp r o d u c t i o nr e a c h e d3 4 7 0 m g l ，a n ds h o w e d7 3 i n c r e a s ea sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r 0 1 力砖f i n a lp o l y s i a l i ca c i d p r o d u c t i o nr e a c h e d6 6 3 0m g lw h e nt h es t r a t e g yw a sc o n f i r m e di na3 0lf e r m e n t o r , i n c r e a s i n gb y5 3 a sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r 0 1 e f r e c to fo x i d a t i v es t r e s so nt h eb i o s y n t h e s i so fp o l y s i a l i ca c i db yec o l ic c t c c m 2 0 8 0 8 8i nt h es h a k ef l a s kf e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a th 2 0 2 s t r e s sc o u l de f f e c t i v e l yi n d u c et h ea c c u m u l a t i o no fp o l y s i a l i ca c i d t h ea d d i t i o nt i m e ，t h e q u a n t i t ya n da d d i t i o nm e t h o d so fh 2 0 2h a ds i g n i f i c a n ti m p a c to nt h ep r o d u c t i o no fp o l y s i a l i c a c i d b ya d o p i n gt h r e e - p o i n t sh 2 0 2s t r e s s ( 4 0m m o l la t4h ，8 0m m o l la t8h ，16 0m m o l l a t1 2h ) ，t h eh i g h e s tp o l y s i a l i ca c i dy i e l do f2 7 0 5m g lw a so b t a i n e d ，a n di n c r e a s e d3 5 a s c o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 t h ef m a lp o l y s i a l i ca c i dp r o d u c t i o nr e a c h e d6 6 3 0m g lw h e nt h e s t r a t e g yw a sc o n f i r m e di na3 0lf e r m e n t o r , i n c r e a s e db y5 3 a sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r 0 1 i na d d i t i o n ，t h et e c h n o l o g yo fs i a l i ca c i dp r e p a r a t i o nb yh y d r o l y s i so fp o l y s i a l i ca c i dw a s i m p r o v e di nt h es t u d y h y d r o l y s i sm e t h o do fp o l y s i a l i ca c i dw a so p t i m i z e d ，a n