（法医学专业论文）焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究.pdf

中 文 摘 要 1 焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因 进行性别鉴定的研究 摘 要 目的： 性别信息是法医检案过程中及考古研究过程中最重要的信息之 一。 通常在尸表保存完整的情况下，法医工作者可以通过形态学分析做出 判定。 然而面对重大群体性灾难事件中人的骨架完整性被破坏， 或者由于 小孩骨骼发育不全导致形态学分析难以得出鉴定结论时， 分子水平的鉴定 方法就显得尤为重要了。目前，常用的进行性别鉴定的dna技术主要包 括，y染色体的特异性探针、锌指蛋白（zfy/zfx）基因和牙釉质蛋白基 因（amelogenin gene，amel）的检测，其中对牙釉质蛋白基因的检测应 用得最为广泛。自1991年，nakahori等人对牙釉质蛋白基因进行测序后， nakahori（1991） 、akane（1991） 、bailey（1992） 、sullivan（1993）先后 用pcr扩增单拷贝x、y同源区域进行性别测定。目前sullivan法应用得最 广泛，在多个法医个人识别试剂盒中做为性别鉴定的方法， 其扩增片段为 106bp和112bp。 然而， 对于一些高度腐败降解的生物检材， 以及由于amel 序列突变及性染色体变异造成的“无效扩增”，现有的检测技术往往不能 获得明确的分型结果。针对这一问题，本研究建立了一种新的性别dna 分析方法，即应用焦磷酸测序技术分析牙釉质蛋白基因45bp的dna片段， 并对该方法的灵敏度，种属特异性，降解模型，骨骼样本等法医学应用进 行初步研究，以期为一些疑难案件的性别鉴定提供参考。 方法： 根据 genebank 上提供的 amelx 和 amely 的核苷酸序列 通过 blast 进行比对后，选择一段含有 3 个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, snp） 位点及 1 个插入/缺失位点的序列作为待测 靶序列。用 primer5 和 oligo6 等引物设计软件设计扩增引物和测序引物， 一条扩增引物标记生物素； 利用焦磷酸测序软件建立预期模型； 对反应体 系中的引物浓度、mg2+浓度、退火温度和循环次数等条件进行优化，选择 最佳反应条件进行 pcr 扩增， 应用焦磷酸测序技术对 pcr 产物进行测序， 中 文 摘 要 2 根据测序结果判定性别。应用该方法对 100 份已知性别（男女各 50 份） 的中国汉族健康无关个体进行测序分析，验证本方法的可靠性和准确性。 选取男女两份 dna 样本，定量后稀释为 1ng、 0.5ng、 0.25ng、0.125ng 和 0.0625ng 进行灵敏度检测；应用本方法对猴、狗、兔、猪、牛、鱼、 鸡的 dna 样本以及大肠杆菌、肠球菌、念珠菌的菌株进行分析，验证其 种属特异性； 将新鲜血液放置于 6月- 11 月的自然环境中 26 周模拟高度降 解检材，用 dnase i 制备人工降解 dna，应用本研究构建的方法及商品 化 ampf/str identifilertm试剂盒分别对其进行性别分析，比较二者的成 功率；提取骨骼样本 dna，应用本方法对骨骼 dna 进行分析。 结果： 成功构建了应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基 因进行性别鉴定的方法。本方法的扩增片段包含上下游引物在内只有 45bp， 同时包含了多个点突变和插入缺失突变。 焦磷酸测序图清晰、 直观、 容易判型。应用本方法对 100 份已知性别个体 dna 的检测分析显示，所 有样本均能得到清晰的分型结果， 与预期模型无异， 分型结果准确。 法 医应用评估： 本方法能够正确分型的最低 dna 模板量为 1ng，具有较 高的灵敏度； 在检测的所有动物及菌株中，应用本方法进行分析，除 在恒河猴检出产物峰外，其余常见动物和微生物均未检测到特异性产物 峰，具有较好的人类种属特异性； 对 8份降解 26 周的血液检材进行分 析，本方法均得到了清晰正确的分型结果，而应用 identifilertm试剂盒检 测，6 份样本分型明确，2 份样本分型失败； 对 dnase i 制备的降解 dna 进行分析，本方法对 dnase i 消化 5min、10min、15min、20min、 25min、30min、40min 的 dna 均能正确分型，测序结果非常清晰，而 identifilertm试剂盒仅能对 dnase i 消化 5min、 10min 的 dna 进行正确分 型，且牙釉质蛋白基因产物峰的相对荧光单位（rfu）较低，对消化 15min 及更长时间的 dna 均未得到产物峰，分型失败； 对 6 份来自 4 种不 同部位的骨骼进行 dna 的提取和分析，除牙齿由于取材量少导致分型失 败外，其余 5 份骨骼 dna 均得到清晰的分型结果。 结论： 本研究建立了一种应用焦磷酸测序技术检测牙釉质蛋白基因进 行性别鉴定的方法，扩增产物仅为45bp，操作简单、快捷、通量高、成本 较低；检测的靶位点包括3个点突变位点和1个插入缺失位点， 保证了良好 的准确性和稳定性；灵敏度达1ng，具有较好的人类种属特异性；对高度 中 文 摘 要 3 降解检材的检验成功率明显高于常规方法。 综上，本方法对于高度降解检 材或古dna的性别鉴定，以及大规模样本调查具有较好的应用价值。 关键词：牙釉质蛋白基因；性别鉴定；焦磷酸测序；降解检材；骨骼 dna；古dna 英 文 摘 要 4 short fragment of amelogenin gene tested by pyrosequencing for gender identification abstract objective: gender information is one of the most important information in the forensic casework and archaeological research. usually if the corpse is unbroken, forensic workers can make a determination by morphological analysis. however, in some disasters of large group, when the integrity of the human skeleton is destroyed, or bone hypoplasia as a child lead to identification by morphological analysis difficulty, using molecular biological methods to indentify gender becomes particularly important. at present, the commonly used dna techniques in gender identification include y chromosome- specific probes, zin- finger