（食品科学专业论文）竹叶总黄酮提取及纯化工艺的研究.pdf

摘要本文首先对竹叶中总黄酮的含量进行了测定，得每克干竹叶中总黄酮含量为1 3 6 5 m g ，与文献 3 5 1 报导的用甲醇浸提，用w y g c l 8 色谱柱，以甲醇：水：磷酸f 6 0 ：4 0 ：o 5 1 f v ：v ：v ) 为流动相，以2 5 4 n m 为检测波长，测定的竹叶中黄酮总量在5 , 9 1 3 1 m g g 的范围基本相符。其次对竹叶中黄酮的最佳提取条件进行了研究，确定了乙醇浸提是最崖的提取方法，确定了6 4 ( v 0 7 , 醇，料液比l ：3 0 ( w v ) ，浸提时间6 小时，温度8 0 。c ，浸提2 次，p h 值1 0 5 为竹叶中黄酮的最佳浸提条件。在此条件下所得浸提液的吸光值可达o 2 8 6 ，即每克干竹叶的浸提液中含有黄酮1 2 4 1 m g ，则可得浸提率为0 05 9 。然后对竹叶提取液中黄酮的纯化进行了研究，得出竹叶黄酮的最佳精制条件为：以大孔吸附树脂a d s 一1 7 为竹叶黄酮的专用分离树脂，采用吸附流速为3 m l m i n ，洗脱流速为1 5 m l m i n ，径高比为1 ：7 5 ，吸附原液p h 值为9 ，洗脱剂选择4 0 乙醇溶液，洗脱剂用量为3 b v ( 树脂床体积) 。在此条件下得到的洗脱液再采用真空冷冻干燥的方法，得到竹叶黄酮的黄褐色粉末。最后对竹叶黄酮的黄褐色粉末进行了鉴定，得：产品中黄酮纯度为2 8 0 4 ，经a d s 1 7 树脂依次吸附、洗脱后，产品中黄酮纯度变为原来上柱前样液的3 2 7 4倍，提高约2 倍多，产品黄酮得率为3 7 4 4 。产品中总糖含量的测定结果为3 8 6 5 ，含氮化合物含量( 以蛋白质量计) 仅为1 5 8 ；利用颜色反应检验产品中黄酮类化合物可能属于黄酮醇类或黄酮类，利用薄层层析定性产品中黄酮类化合物可能属黄酮类，利用紫外光谱定性产品中黄酮类化合物具有黄酮的吸收光谱特征，综上所述，可以确定产品中黄酮类化合物可能属黄酮类。关键词：竹叶黄酮，提取，纯化，鉴定a b s t r a c tf i r s t l y , t h et o t a lf l a v o n o i d sc o n t e n to ft h eb a m b o ol e a fw a sd e t e r m i n e di nt h i sp a p e r i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h et o t a lf l a v o n o i d sc o n t e n to fp e rg r a md r yb a m b o ol e a fw a si3 , 6 5m i l l i g r a m ，t h er e s u l tw a sb a s i c a l l yc o n s i l i e n tw i t ht h er e s u l tw h i c hw a sr e p o r t e db yr e f e r e n c el i t e r a t u r e i nt h i sl i t e r a t u r e t h er a n g eo f5 9 13 1m g go ft h et o t a tf l a v o n o i d sc o n t e n to fb a m b o ol e a fw a sd e t e r m i n e db ym e t h a n o le x t r a c t i o n ，t a k i n gw y g c l8a sc b x o m a t o g r a r nc o l u m n t a k i n gm e t h a n o l ：w a t e r ：p h o s p h o r i ca c i d ( 6 0 ：4 0 ：0 5 ) ( v ：v ：v ) a sm o b i l ep h a g e ，a n dt a k i n g2 5 4 n ma sd e t e r m i n i n gw a v e l e n g t h s e c o n d l y , t h eo p t i m a le x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fb a m b o ol e a ff l a 、，o n e ( t h ea b b r e v i a t i o ni sb l f ) w e r es t u d i e d ，a n di tc o u l db ed e t e r m i n e dt h a ta l c o h o ls o a k i n gw a st h eb e s te x t r a c t i o nm e t h o da n d6 4 a l c o h o l ( v v ) ，t h e1 ：3 。