dv a r i o u s m e t h o d sf o rs i a l i ca c i dp u r i f i c a t i o nw e r ec o m p a r e d f i n a l l y , t h ep r e p a r a t i o no fs i a l i ca c i d m o n o m e rb yp o l y s i a l i ca c i dh y d r o l y s i sw a sd e t e r m i n e d ：p o l y s i a l i ca c i dw a sd i s s o l v e di n0 0 5 m o l lh 2 s 0 4a n di n c u b a t e da t8 0 f o r4h t h eh y d r o l y s a t ew a sd i r e c t l ym i x e dw i t hf i v e t i m e sv o l u m eo fg l a c i a la c e t i ca c i d a n dt h e nl e ts t a n d i n ga t4 f o r3d a y s 1 1 l es i a l i ca c i d c r y s t a lw a so b t a i n e db yf i l t e r i n ga n dw a s h i n gw i t ha c e t i ca c i d t h ef m a lp r o d u c to fs i a l i ca c i d m o n o m e rw i t h9 5 p u r i t yw a so b t a i n e db yv a c c u m d r y i n g k e y w o r d s ：p o l y s i a l i ca c i d ；s i a l i ca c i d ；s o d i u mp y r u v a t e ；o x i d a t i v es t r e s s ；h y d r o l y s i s 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 1 聚唾液酸和唾液酸概述1 1 1 1 唾液酸和聚唾液酸的结构、性质、应用1 1 1 2 唾液酸的生产3 1 2 研究概况。4 1 2 1 发酵生产聚唾液酸的研究概况4 1 2 2 唾液酸提取的研究概况4 1 3 本论文研究的目的和内容5 1 3 1 本文的研究目的5 1 3 2 本文的主要研究内容6 第二章实验材料与方法7 2 1 菌种7 2 2 培养基。7 2 3 主要试剂7 2 4 主要仪器7 2 5 实验方法8 2 6 分析方法8 2 6 1 菌体浓度测定8 2 6 2 聚唾液酸的测定9 2 6 3 唾液酸单体含量的测定9 2 6 4 水解率的测定9 2 6 5 铵盐的测定9 2 6 6 山梨醇的测定9 2 6 7 唾液酸醛缩酶酶活测定9 2 6 8 有机酸含量的测定9 2 6 9 唾液酸红外光谱鉴定9 第三章结果与讨论1 l 3 1 丙酮酸钠对ec o i lc c t c cm 2 0 8 0 8 8 发酵生产聚唾液酸的影响1 1 3 1 1 聚唾液酸分批发酵过程分析1 1 3 1 2 丙酮酸钠对菌体生长和聚唾液酸合成的影响。1 3 3 1 3 丙酮酸钠对细菌三羧酸循环中间产物的影响1 5 3 1 4 丙酮酸钠对聚唾液酸分批发酵过程的影响。