protein gene (zfy/zfx) and amelogenin gene test, among which amelogenin test is the most widely applied. since 1991 amelogenin gene had been sequenced by nakahori, nakahori (1991), akane (1991), bailey (1992), sullivan (1993) had used pcr method to amplify the single copy x - y homologous regions of amelogenin gene by different primers in sex determination. the method made by sullivan with pcr products being 106bp and 112bp, has been widely used for gender identification, which was applied by most of the forensic personal identification kits as a sex identification method. however, these existing technologies can not fully meet the needs of a number of difficult cases, and usually can not get clear typing results for highly- degraded samples or ancient dna, or can lead to invalid amplification result from amelogenin sequence mutation and sex chromosome variation. to solve these problems, this study established a new gender dna analysis methods, namely, a 45bp stretch of amelogenin gene was chosen for analysis by pyrosequencing. at the same time, a series of validation experiments, such as the sensitivity, accuracy and 英 文 摘 要 5 species specificity, degradation models, bone samples, were performed for the novel method, with a view to provide a reference for sex determination in some difficult cases. methods: the nucleotide sequences of amelx and amely were acquired from genebank. according to the blast results, a fragment including three single nucleotide polymorphism loci and an indel motif was chosen to be as the target sequence. then a pair of amplification primers and sequencing primer were designed by primer design software, such as primer5, oligo6 and so on. the downstream primer was labeled with biotin. the expected sequencing model was established by pyrosequencing software. the concentration of primer, mg2+, taq enzyme and the annealing temperature as well as the number of cycles were optimized to get the best pcr condition.then, the pcr product was sequenced by pyrosequencing. 100 randomly chosen dna samples of healthy donors of known sex (50 from males, 50 from famales) were typed to verify the reliability and accuracy of this method. two dna samples of men and women were quantified and diluted to 1ng, 0.5ng, 0.25ng, 0.125, and 0.0625ng to test the sensitivity. the method was been applied to test dna samples of monkey, dog, rabbit, pig, cow, fish, and chicken, as well as escherichia coli, enterococcus faecalis, candida albicans, to verify the species specificity. the blood was laid outside for 26 weeks from june to november to model degraded samples, and artificial degraded dna was prepared by digesting with dnase i, which were analyzed by the pyrosequencing method and commercial ampf / str identifilertm kit to compared the success rate of the two methods. in addition, 6 bone samples were analyzed using this method to identify gender. results: a method of short pcr products of amelogenin gene tested by pyrosequencing was successfully developed for gender identification. the 45- bp pcr products included primers (40bp) and target sequence (5bp) consisting of 3 point mutations and an indel mutation. the pyrosequencing graph was clear and easy to be typed. 