( w do fm a t e r i a la n da l c o h o lr a t i o ，6h o u r so fe x t r a c t i n gt i m e ，8 0 o ft e m p e r a t u r e ，2t i m e so fe x t r a c t i o n ，1 0 5o f p hv a l u ew o r et h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n so f t h eb l f ，a tt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ea b s o r b e n c yo fe x t r a c t i n gs o l u t i o nc o u l dr e a c ho 2 8 6 ，t h ee x t r a c t i n gr a t ew a s9 0 5 9 t h e nt h ep u r i f l c a t i o no fb l fw a ss t u d i e d ，a n dt h eo p t i m a lp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sw e r ec o n c l u d e dt h a tt h em a o r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i na d s 一1 7w a ss e l e c t e da se x c l u s i v es e p a r a t i o nr e s i no fb l f , t h ea d s o r p t i o nv e l o e i t yw a s3 n 1 j l m i n ，e l u t i o nv e l o c i t yw a s1 5 m l m i n , d i a m e t e ra n dh e i g h tr a t ew a s1 ：7 5 ，t h ep hv a l u eo fu n d e r a d s o r p t e ds o l u t i o nw a s9 ，t h ee l u t i o ns o l v e n tw a s4 0 a l c o h o l ，a n dt h eq u a n t i t yo fe l u t i o ns o l v e n tw a s3 b v ( r e s i nb e dv o l u m e ，i t sa b b r e v i a t i o ni sb v ) t h e nt h ee l u e u tw h i c hg o tf r o ma b o v ec o n d i t i o n sw a sd e h y d r o g e n i z e db yv a c u u mf r e e z i n gd r y i n gm e t h o d ，t h et a np o w d e ro f b l fw a sc o l l e c t e d f i n a l l y , t h et a np o w d e ro fb l fw a se v a l u a t e d a n ds ot h ec o n c l u s i o nw e r e ：t h ep u r i t yp e r c e n t a g eo f b l fw a s2 8 0 4 ，a f t e ra d s o r p t e db ya d s 17r e s i na n de l u t e db y4 0 a l c o h o l ，t h ep u r i t yp e r c e n t a g eo fb l fb e c a m e3 2 7 4t i m e so ft h ep r e a d s o r p t e ds o l u t i o n ，i n c r e a s e d2t i m e so rm o r e ，t h ey i e l dr a t eo f b l fi np r o d u c tw a s3 7 4 4 ；t h et o t a ls a c c h a r i d ec o n t e n to fp r o d u c tw a s3 8 。6 5 ，a n dt h ec o n t e n to ft h ec o m p o u n dc o n t a i n i n gn i t r o g e no f p r o d u c t ( c a l c u l a t e da sp r o t e i n ) w a so n l yi ，5 8 ；t h ef l a v o n o i d so fp r o d u c td e t e c t e db yc o l o rr e a c t i o nc o u l db e l o n gt of l a v o n o lo rf l a y o n e t 1 1 ef l a v o n o i d si np r o d u c td e t e c t e db yt l cc o u l db e l o n gt of l a v o n e ，t h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo ff l a v o n o i d si np r o d u c td e t e c t e db yu l t r a v i o l e ts p e c t r o m e t e rh a dt h ec t m r a c t e r i s t i c so ft h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo ff l a v o n e s of r o ma b o v e i tc a nb ed e t e r m i n e dt h a tt h ef l a v o n o i d si np r o d u c tp r o b a b l yw a so rw e r eak i n do rk i n d so ff l a v o n e k e yw o r d s ：b a m b o ol e a ff l a v o n o i d s ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，e v a l u a t i o n圣堂型垫查兰里主兰堡丝苎一1 前言1 1 黄酮类化合物1 - 1 1 概述黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物。数量之多列天然酚性化合物之首，大多具有颜色。黄酮类化合物在植物体内大部分与糖成甙，一部分以甙元形式存在h l 。在1 9 5 2 年以前，黄酮类化台物( f l a v o n o i d s ) 主要指基本母核为2 - 苯基色原酮的- 系列化合物。色原酮2 一苯基色原酾由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。在黄酮类化合物分子结构内具有碱性原子，能与矿物酸生成锑盐，所以过去也曾把黄酮类化合物称为黄碱素类化合物【2 j 。目前黄酮类化合物是泛指两个苯环( a 与b ) 通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物，基本碳架为：1 1 2 结构分类根据中央三碳链的氧化程度、b 环连接位置( 2 或3 位) 以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类，如表1 一l 所示。此外，尚有两分子黄酮或两分子二氢黄酮，或一分子黄酮及一分子二氢黄酮按c c 或c - o c 键方式连接而成的双氢黄翻化合物【3 l ( b i f l a v o n o i d s ) 。天然黄酮类化合物多以甙类形式存在，并且由于糖的种类、数量、连接位置及连接方式不同，可以组成各种各样的黄酮甙类。组成黄酮甙的糖类【2 1 主要有：单糖类：d - 葡萄糖、d 一半乳糖、d 木糖、l 鼠李糖、l 阿拉伯糖及d 葡萄糖醛酸等。f 前言双糖类：槐糖( g l ubl 一2g l u ) 、龙胆二糖( g l u81 6g l u ) 、芸香糖( r h aa12g l u ) 、刺槐二糖( r h aq1 6g a l ) 等。三糖类：龙胆三糖( g l ub1 6g l usi 一2f r u ) 、槐三糖( g l u i 一2g l upi一2g l u ) 等。黄酮甙中糖连接位置与甙元的结构类型相关。如黄酮醇常形成3 一、7 一、3 、4 单糖甙，或3 ，7 、3 ，4 及7 ，47 双糖甙等。除0 一糖甙外，天然黄酮类化合物中还发现有c 糖甙( c g l y c o s i d e s ) ，如葛根黄素( p u e r a r i n ) 、葛根黄素木糖甙( p u e r a r i n x y l o s i d e ) ，为中药葛根中的扩张冠状动脉血管的有效成分【4 1 。表1 - 1 黄酮类化合物甙元的主要结构类型f 2 】黄酮黄酮醇二氢黄酮二氢黄酮醇异黄酮二氢异黄酮查耳酮7 、o 矿l 、jj 一x 、o 蟋一- - , 、,c ( ：= 一一o滟顶了圆二氢查耳酮花色素黄烷3 醇黄烷3 ，4 二醇双苯毗酾噢哝o一_1 1 3 黄酮类化合物的理化性质及显色反应1 i 3 i 性状黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮甙类) 为无定形粉末。一般情况妒。筹嚣。辑天津科技大学硕士学位论文下，黄酮、黄酮醇及其甙类多显灰黄黄色，查耳酮为黄橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇不显色，异黄酮类显微黄色，花色素及其甙元的颜色随p h 不同而改变，一般显红( p h 8 5 ) p 1c1 1 3 2 溶解性一般游离甙元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。其中黄酮、黄酮醇、查耳酮更难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，较易溶于水；花色素及其甙元均易溶于水。黄酮甙一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，糖链越长，则水溶度越大【3j 。1 1 3 3 酸性与碱性( 1 ) 酸性黄酮类化台物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中口j 。( 2 ) 碱性y 吡喃环上的1 氧原予，因有未共用电子对，故表现微弱的碱性，可与强无机酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水后即可分解1 3 】。1 1 3 4 显色反应黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及y - 吡喃酮环有关。