1 6 3 2 氧自由基胁迫对合成聚唾液酸的影响1 7 i i i 目录 3 2 13 0l 罐上过氧化氢恒定速率流加对聚唾液酸合成的影响1 7 3 2 2 过氧化氢的添加时间添加量对聚唾液酸合成的影响1 8 3 2 3 过氧化氢添加方式对聚唾液酸合成的影响一1 9 3 2 4 过氧化氢胁迫应用于3 0l 罐2 0 3 3 唾液酸单体的制备工艺2 2 3 3 1 聚唾液酸水解方法的确定2 2 3 3 2 唾液酸脱色方法的确定2 4 3 3 3 离子交换树脂的选择2 5 3 3 4 结晶工艺的初步探索2 6 3 3 5 唾液酸单体制备工艺2 7 3 3 6 唾液酸单体结构鉴定2 7 第四章主要结论与展望2 9 4 1 主要结论2 9 4 2 展望3 0 致谢31 参考文献3 3 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文3 8 i v 第一章绪论 1 1 聚唾液酸和唾液酸概述 第一章绪论 唾液酸( s i a l i ea c i d ，s a ) 是一大类神经氨酸的衍生物f l 】，是细胞膜蛋白的重要组成 部分，广泛存在于动物组织及微生物中【2 】，在调节生理、病理过程中起到非常重要的作 用1 3 j ，包括细胞结合、感染、免疫等。 聚唾液酸( p o l y s i a l i ca c i d ，p s a ) 是唾液酸单体连接成的线性同聚物，通常以仅2 ，8 或a 2 ，9 糖苷键连接【4 】，是一类链蛋白酶抗性的大分子【5 】o 人组织液中细胞表面的a ( 2 ，8 ) 唾液酸与人类癌症转移。n e u 5 a e 聚合物不出现在除了头脑的局部区域以外的健康人的 组织液中。胞外多糖决定着细胞的致病性，这类荚膜多糖是由n e i s s e r i am i n i n g i t i d i s ，e c o l i ，p a s t e u r e l l ah a e m o l y t i c a ，m o r a x e l l an o n l i q u e f a c i e n s ，以及几种s a l m o n e l l a 菌株生产 【6 】。 1 1 1 唾液酸和聚唾液酸的结构、性质，应用 唾液酸是一类含有9 个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖( 图1 - 1 ) 。根据c 5 上连接不同的基团可以分成不同类型的唾液酸【1 ，其中5 乙酰氨基3 ，5 二脱氧d 甘 油d 半乳壬酮糖( n a n a ，n e u 5 a c ，n 乙酰神经氨酸) 和3 脱氧d 甘油d 半乳壬酮 糖( ) n ) 为最主要的两种唾液酸，其余的唾液酸均是由这两种衍生而来。 图1 - l 唾液酸的一般结构 f i g 1 - 1 s t r u c t u r eo f s i a l i ea c i d 纯的n 乙酰神经氨酸和n 羟乙酰神经氨酸易溶于水，在水溶液中很稳定f 8 】，不发 生变旋作用，4 时贮藏数月不发生变化，但是在含有非常微量的有机酸的溶液中以及 碱性的溶液中，其稳定性就受到很大的影响。n ，o 二乙酰神经氨酸和n 乙酰二0 乙酰 神经氨酸不稳定，在常温下很易转变成n 乙酰神经氨酸。 唾液酸( s i a l i ca c i d ，s a ) 通常作为糖蛋白和糖脂的末端存在于细胞的表面，起着沟 通内外以及防御的功能。s a 各种病原体和毒素结合位点的主要成分。其另一个功能是 分子模仿，病原微生物成功的利用唾液酸来装饰自己，从而帮助其逃避宿主的免疫。 s a 调节循环过程中糖蛋白的半衰期，如果机体内缺少唾液酸，那么糖蛋白中的单体如 半乳糖就会被肝脏或其他组织的感受器识别，从而导致糖蛋白迅速消失【9 1 0 1 。s a 是细胞 江南大学硕士学位论文 粘附分子配体的最重要组成部分，这些粘附分子在调节白细胞沿着内皮细胞滚动以及免 疫细胞或者血小板间的交互作用中发挥重要的作用。s a 也是细胞支持分子的配体，这 些细胞支持分子在调节免疫应答方面发挥重要作用。s a 的变化与肿瘤恶化及癌细胞转 移密切相关，正是由于恶性肿瘤细胞与血小板、白细胞及内皮细胞的交互作用导致癌细 胞的转移。游离的s a 能有效地抑制感冒病毒和其他病原微生物入侵红细胞。流感病毒 神经氨酸酶对病毒的复制以及致病性有非常重要的作用，经过化学修饰的s a 可以作为 神经氨酸酶的抑制剂，它可以通过抑制神经氨酸酶活性干扰和阻止病毒的复制【l ，从而 达到治疗流感的目的。