100 dna samples of known sex were typed with the above method and all of which got clear typing graphs and 英 文 摘 要 6 correct results, indicating the method was accurate and reliable. evaluation of forensic application: the sensitivity of the method was 1ng template dna. the study of species- specificity showed that among all of the detected non- primate animals (dog, rabbit, cow, fish, pig,chicken), primate animals (monkey) and common laboratory strains (candida albicans, enterococcus , escherichia coli), no specific peak was detected in all of the species except for monkey, in which the pyrosequencing graph was different from that of humans. for the eight samples of highly degraded dna extracted from blood laied outside for 26 weeks, all of them were correctly typed by the new method, whereas only six of them were acquired results by identifilertm kit, suggesting the new method had a higher successful rate for analysis of degraded samples than the conventional gender identification method. for the artificial degraded dna digested by dnase i for 8 different times of 5min, 10min, 20min, 25min, 30min, 40min and 45min, all of them were typed correctly and clearly by the new method except 45min. however, when testing with identifilertm kit, there were lower peaks of amelogenin gene product only for the dna digested for 5min and 10min, and other degraded dna digested for longer time were failed to be typed. among the 6 bones analyzed, except that the teeth had a failure typing due to less material, the remaining five were typed clearly. conclusions: a gender identification method was constructed, which tested amelogenin gene by pyrosequencing with amplification product being only 45bp. this method was easily- operated, quick, low cost, with high- throughput, high sensitivity of 1ng dna, and human species specificity. it was also accurate and stable because of target sequence including 3 point mutations and an indel mutation. especially the new method had a higher successful rate for analysis of highly degraded samples than the conventional gender identification method. based on these advantages, this method can be recommended to identify gender of highly- degraded samples or ancient dna samples, and investigation of large scale samples. 英 文 摘 要 7 keywords: amelogenin gene; gender identification; pyrosequencing; degraded dna; bone dna; ancient dna 英 文 缩 写 8 英文缩写 abbreviation full english name chinese amel amelogenin gene 牙釉质蛋白基因 amelx amelogenin x chromosome genes x染色体牙釉质蛋白基因 amely amelogenin y chromosome genes y染色体牙釉质蛋白基因 aps adenosine 5 phosphosulfate 5 - 磷酸化硫酸腺苷 atp adenosine- triphosphate 三磷酸腺苷 ccd charge- coupled device 电荷耦合元件 dnase i deoxyribonuclease i 脱氧核糖核酸酶 i dntp deoxy- ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷 dtt dl- dithiothreitol 二硫苏糖醇 edta ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 hplc high performance liquid chromatography 高压液相层析 mtdna mitochondrial dna 线粒体 dna page polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 pcr polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 pyro pyrosequencing 焦磷酸测序 rfu relative fluorescence units 相对荧光单位 sds dodecyl sulfate,sodium salt 十二烷基硫酸钠 snp single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 str short tandem repeats 短串联重复序列 zfx zinc- finger- x gene x染色体上锌指结构基因 zfy zinc- finger- y gene y染色体上锌指结构基因 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。 