表1 - 2 各类黄酮类化合物的显色反应口14 不有荧光1 1 4 黄酮类化合物的提取与精制1 1 4 1提取方法黄酮类化合物的提取，主要是根据被提取物的性质及伴随的杂质来选择适合的提取溶剂，甙类和极性较大的甙元，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些极性较大的混合溶剂 例如甲醇一水( 1 ：1 ) l 进行提取。大多的甙元宜用极性较小的溶剂，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等来提取，多甲氧基黄酮类甙元，甚至可用苯来提取【“。( 1 ) 乙醇或甲醇提取乙醇或甲醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇( 如9 0 9 5 )适宜于提取甙元。6 0 左右的醇适宜于提取甙类。提取的次数一般是2 4 次，可用加热抽提法或冷浸法j 。( 2 ) 热水提取热水仅限于提取甙类，例如自槐花米中提取芦丁。由于热水提取出的杂质较多，故不常使用1 2 j 。f 3 ) 碱性水或碱性稀醇提取由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水( 如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 如5 0 乙醇) 浸出。用碱性溶剂提取时，所用的碱浓度不宜过高，以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核。当有邻二酚羟基时，应加硼酸保护弘i 。1 1 4 2 精制方法( 1 ) 溶剂萃取法用水或不同浓度的醇提取得到的浸出成分复杂，往往不能直接析出黄酮类化合物，需尽量蒸去溶剂，使成糖浆状或浓水液。然后用不同极性的溶剂相继萃取，可能使甙与甙元分离( 或使极性与非极性甙元分离) 。例如先用乙醚自浓水液中萃取甙元，再用乙酸乙酯反复萃取甙【2 】。( 2 ) 铅盐沉淀法在乙醇或甲醇的提取液中加入饱和的中性乙酸铅溶液，可使具有邻二酚羟基或羧基的黄酮类化合物沉淀析出。如果所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅发生的沉淀为杂质，过滤除去。再向滤液中加碱式乙酸铅，可使其它黄酮类化合物沉淀析出f 笛。滤取黄酮类化合物的铅盐沉淀，悬浮于乙醇中，通入h 2 s 进行复分解，滤除硫化铅沉淀，滤液中可得黄酮类化合物。近年来在用铅盐法不理想的情况下，可用聚乙烯吡咯烷酮( p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ，p v p ) 作沉淀剂，p v p 与酚羟基形成氢键最合适条件是p h 3 5 的1 1 0 甲醇水溶液2 1 。( 3 ) 柱色谱法柱填充剂有聚酰胺、硅胶、氧化锅、葡聚糖凝胶和纤维素粉等，其中以聚酰胺、硅胶最常用。聚酰胺柱色谱聚酰胺对各种黄酮类化合物有较好的分离效果，且其容量比较大，适合于制备性分离5 1 。色谱用聚酰胺主要有腈纶6 ( 聚己内酰胺) 、腈纶6 6 ( 聚己二酰己二胺) 和p v p等1 。聚酰胺的吸附作用是通过其酰胺羰基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生的，影响聚酰胺吸附力强弱的因素有：( 1 ) 与黄酮类化合物分子中形成氢键数目多少有关，能形成氢键的基团数越4天津科技大学硕士学位论文多吸附力越强；( 2 ) 与形成氢键基团的位置有关，如所处位置易于形成分子内氢键，则吸附力减小；( 3 ) 分子内芳香化程度越高，共轭双键越多，则吸附力越强；( 4 ) 不同类型黄酮类化合物，被吸附强弱顺序为：黄酮醇 黄酮 二氢黄酮异黄酮；( 5 ) 与溶剂介质有关，由于聚酰胺与各类化合物在水中形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱【2 j 。因此，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强的顺序为：水 甲醇或乙醇( 浓度由低到高) 丙酮 稀氢氧化钠的水溶液或氨水 甲酰胺二甲基甲酰胺( d m f ) 尿素水溶液【4 j 。硅胶柱色谱在硅胶柱上分离黄酮甙元时，用氯仿一甲醇混合溶剂作移动相：分离甙时，用氯仿甲醇- 水( 8 0 ：2 0 ：1 ) 或( 6 5 ：2 0 ：2 ) 和( 8 0 ：1 8 ：2 ) 作移动相较好，也可用乙酸乙酯丙酮水( 2 5 ：5 ：1 ) 作移动相【2 j 。氧化铝柱色谱氧化铝对黄酮类化合物吸附力强，特别是具有3 - o h ( 或5 - o h ) 、4 - 羰基及邻二酚羟基结构的黄酮类化合物与铝离予络合而被牢牢地吸附在氧化铝柱上，难以洗脱，所以很少应用。但当黄酮类化合物分子中没有上述结构，或虽有上述结构但羟基已被甲基化时，往往也可用氧化铝柱分离。例如葛根中4 种异黄酮的分离川。葡聚糖凝胶柱色谱s e p h a d e xg 和s e p h a d e xl h 2 0 两种类型凝胶已成功地应用于分离黄酮类化合物，分离甙元时主要靠吸附作用，因吸附力的强弱不同而分离。凝胶对甙元吸附程度大小一般取决于游离酚羟基的数目多少。分离甙时，主要靠分子筛作用。在洗脱时，般是按甙分子量由大到小的顺序洗出柱体【2 1 。1 2 竹叶1 2 i 概述竹子是禾本科多年生常绿植物，是当今世界最具有使用价值的植物之一。竹叶的医疗保健作用早已为我国人民所认识【6 】。竹叶在我国具有悠久的食用和药用历史，人们对竹叶风味的直觉就是那透人心脖的清香。