目前，以s a 为母体化合物进行神经氨酸酶抑制剂的研究成为抗 流感药物研究的热点【1 2 】，其中扎那米韦( z a n a m i v i r ，乐感清) 已成功上市，是于达菲相 竞争的抗禽流感的特效药。唾液酸低聚糖作为一种功能性的碳水化合物，可以作为婴儿 食品的配料和营养增补剂【l 引。 聚唾液酸是唾液酸单体以酮苷键连接的线性同聚物【1 4 j ，结构如图1 2 所示：大多 数的聚唾液酸以a 2 ，8 酮苷键连接，因为a 2 ，8 连接的聚唾液酸末端相邻的两个单体形 成内酯【1 5 】，对聚唾液酸的稳定起到一定的作用。聚唾液酸是白色的不定型高聚物，在酸 作用下很容易降解成单体唾液酸。 ( a ) 图1 - 2 聚唾液酸的结构( a ) a - 2 ，8 连接，( b ) a - 2 ，9 连接 f i g 1 2c h e m i c a ls 帆姗s o f p s a ( a ) a - 2 ，8 - p o l y n e u 5 a c ；( b ) - p o l y n e u 5 a c 2 第一苹绪论 聚唾液酸水溶性优良，黏度低，生物相容性好，具有生物可降解性【1 4 】，它可以用来 作为神经再生的生物材料以及一些组织结构工程的支架材料【1 6 】。同时聚唾液酸可以替代 p e g 用作多肽与蛋白类药物的可降解缓释剂【1 7 , 1 5 。英国l i p o x e n 公司对聚唾液酸修饰的 干扰素进行了临床试验，发现其半衰期比聚乙二醇修饰的干扰素的更长；另外该公司还 正在试验用聚唾液酸修饰其他的药物如胰岛素、天冬酰胺酶和人红细胞生长素等【1 9 刎。 本实验室也正在进行聚唾液酸修饰超氧化物歧化酶的研究。 1 1 2 唾液酸的生产 唾液酸的生产方法主要有天然物抽提法、酶合成法、化学合成法、微生物发酵法。 ( 1 ) 天然物抽提法 唾液酸以糖复合物的形式广泛存在于细胞表面，部分天然资源中唾液酸的含量如表 1 1 所示。 表1 - 1唾液酸在不同天然物中的含量 t l b l e l 1c o n t e n t so f s ai nn a t u r a lr e s o u r c e s 原料含量原料含量 燕窝 约6 7 l ( g 北柴胡 约0 4 8 9 k g 乳清约2 7g l 【g茄子约0 4 5g k g 枇杷约0 6 6g l ( g禽蛋 约0 3 4 9 k g j u n e j a l 2 l j 成功地从禽蛋的蛋黄膜和系带中提取出唾液酸并已应用于生产， w h i t e h o u s e 2 2 1 和s a y a m a 2 3 1 也分别将牛乳乳清和酪蛋白中得唾液酸提取出来。另外国内 有高剑峰1 2 4 】等也从猪血中提取出唾液酸。 由于在天然原料中唾液酸的含量较低，分离提纯过程也比较复杂，同时收率不高， 需要一些特殊的设备，造成的环境污染也较大，这必然限制了天然物抽提法在唾液酸生 产中的应用。 ( 2 ) 酶合成法 丙酮酸钠和n 乙酰甘露糖胺经过唾液酸醛缩酶的催化合成出n 乙酰神经氨酸 【2 5 2 6 1 。酶合成法转化率高、提取简单、得到的产品纯度高，但是n 乙酰甘露糖胺价格较 为昂贵，并且唾液酸醛缩酶不易获得，这在一定程度上并限制了生产规模的扩大。 ( 3 ) 化学合成法 在酸性醇溶液中，a 溴甲基丙烯酸在铟的催化对n 乙酰甘露糖胺进行丙烯基化反 应，再对得到的产物进行臭氧化反应即可得到n 乙酰神经氨酸【z 7 1 。但是使用化学合成 法反应条件苛刻( 其中臭氧化反应需要- - 7 8 的低温) ，并且需要铟等一些贵重金属作 为催化剂，同时唾液酸收率较低。 ( 4 ) 微生物发酵法 通过微生物大量合成聚唾液酸，然后将其水解制备单体唾液酸是目前唾液酸生产的 主要方法之一。通常聚唾液酸发酵选用的菌株为ec o l ik 1 和ec o l ik 2 3 5 。该方法具有 原料廉价，反应条件温和，易于放大生产的优势，极具产业化前景。 江南大学硕士学位论文 1 2 研究概况 1 2 1 发酵生产聚唾液酸的研究概况 国际上对聚唾液酸的发酵生产研究较少，主要集中于其生理功能和临床应用的研 究。