本草求真：“竹叶据书载，凉心缓脾、清痰止渴、为治上焦风邪烦热、咳逆喘促、呕秽吐血、一切中风惊痫等症，无非因其轻能解上、辛能散郁、甘能缓脾、凉能入心、寒能疗热故耳”。本草逢原载“竹叶兼行肌表，故能疗疮杀虫。竹茹专清胃腑，故能止呕除烦。竹沥善透经络，能治筋脉拘挛。痰在脾里膜外、经络四肢，非竹沥不能化之”。药品化义载：“竹叶清香透心，微苦凉热，气味俱清a 经曰治温以清，专清心气，昧淡利窍，佼心经热血分解。主治暑热消渴，胸中热痰，伤寒虚烦，咳逆喘促，皆用为良剂也。又取清气入，是以清气分之热，非竹叶不能”。竹叶是一味传统的清热解毒药，据中药大辞典记载，淡竹叶功用主治：清热解烦，生滓利尿；治热病烦渴，小儿惊痈，咳喘吐血，面赤，小便短赤，1 5 糜舌疮等”。竹叶及其嫩茎是动物界活化石大熊猫一的专一食料。阔叶箬竹的叶常被用来包裹食物，如我国的粽子和日本的寿司等。在我国少数民族地区还有饮用竹筒茶、竹叶茶，吃竹米饭的习惯拶j 。1 2 2 竹叶提取物的开发近况2 0 世纪8 0 年代，有研究报道 9 1 从竹叶中提取食品防腐剂、杀菌荆和叶绿素等。9 0 年代以来，人们开始关注竹时中黄酮类化合物的存在及其生物学活性t t 。1 9 9 8 年，浙江大学在借鉴国内外植物黄酮提取方面的各种专利技术的基础上，结合竹叶中黄酮类化合物存在的特点，开发了经济、实用、独特的提取工艺，获得了国家发明专利( z l9 8 1 0 4 5 6 4 2 ) ，并率先在浙江实现了产业化。同年，( 淡)竹时被卫生部正式批准列入“药食两用的天然植物名单” j 。1 9 9 9 年竹时黄酾获国家级新产品证书，其衍生产品竹康宁胶囊获卫生部保健食品批文f 卫食健字( 1 9 9 9 ) 第0 5 6 4 号 ，竹叶啤酒和竹叶饮料等也相继上市【1 。1 2 3 竹叶有效成分和其他有用成分近年来的研究表明，竹叶中含有大量的黄酮、酚酸、蒽醌类化合物、生物活性多糖、香豆素类内酯、特种氨基酸、芳香成分和锰、锌、硒等微量元素阎。1 2 3 1竹叶黄酮及其甙类有关学者对6 属1 7 种竹子中竹叶黄酮类成分进行过定量研究，竹时以醇提取，平均得总固形物1 6 0 8 ，总黄酮1 9 7 ，总酚4 2 。即竹叶中总黄酮平均含量在2 左右”。对刚竹属的桂竹叶总黄酮进行分离，结果得黄酮类成分2 1种，；g e e2 0 种为黄酮甙，并以c - 糖甙为主。4 种主要的竹叶碳甙黄酮分别是荭草甙( o r i e n d n ) 、异荭草甙( h o m o o r i e n d n ) 、牡粥甙( t e x i n ) 和异牡荆甙( i s o v i t e x i n l ，其结构通式如下：h式中各基团与4 种竹叶碳甙黄酮对应关系如下：表1 3 式中各基团与4 种竹叶碳甙黄酮对应关系表【1 46天津科技大学硕士学位论文碳甙黄酮与普通的氧甙黄酮相比具有以下几方面的突出优点：结构稳定，不易降解；能深入病灶部位，直接发挥药效；亲水性增强，有利于食品和药物的开发。国际学术界从9 0 年代起开始关注碳甙黄酮，此领域属最新研究前沿 1 4 1 。1 2 3 2 竹叶活性多糖研究发现，竹叶中含有活性多糖，其含量按干青叶计，一般在t 0 0 7 0 0 m l o o g 之间。如从箸竹中分离得到由木糖、阿拉馅糖和半乳糖组成的活性多糖。又如从毛竹叶中提取得到种中等分子量的酸性杂多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等6 神单糖组成”】。1 2 3 3 竹叶特种氨基酸从桂竹和金毛竹的竹叶及其提取物中分离得到了一种有相当含量的羟化氨基酸，即6 一羟基赖氨酸( n h 2 c h 2 c h ( o h ) c h 2 c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h ) ，主要以游离单体和小肽的形式存在。其中，6 一o h - l y s 有比l y s 更高的清除( o 2 ) 的能力 1 6 。1 2 3 4 竹叶芳香成分对阔叶箬竹、金毛竹和四季竹的竹叶精油和头香，利用c g c m s d s 进行了研究，分别检出风味化合物5 7 种、6 8 种和8 2 种，共1 4 4 种，其中2 2 种为3种竹子所共有，约占总挥发物的6 0 - 7 0 。芳香成分以醛、醇、呋喃、酮类为主，c 6 一c 8 中等长度碳链的含氧化合物占主导地位，是竹时清香的物质基础。其中起关键作用的有e 一2 一己烯醛、z 3 己烯醛、2 一乙基呋喃、己烯和己醛等五种c 6 化合物i 。1 2 3 ，5 竹叶矿质元素通过对箬竹、刚竹、毛竹、雷竹和清竹竹叶进行矿质元素测定，检出了2 0多种矿质元素。其中富含人体必需的f e 、c a 、s i 等常量元素和z n 、m n 、c u 、v 、n i 等微量元素【6 1 。1 2 4 竹叶提取物( e x t r a c to f b a m b o ol e a f ，简写为e b l ) 药理功能和其它用途1 2 4 1 抗活性氧自由基e b l 具有优良的抗自由基能力和确凿的类s o d 活性。对来自6 个属1 7 种竹子秋叶的提取物的调查，用化学发光法测得其醇提物对o2 的半抑制浓度( i c s o ) 平均s b4 9 3 2 3 6 ug m l ，相当于0 1 2 4 u m ls o d 的活力：对o h的i c 5 0 平均为1 4 8 0 9 l i n g m l ，相当于0 2 3 5 m g m l 阿魏酸纯品的作用1 18 1 。用化学发光法进一步测定了用不同方法从桂竹叶中提取的总黄酮清除o 。