19 5 7 年b a 田r 【2 8 】等在ec o l ik 2 3 5 和k 1 中发现该聚合物。r o d r i g u e z a p a r i c i o 【2 9 】等 研究了ec o l ik 2 3 5 发酵生产聚唾液酸，产量为1 3 5 0m g l 。c a m i n o 3 0 j 等利用ec o l ik 9 2 发酵生产聚唾液酸，产量为4 5 0m g l 。2 0 0 8 年r o d e 3 l 】等利用ec o l ik 1 通过分批补料 的方法发酵生产聚唾液酸，产量为1 6 0 0m g l 。2 0 0 8 年k a p r e 3 2 】等利用ec o i l 通过溶氧 反馈补料发酵生产聚唾液酸，产量为3 0 0 0m g l 。2 0 0 9 年n a v a s an t 3 3 j 等研究了温度对 ec o l i 合成聚唾液酸的影响，研究表明当温度对聚唾液的合成影响很大，当温度低于2 5 时不合成聚唾液酸。 国内对聚唾液酸的研究起步较晚，聚唾液酸生产方面的研究主要是关于菌株选育和 培养基优化，1 9 9 9 年，钱世钧 3 4 1 等研究了从ec o l ic 8 中制备和纯化聚唾液酸，产量为 1 2 0 0m g l 。2 0 0 0 年，詹晓北t 3 5 , 3 6 j 等对聚唾液酸的发酵动力学以及p h 控制补料进行了 研究。2 0 0 2 年，于军华【3 7 】等对聚唾液酸的摇瓶工艺进行了研究。2 0 0 5 年，郑志永【3 8 】等 对大肠杆菌生产的聚唾液酸的结构进行了研究。2 0 0 9 年，张琦【3 9 j 等通过两阶段搅拌策 略发酵生产聚唾液酸产量为3 9 6 6m g l 。 现阶段研究主要集中于营养与环境等胞外条件对微生物合成聚唾液酸的影响。关于 微生物胞内生理和代谢状态对聚唾液酸合成影响的研究较少。而且目前鲜有报道将微生 物胞内生理代谢状态和外部的发酵调控策略结合以提高聚唾液酸的生产效率。因此，微 生物胞内状态与发酵过程调控关联起来是今后强化聚唾液酸生产的趋势。 1 2 2 唾液酸提取的研究概况 钱世钧报道了从发酵液中提取唾液酸的方法【3 4 j 。赵慧、吴剑荣、詹晓北、郑志永等 口也对唾液酸单体的提取进行了研究。在这些报道中对于唾液酸的提取，大都经过聚唾 液酸的粗提，水解，离子树脂吸附，洗脱得到唾液酸产品。但是需要用一定离子强度的 氯化钠溶液洗脱离子交换过程中的唾液酸，使得唾液酸单体中混入新的杂质氯化钠。 需要采用s u p e rg 2 5 凝胶柱脱盐，尽管s u p e rg 2 5 凝胶柱脱盐效果较好，但是同时存在 处理量小，放大规模有限，价格昂贵等缺陷。郑志永等对唾液酸溶析结晶工艺进行了研 究。采用此结晶方法，水解之后的样品经脱色后还需冻干才能进行结晶，冷冻干燥是一 个能耗非常大的过程，在工业生产中采用此法势必会增加生产成本。改进聚唾液酸水解 制备唾液酸的工艺，提高唾液酸的制备效率非常重要。 j u n e j a l 2 l 】等成功地从禽蛋的蛋黄膜和系带中提取出唾液酸并已用于生产， w h i t e h o u s e 2 2 】和s a y a m a 2 3 】也分别将牛乳乳清和酪蛋白中唾液酸提取出来。这些方法对 于从发酵液中提取聚唾液酸具有一定参考价值。 4 j o l c n j _ 。p l 一1 1 gicnao-6-p 6 1 r l l a c n 上c 6 p 卞腓cij l 篙e r l - - p o l y s i a l i ca c i d 图1 - 3 聚唾液酸在大肠杆菌体内生物合成途径 f i g 1 3p a t h w a y so fp s ab i o s y n t h e s i si ne c o l i l e a n d r ob 4 6 j 等通过对大肠杆菌合成聚唾液酸的调节机制的研究发现，唾液酸醛缩 酶( s i a l i ca c i dl y a s e ) 是整个代谢途径中起关键调控作用的因素，该酶催化的反应如下 式( 1 1 ) 所示。