2 和。o h 的有效范围，竹叶总黄酮在o 1 一l o ug m l 浓度范围内清0 1 活土萱蔓一力呈显著的浓度依赖关系，其i c 5 0 在0 8ug m l 左右；清o h 的有效浓度范围在0 0 1 一l m g m l 之间，i c 5 0 在4 5 0ug m l 左右 1 9 1 ，表明e b l 有很强的清除活性氧自由基的能力，尤其对o 2 的效价更高，且刚竹属的品种普遍性能优良。为了多方面印证e b l 的类s o d 活性( 即清除o 2 的能力) ，迸一步运用化学发光法、分光光度法和电子自旋共振法( e s r ) 等多种手段和不同的o 。z 产生体系进行测试，均获得了很好的结果 2 0 2 ”。电子自旋共振法( e s r ) 是目前篚宜接检测自由基的唯一方法，e s r 测定结果与化学发光法具有显著的相关性，充分肯定了竹叶中的活性成分具有很强的类s o d 活性，且总黄酮试样的活力比粗提物高约3 0 倍。此外，e s r 研究的结果还显示竹叶总黄酮试样( 总黄酮糖甙含量为2 2 ) 具有与单体黄酮( 术犀革素一7 一o 一葡萄糖甙) 相同的清o 2 能力。进步的研究表明，竹时黄酮各单体之间存在相当强的协同作用f 2 “。将从桂竹叶中分离纯化的7 种黄酮糖甙单体以1 1 1 1 0 4 m o l l 的浓度等体积混合，测碍混合物清除o 2 的速率常数( k 3 ) 为3 。9 4 1 0 6 ( m o l l ) 1 s c c ，相比其各自k 3 的平均值1 5 7 ( o 。9 5 ) 1 0 6 ( t o o l l ) “s e c ，清除速率提商了1 倍多，与加拿大u b c大学( u n i v e r s i t yo fb r i t i s hc o l u m b i a ) 的合作研究还表明，金毛竹( p h y l l o s t a c h y sn i g r av a r h e n o n i s ) 叶提取物显示了良好的清除d p p h ( i ，1 - d i p h e n y l 一2 - p i c y l h y d r z y l )自由基的活性，并呈显著的浓度依赖关系【23 、。1 2 4 2 确凿的s o d 样作用对人体1 2 种黄酮单体( 其中7 种竹叶黄酮甙和1 种银杏黄酮槲皮素) 和1 种由7 种竹叶黄酮甙单体组成的混合物。用化学发光法测定了它们清除( o 。2 )的速率常数如和抑制o h 的抑制率i ( ) ，并探讨了构效关系。结果表明：( 1 ) 1 2 种黄酮均有清除( o l ) 的能力，有类s o d 样作用。它们的k 3 值在1 0 5- - 1 0 。( t 0 0 1 l ) 。s e c “之间，约比s o d 的k 3 值小3 个数量级，i ( ) 值多在1 7 4 2 之阃，与银杏黄酮中为主的一类黄酮的甙元锫皮素楣比，7 种竹时黄酾甙中，除47 一甲氧基牡剂甙外，清除和抑制活性氧自由基的能力或超过或耀当或接近于槲皮素。由此可见竹叶黄酮类的生理活性超过或相当于银杏叶黄酮。此外，实验还发现，7 种竹叶黄酮甙单体的混台物清除( o 2 ) 的能力超过其中最优者，说明竹叶黄酮甙对清除( 0 1 2 ) 有协同增强效应1 1 8 2 2 1 。有人采用目前能真正检测自由基的难方法一电子自旋共振法f e s r ) ，对竹叶黄酮甙进行清除( o 2 ) 的研究，也获得了与前述相似的结论。( 2 ) 研究结果认为：黄酮及其甙类的分子结构中，a 环的2 ( 3 双键和b 环的4 - - o h 是清除( 0 。2 ) 的关键基团，3 o h 和7 - o h 也有一定的作用；b 环的3 4 - d i - o h 是清除。o h 的关键基团。黄酮类物质的这种分子结构所形成的自由基，会团共轭效应或分子内氢键稳定，有利于h - 的生成，生成的h 可天津科技大学硕士学位论文h 一，- 一j j 一誓j d f a b e 。而且c 、d 、f 这三个因素的f 值的置信度均在9 0 以上，而其它a 、b 、e 的f 值的置信度均低于9 0 ，故选择因素c 、d 、f 这三个因素作为主要因素作进一步的响应面分析，以确定这些因素所对应的最优水平。3 ，2 3 2 响应面设计统计分析结果3 2 3 2 1 响应值结果按文献峥”，由b o x - b e h n k e n 设计方案所得的实验结果如下：表3 7b o x b e h n k e n 设计方案及响应值垦竺塑! 一!堕丝廑i一1100 2 0 621100 1 9 531100 2 4 64l100 2 5 55011o2 0 860一i10 2 1 470110 1 8 280l1o 1 9 591010 ，1 8 41 01o。lo 2 3 81 1- 1010 2 t 61 21010 2 4 61 30000 2 7 91 4000o 2 8 23 2 3 2 2 回归方程各葡翥吾薹毒妻磊戛殳l 丝生3 2天津科技大学硕士学位论文表3 8 回归方程各项的方差分析表按文献1 6 8 ”j ，回归方程的一次项和二次项的f 值均大于f o9 5 ( 3 ，2 ) = 1 9 1 6 ，但都小于f 0 9 9 ( 3 ，2 ) = 9 9 1 7 ，表明这两项具有较高的显著性，说明响应值的变化相对复杂，各个具体的试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，交互项的f 值很小，说明这三因素之间的相互影响不大，失拟项的f 值也很小，表明该方程对实验拟合情况好，实验误差小，可以用该方程对不同反应条件下的吸光度值进行预测。