该反应是双向可逆的，存在一个平衡常数k ( k = f s i a l i c a c i d ( m a n n a c x p y r ) ) 。大肠杆菌通过调节该反应进行的方向来控制终产物聚唾液酸 的合成。当底物( n 乙酰甘露糖氨或丙酮酸盐) 浓度较高或者产物( 唾液酸) 浓度较低 时，反应会向合成方向进行，反之则会向降解方向进行。 m a n n a c + p y r u v a t e 兰! 璺! ! ! 竺! 璺生型! s i a l i ca c i d ( 1 - 1 ) 同时由图可以看出，丙酮酸是合成聚唾液酸的前提物质，在发酵过程中添加前提物 质有助于产物的合成。在利用酶法来合成唾液酸中，以n 乙酰甘露糖氨和丙酮酸盐为 江南大学硕士学位论文 底物，在唾液酸醛缩酶的催化作用下制备唾液酸【2 5 2 6 1 。在此过程中，为了促使反应向合 成方向进行，需要向反应体系中过量添加底物，通常会选择添加相对廉价的前体物质 丙酮酸盐。过量添加丙酮酸钠也是目前酶合成法制各唾液酸的常用策略。因此拟选取丙 酮酸钠作为前体物质来研究其对聚唾液酸发酵过程的影响。 2 氧自由基胁迫对聚唾液酸合成的影响 自由基调节着重要的细胞过程，包括细胞凋亡和癌症。同时，人们普遍怀疑，自由 基可能调节温度，渗透压的作用。所以预期自由基可以在调节微生物生产上起到重要作 用。好氧微生物生长过程中都会遇到活性氧，其中包括0 2 。、h 2 0 2 、o h 。氧自由基能 在正常的细胞代谢过程中产生，例如呼吸及p 脂肪酸的氧化。氧自由基通过对包括 d n a 、蛋白、细胞膜在内的多种生物大分子的影响产生很强的毒性。因此细菌发展就 几种方法来抵御自由基的伤害。 荚膜是菌体在特定环境中进化出的一种自我保护机能，它可以帮助致病菌抵御机体 白细胞释放的氧自由基的攻击，这是许多荚膜细菌可以成功侵染机体的主要原因。荚膜 的产生是菌体对外界特定环境因素的一种生理响应。例如黄单胞菌，一种植物病原菌， 黄原胶就是在这种菌受到攻击时分泌的胞外多糖，其黏性程度( 黄原胶分泌) 直接关系 到致病性。如果更好的了解氧自由基诱导与胞外多糖的生产两者之间的关系，那么自由 基诱导就可能会被用来提高胞外多糖的生产效率。 聚唾液酸是细菌荚膜多糖的主要成分，探索与荚膜产生相应的环境因子，对过量合 成聚唾液酸具有直接的向导作用。 1 3 2 本文的主要研究内容 本论文主要研究内容包括： 1 研究代谢前体物质丙酮酸钠对ec o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8 发酵生产聚唾液酸的影响。 2 对ec o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8 的氧自由基h 2 0 2 胁迫作用进行研究。分别考察h 2 0 2 添 加的时机，剂量以及方式对ec o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8 合成聚唾液的影响。 3 改进现有聚唾液酸水解制备唾液酸的工艺。对聚唾液酸的水解方法进行优化，并对纯 化唾液酸单体的各种方法进行研究和比较，最终确定由聚唾液酸制备唾液酸单体的工 艺。 6 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 茵种 e s c h e r i c h i ac o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8 ( 诱变突变株) ，江南大学生化工程研究室保藏。 2 2 培养基 斜面培养基( g l ) ：胰蛋白胨1 0 ，n a c l5 ，牛肉膏3 ，琼脂1 5 2 0 ，p h7 2 7 4 。 上罐一级种子培养基( g l ) ：胰蛋白胨1 0 ，n a c i5 ，牛肉膏3 ，p h7 2 7 4 。 