3 2 _ 3 2 3回归方程的方差分析结果表3 9 回归方程的方差分析表按文献【68 | ，方程的f 值为2 1 2 4 8 ，f f 0 9 9 ( 9 ，5 ) = 1 0 1 6 。说明上述回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系是显著的，即这种实验方法是可靠的。3 2 3 2 4 回归方程的系数取值结果表3 - 1 0 回归方程的系数取值表截距。yzx 20 2 7 6 6 6 70 0 2 3 0 0 00 0 0 5 8 7 50 0 0 7 3 7 5- o 0 1 4 9 5 8面i 一f i 面 0005000“：面西i 三丽_ 石丽；石i f 面而；矿面互石亨面一所以黄酮含量吸光度值( a ) 与乙醇浓度( x ) 、p h i ( y ) 、浸提时间( z ) 三因素之间的反应曲面拟合方程为：吸光度值a = 0 2 7 7 + 0 0 2 3 x - 0 0 0 6 y + o 0 0 7 z + o 0 0 5 x x y + 0 0 0 2 yx z - 0 0 0 6 x x z 一0 0 1 5 x 2 0 0 3 6 y 2 0 0 4 1 2 2 。3 2 3 2 5 基于试验编码值的响应值的典型分析结果表3 一1 1基于试验编码值的响应值的典型分析表稳定点的估计值为0 2 8 5 5 8 4表3 1 2 表明稳定点类型的特征值表3 结果与讨论按文献 7 0 ，当特征值均为负值时，稳定点为最大值点，即在点( 6 4 ，1 0 5 ，6 o )处响应值对应有最大值，亦即在此3 因素中黄酮的最佳浸提条件为：6 4 乙醇，调p h 值为1 0 5 ，浸提总时间为6 h 。在此条件下由每克干竹叶所得浸提液的吸光值可达o 2 8 6 ，即每克干竹叶的浸提液中含有黄酮1 2 4 1 m g ，则可得浸提率为9 0 5 9 。3 2 3 3等高线图和响应面图分析结果按文献峥，比较三组图可得：浸提时间对黄酮浸提的影响较为显著，表现为曲线较陡，浸提时间最佳值在6 h 附近，而溶剂浓度与浸提溶剂的p h 值对黄酮浸提的影响不大，表现为曲线较为平滑，随其含量的增加或减少，响应值变化很小，其最佳值分别在6 4 和1 0 5 左右。z - 靛鹰mf ；x “i i ，g t 闻58 h吸光度2 f ( x ，y ) 的等高线图( z = 6 h )吸光度= f ( x ，y ) 的响应面图( f 6 h )e w 紫“曲：1 。5吸光度2 z ，x ) 的等高线图( f 1 0 5 )吸光度= f ( z ，x ) 的响应面图( y = 】o 5 )蒌望型茎奎兰堡圭堂垡堡苎吸光度= f r y ，z ) 的等高线圈( x _ 6 0 )吸光度= f u ，酬强响应面v a ( x = 6 0 )图3 - 1 0 竹叶黄酮提取条件的响应面分析曲线3 3 竹叶黄酮的分离和精制3 3 1 大孔吸附树脂的筛选结果用1 2 种树脂对经过澄清后的竹叶黄酮粗提液进行处理，在初始浓度均为4 9 6 m g m l 的条件下，测其吸附后平衡浓度( 即树脂充分吸附后，吸附液的剩余浓度) ，再利用3 0 0 m l 9 5 的乙醇进行解吸，测其解吸液浓度，可得不同树脂对竹叶黄酮的吸附率和解吸率，结果见表3 1 3 。表3 1 3 树脂对竹叶黄酮的吸附率及解吸率竺竺鲞篓鳖矍窆羞翌燮：鐾篓篓墨s _ 80 9 63 08 0 6 56 0 o0 4 4 52 2 2 5a b 一82 0 82 1 65 8 0 64 3 20 8 6 76 02 1h 1 0 33 ，6 l1 0 2 52 7 2 l2 0 2 50 11 21 6 5 9d a 2 0 12 4 71 8 6 7 55 0 2 03 7 3 50 2 6 72 1 4 5a d s 一1 71 4 82 6 17 0 1 65 2 21 2 4 87 1 7 2n k a - 93 3 01 2 4 53 3 4 72 4 90 ，3 2 43 9 0 4d 1 0 14 3 84 3 51 1 6 98 70 0 5 82 0 0 0d 3 0 13 9 17 8 7 52 1 1 71 5 7 50 ，0 9 61 8 2 9d 4 0 2 03 7 49 1 52 4 6 01 8 30 1 0 41 7 0 5d 3 5 2 03 5 61 0 52 8 2 22 1 0o 1 2 71 8 1 4a d s 82 6 817 14 5 9 73 4 20 4 4 53 9 0 4n k a - i i1 7 82 3 8 56 4 1 14 7 70 2 2 81 4 3 4从表3 1 3 可以看出，树脂a d s 1 7 的吸附率与解吸率较高，均在7 0 以上，比其它树脂具有较大的吸附性与解吸性。树脂的极性( 功能基) 和空间结构( 孔径、比表面、孔容) 是影响吸附性能的重要因素。实验所用树脂属聚苯乙烯型或2 甲基丙烯酸酯型，有极性、非极性、弱极性3种类型。从表3 1 3 可见，极性或弱极性的树脂对竹叶黄酮吸附量较大，如树脂s 8 ，a b - 8 ，a d s 一1 7 ，n k a 一等。这是由于竹叶黄酮具有酚羟基和糖甙链，有一定的3 5一一! 竺墨皇堕堡一一一。极性和亲水性，生成氢键的能力较强，有利于弱极性和极性树脂的吸附。相对来c 兑，非极性树脂对竹时黄酮的吸附量偏小。另外，在某些情况下，吸附作用力强，解吸起来就会困难，如s - 8 树脂吸附量大，但解吸率很低，不适用于分离。