上罐二级种子培养基( g l ) ：山梨醇2 0 ，胰蛋白胨1 5 ，硫酸铵0 6 2 5 ，m g s 0 40 9 ， 磷酸氢二钾2 5 ( 含结晶水) ，p h 7 8 。 上罐发酵培养基( g l ) ：山梨醇6 0 ，胰蛋白胨1 5 ，硫酸铵2 5 ，m g s 0 40 9 ，磷酸 氢二钾2 5 ( 含结晶水) ，p h7 8 。 2 3 主要试剂 山梨醇为食品级由东莞市嘉蜜宝糖液有限公司提供，唾液酸标品为分析纯由 p f a n s t i e h ll a bi n c 公司提供，n 乙酰甘露糖胺为分析纯由a l f aa e s a r 公司提供，三羟甲 基氨基甲烷( t r i s ) 为优级纯由s i g m a 公司提供，丙酮酸钠、牛肉膏、硫代巴比妥酸、 蛋白胨、琼脂均为生化试剂，n a l 0 4 、乙酸等分析试剂为化学纯，均由国药集团化学试 剂有限公司提供。争光d 11 3 、争光1 1 6 、争光z g c l 5 1 树脂由浙江争光实业股份有限公 司提供，国药7 3 2 树脂由中国医药( 集团) 上海化学试剂公司提供，色赛d 1 1 3 、色赛 d 8 5 树脂由江苏色可赛思树脂有限公司提供。 2 4 主要仪器 u v - 1 8 0 0 分光光度计 h y g i i f l 摇床 隔水式电热恒温培养箱 n l f 2 2 3 0 l 发酵罐 3 k 1 5 高速冷冻离心机 1 0 1 2 电热鼓风干燥箱 p h 计 w t - 2 1 0 2 电子天平 a l 2 0 4 分析天平 s h z d ( ) 水循环真空泵 上海精密科学仪器有限公司 上海欣蕊自动化设备有限公司 上海跃进医疗器械厂 瑞士比欧生物工程公司 s i g m a 上海实验仪器总厂 德国w t w 公司 江苏常州万得天平仪器厂 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 浙江黄岩求精真空泵厂 7 江雨大学石突士学位论文 2 5 实验方法 斜面培养：取保存的菌种，挑取一环接到新鲜的斜面培养基上于3 7 恒温培养1 2h 。 一级种子培养：5 0 0m l 三角瓶内装1 0 0m l 种子培养基，接活化后的斜面种子一环， 摇床转速2 5 0r m i n ，温度3 7 ，培养8 1 0h 。 二级种子培养：5 0 0m l 三角瓶内装1 0 0m l 种子培养基，取4m l 一级种子液加入 其中，摇床转速2 5 0r m i n ，温度3 7 ，培养1 2h 。 摇瓶培养：将培养好的以及种子液按接种量4 ( v v ) 接入装有5 0m l 的发酵培养基 的5 0 0m l 三角瓶中培养，摇床转速2 5 0r m i n ，温度3 7 ，培养5 6h 。 普通发酵罐培养：将培养好的二级种子液按接种量4 ( v v ) 接入装液量为18l 的3 0 l 发酵罐，搅拌转速6 0 0r m i n ，发酵温度3 7 ，通气量1 5v v m 。发酵过程中流加氨 水控制p h 恒定在6 4 。灭菌前加入少量泡敌以控制发酵过程中的泡沫。 聚唾液酸样品制备：利用图2 1 的制备流程制备出纯度为9 0 左右的聚唾液酸。 图2 - 1 聚唾液酸的制备流程 f i g 2 - 1s e p a r a t i o np r o c e s sf o rp s a 超声波水解：聚唾液酸粉末用去离子水溶解为2g l 的溶液，用于超声波水解。超声 波频率为2 0k h z ，超声强度为15w m 2 ，1s “o n ，1s “o f f 水解6h 。 酸水解：聚唾液酸粉末用0 0 5m o l lh 2 s 0 4 溶解为2g l 的溶液，在8 0 水浴中水解4 h 。 唾液酸的脱色：将酸水解得到的溶液用饱和氢氧化钡调节p h 为7 0 ，离心去除沉淀， 将唾液酸上清液通过由脱色剂形成的滤饼层，收集过滤后的液体。 离子交换纯化唾液酸：将脱色后收集到的上清液，上阳离子树脂柱( 1 2x 4 5c m ) ，超 纯水为洗脱液，流速为1 0m l m i n ，每管收集约9m l ，分别测定唾液酸单体的量。 