树脂仅具有适当的功能基还不够，具有较高的比表面积对吸附将更为有利。大孔树脂吸附原理主要为物理吸附，所以比表面积增加，表面张力随之增大，吸附量提高，对吸附有利。如树脂a d s 一1 7 孔径虽然与n k a 一9 相近，但由于比表面积明显大于n k a 9 ，其黄酮吸附量也显著大于n k a 一9 。被吸附物通过树脂的孑l 径扩散到树脂孔内表面而被吸附，只有当孔径足够大时，比表面积才晴充分发挥作用。因此树脂吸附能力大小与竹叶黄酮的分子量和构型有关，孔径大小直接影响不同大小分子的自由出入，从而使树脂吸附具有一定的选择性。竹叶黄酮各组分的分子量较大，使用孔径较大的树脂有利于吸附，若平均孔径较小，会造成吸附速度较慢，解吸不够集中，杂质分离效果差。根据吸附量、比表面积和孔径三者的关系，并非在比表面积高的前提下，孔径越大越好，这是因为：第一，孑l 径太大，便失去了选择性；第二，孔径大，比表面积又高，势必使孔体积增大。到一定程度树脂强度便下降；第三，孑l 体积增大还会引起体积比表面积( 即每i m l 湿树脂所具有的比表面积，m 2 ，瑚l ) 下降，反而会使吸附量下降。在实际应用中，对吸附量真正起作用的是体积比表面积。孔容的大小直接影响树脂的体积比表面积，孔体积增大引起体积比表面积下降，反而使吸附量下降。对d 3 5 2 0 来讲，孔容大是其吸附量较小的原因之一。而s 8 、a b 8 、a d s 一17 、n k a i i 树脂孔容都小，体积比表面积大，因而吸附量都较大。综上所述，就竹叶黄酮的特性而言，选择a d s 1 7 树脂作为分离、精制的媒质具有其它树脂所不可比拟的优越性。3 3 2a d s - 1 7 树脂最优吸附解吸工艺条件的确定3 3 2 1 不同吸附条件下的泄漏情况3 3 2 1 1 不同吸附流速下的泄漏情况通过调节恒流泵的流速，对上柱样液进行吸附流速的选择，应以泄漏点最迟出现的吸附流速为宜。因此在样液浓度均为1 3 7 9 i xg s m l ，径高比均为1 ：5 ，样液体积均为1 0 0 m l 的条件下，试验了l m l m i n ，2 m l m i n ，3 m l m i n 三种吸附流速下的泄漏情况如图3 1 j 所示：天津科技大学硕士学位论文0 i 0 00 0 9 00 0 8 00 0 7 00 0 6 00 0 5 00 ，0 4 00 0 3 00 0 2 00 0 1 00 0 0 0吸光度值。十2 m l m i n 十3 m l m i n 妒l m l m i n0体积( m l )图3 1 1 吸附流速与吸光度关系图通过计算得知，若流速为l m l m i n ，泄漏点出现在8 0 m l 附近；若流速为2 m l m i n ，泄漏点出现在7 0 m l 附近；若流速为3 m l m i n ，泄漏点出现在5 0 m l 附近。对于吸附树脂而言，不仅要求其吸附性能良好，还要追求其良好的洗脱性能。因此在上面的条件下，单一的吸附泄漏点的后移并不代表洗脱的效果也很好，也就不能证明这一吸附流速为最佳吸附条件成立，这样考察上述条件下的洗脱效果是决定最佳吸附条件的另关键。3 3 2 1 2 不同径高比对泄漏点的影响在树脂体积定的情况下，通过填充柱直径的变化，来调节树脂径高比的变化，以此来观察对泄漏点的影响，也是影响吸附树脂吸附量的一个主要因素之一。取浓度1 3 7 9hg m e 的样液各1 0 0 m l ，在吸附流速均为3 m l m i n 的条件下，试验了径高比分别为l ：5 ，l ：7 ，5 ，1 ：1 0 三种条件下的泄漏情况，得出结果如图31 2 所示：吸光度值01 0 00 0 9 000 8 000 7 0o 0 6 00 ，9 5 000 4 00 0 3 00 0 2 00 0 1 00 0 0 001 92 03 0- - i k - - 1s4 05 06 0 ? o卜1 7s体积( m l )8 09 01 0 1 ) 1 1 0- - - i t r - - 1 1 0图3 1 2 径高比与吸光度关系图通过计算得知，三种条件下的泄漏点分别为7 0 m l ，8 0 m l ，9 0 m l ，单从吸附量上考虑选取径高比为l ：l o 为宜。3 结果与讨论3 3 2 1 3 不同吸附原液p h 下的泄漏情况取p h 分别为1 2 ，9 ，6 的吸附原液各1 5 0 m l ，在吸附流速为3 m l m i n ，径高比为1 ：1 0 的条件下，分别对其泄漏情况进行比较，得出结果如图3 1 3 所示：01 20100 8魁簧0 0 6茸00 400 20。喾烹箬 _ i 毒圣= z 旦一! ：! ! !上表中可以得出，以4 0 乙醇洗脱效果最好，其次为3 0 芝，雨_ 罴2 0 0 ( 4 黧b v；5 0 5 0；赠慧(5bvv j 。1)忑：iz ：黜m ?5 4o 1 1 6戋从上表可以看出，当洗脱剂用量从2 b v 增至j 吾f 爵忑西再磊嚣函苗i 萧赢时的1 6 8 ，而从2 b v 增至4 b v ，5 b v ，6 b v 时浓绸钵啼非信憎士i i l l ：三：天津科技大学硕士学位论文1 7 1 ，1 7 7 ，1 7 4 ，与3 b v 时相差不大，考虑到成本以及生产周期的问题，洗脱剂用量选择3 b v 比较合适。3 3 2 2 3 不同解吸流速下的洗脱效果按2 2 3 2 3 3 方法，得出结果如图3 1 4 所示：吸光度值o 4 5o 4 0o ，3 5o 3 00 2 50 2 00 1 50 1 00 0 5o 0 0体积m lo1 02