唾液酸的结晶：将水解后的唾液酸溶液，倒入5 倍体积的乙酸中，在4 下静置结晶 3 天，将得到的晶浆用抽滤的方法除去冰乙酸得到晶体，再用冰乙酸洗涤晶体，在5 0 0 0 9 5m p a 真空度条件下保持4h 。 2 6 分析方法 2 6 1 茵体浓度测定 取发酵液o 5m l ，稀释一定倍数，摇匀后于6 0 0n n l 下测o d 值对照标准曲线计算 8 第二章实验材料与方法 生物量。 2 6 2 聚唾液酸的测定 间苯二酚法【4 7 】。 2 6 3 唾液酸单体含量的测定 改良t b a 法【4 引。 2 6 4 水解率的测定 水解之前( c o ) 的总唾液酸含量用间苯二酚盐酸法测定；水解后游离单体唾液酸 ( c 1 ) 用改良t b a 法测定。唾液酸水解率y - c i c o 。 2 6 5 铵盐的测定 靛酚兰次氯酸钠法【4 9 】。 2 6 6 山梨醇的测定 变色酸法【5 0 1 。 2 6 7 唾液酸醛缩酶酶活测定 比色法湖。 其中酶活定义：在3 7 条件下，每分解或合成1n m o l 唾液酸所需的酶量定义为一 个酶活单位( u m g ) 。 2 6 8 有机酸含量的测定 高效液相色谱( h p l c ) 法【5 l 】。条件：高效液相色谱仪为安捷伦1 1 0 0 型，色谱柱为安 捷伦z o r b a xs & a q 柱( 1 5 0m m x 4 6m m ，5 岬) ，柱温3 0 ，进样量为1 0 此，检 测波长2 1 0n l n 。流动相体积流量o 5m l m i n ；流动相组成：0 5 ( 体积分数) 乙腈、9 9 5 ( 体积分数) 0 0 2m o l lk h 2 p 0 4 ，调p h 至2 o ( 用磷酸调节) 。 2 6 9 唾液酸红外光谱鉴定 采用k b r 压片法测定【5 2 】。 9 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 丙酮酸钠对ec o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8 发酵生产聚唾液酸的影响 唾液酸醛缩酶( s i a l i ca c i dl y a s e ) 是聚唾液酸合成途径中起关键调控作用的因素， 该酶催化的反应如下式( 3 1 ) 所示。该反应是可逆的，存在一个平衡常数k ( k = 【s i a l i c a c i d ( m a n n a c x p y r ) ) 。大肠杆菌通过调节该反应进行的方向来控制终产物聚唾液酸 的合成。当底物( n 乙酰甘露糖氨或丙酮酸盐) 浓度较高或者产物( 唾液酸) 浓度较低 时，反应会向合成方向进行，反之则会向降解方向进行。在利用酶法来合成唾液酸中， 以n 乙酰甘露糖氨和丙酮酸盐为底物，在唾液酸醛缩酶的催化作用下制备唾液酸【2 5 ，2 6 】。 在此过程中，为了促使反应向合成方向进行，需要向反应体系中过量添加底物，通常会 选择添加相对廉价的前体物质丙酮酸盐。过量添加丙酮酸钠是目前酶合成法制备唾液 酸的常用策略。 m a n n a c + p y r u v a t e 兰! 型! ! 竺垫生翌! s i a l i c a c i d ( 3 1 ) 在微生物发酵法制备唾液酸中，先通过利用微生物发酵制备聚唾液酸，然后简单酸 水解也可得到唾液酸。相对于天然提取和酶合成，微生物发酵制备唾液酸具备不受原料 来源限制，发酵底物价格低廉以及易于放大生产的优势。但是目前发酵法制备唾液酸存 在产量普遍较低的一个问题，聚唾液酸的产量通常在1 3g l 之间【2 9 ，3 2 1 。在前期的预实 验中，我们发现在微生物发酵生产聚唾液酸的培养基中添加前体物质丙酮酸钠可以提 高聚唾液酸产量。本节拟研究丙酮酸钠对聚唾液酸发酵及唾液酸醛缩酶活力的影响，深 入了解丙酮酸钠对促进聚唾液酸合成的机制，优化出最佳策略促进聚唾液酸高效合成。 3 1 1 聚唾液酸分批发酵过程分析 图3 1 是液体培养ec o l ic c t c cm 2 0 8 0 8 8 发酵生产聚唾液酸的过