本学 位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。 河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。 凡发表与学位论文主 要内容相关的论文， 第一署名单位为河北医科大学， 试验材料、 原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律 责任。 研究生签名： 导师签章： 二级学院签章： 年 月 日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果， 除了文中 特别加以标注和致谢等内容外， 文中不包含其他人己经发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名： 导师签名： 年 月 日 研 究 论 文 9 焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因 进行性别鉴定的研究 前 言 在法医学实践中，常遇到肢解尸体、高度腐败以及白骨化尸体；在大 规模灾难事故中常多人罹难，尸体外表严重毁坏，均对个人识别和性别鉴 定造成一定难度1。由于在这一类案件中，无法运用形态学的方法进行性 别的判断， 所以， 应用分子生物学的方法对来自人体的生物学检材进行性 别鉴定，对案件的侦破起到了重要作用。此外，在一些临床诊断中如胎儿 早期诊断和考古学白骨化尸体的鉴别，也都需要区分性别2。 牙釉质蛋白基因（amelogenin）,位于人类 x 染色体 p22，编码牙釉质 蛋白， 并且在y染色体中心粒附近分布与牙釉质蛋白基因的序列具有90% 的同源性的基因2。在这两段同源序列中，存在很多多态性位点，同时又 有足够长的同源序列设计引物，即用一对引物在一个 pcr 反应中同时扩 增 x、 y 染色体上的牙釉质蛋白基因， 可实现性别判定。 1991 年， nakahori 等3- 4 就已报道用牙釉质蛋白基因的一对同源引物进行性别鉴定。此外， akane5（1991） 、bailey6（1992） 、sullivan7（1993）等也先后都用 pcr 扩增单拷贝 x、y 同源区域进行性别测定。目前最常用的牙釉质蛋白基因 的检测方法就是 sullivan 法用同一对引物扩增 x、 y 同源的牙釉质蛋 白基因，引物旁侧同源区内含子 1 有 6- bp 的缺失，扩增产物 x 染色体为 106bp，y 染色体为 112bp7。然而该方法也有其局限性，当被检样品在牙 釉质蛋白基因引物结合区存在突变，或者对于性染色体变异的个体， sullivan 法检测易导致无效扩增。而且对于一些疑难案件的高度降解检材 而言，该方法的片段长度还是稍显过长以至于不能做出正确的判型。 大量 研究表明， 高度降解 dna 检材的检测成功率随pcr 扩增产物片段缩短而 增高8- 9。所以，我们拟针对解决常规分型失败的性别鉴定，建立新的检 测方法，缩小扩增产物长度，并包含更多的突变位点，分析牙釉质蛋白基 因，进行性别判定。 研 究 论 文 10 焦磷酸测序技术 （pyrosequencing） 是新近发明的一种新型 dna 测序 技术，是基于一种引物引导的多聚酶延伸下的核酸合成的检测方法10 ,特 别适用于短序列的 dna 测序分析，而且商品化的 pyromark id system 又具备同时对大量样品( 96 个) 进行测序分析的能力。本法可以在 10 分 钟内检测 96 个样本，只需设计一对扩增引物和一个测序引物即可，无需 胶检测，不需要荧光标记和同位素标记，具有操作简单、费用较低、高通 量、结果准确和自动化程度高等优点11。 本研究旨在建立一种基于焦磷酸测序技术的新型性别鉴定方法， 用于 高度降解检材的性别判定。 并将此方法应用于一些疑难检材中， 探讨其在 法医学实际工作中的应用价值。 研 究 论 文 11 第一部分 新型短序列性别鉴定方法的建立 本部分研究根据 genbank 中 amelx 和 amely 的核苷酸序列，设 计合适的同源扩增引物及测序引物，使其扩增产物在 50bp 以内，扩增片 段包含多个点突变及一个插入缺失突变，摸索并优化扩增条件及测序条 件。 应用焦磷酸测序方法进行测序分析，建立一种新型的短序列性别鉴定 方法。 材料与方法 1 材料 1.1 主要仪器 - 80mdf- 382e型超低温冰箱 日本 sanyo 公司 微量移液器 法国 gilson 公司 mickocl 2ir 冷冻离心机 德国 thermo 公司 3k 18 型低温超速离心机 美国 sigma 公司 tda- 8002 型电热恒温水浴箱 天津市泰斯特仪器有限公司 mls- 3020 型高压消毒锅 日本 sanyo 公司 xw- 80a 旋涡混合器 上海医科大学仪器厂 79- 1 磁力加热搅拌器 上海浦东物理光学仪厂 dyy- 水平电泳槽 北京六一仪器厂 dycz- 24a 型电泳槽 北京六一仪器厂 uv 型紫外分析仪 美国 dna- imaging systems 公司 凝胶成像系统 美国 dna- imaging systems 公司 nd_1000微量核酸蛋白检测仪 美国基因公司 milli- q synthesis 超纯水仪 美国密理博公司 thermo pcr 仪 美国热电公司 ptc- 200 pcr 扩增仪 美国 mj 公司 sevev easy ph 计 德国梅特勒- 托利仪器有限公司 研 究 论 文 12 pyro mark id 焦磷酸测序仪 美国基因公司 thermomixer comfort 混合器 美国 ab 公司 1.2 主要试剂 血液基因组 dna 提取试剂盒 tiangen 生化科技有限公司 chelex- 100 美国 sigma 公司 pcr 扩增引物 上海生物工程技术有限公司 dntp 上海生物工程技术有限公司 10pcr 反应缓冲液 上海生物工程技术有限公司 mgcl2 上海生物工程技术有限公司 taqdna 聚合酶 上海生物工程技术有限公司 硝酸银分析纯 北京益利精细化学品有限公司 dna marker 大连宝生物公司 eb 显色液 10mg/ml 北京天为时代生物公司 琼脂糖 美国 sigma 公司 乙醇 天津永大试剂化学公司 naoh 天津科密欧公司 pyrogold kit 美国基因公司 beads 美国基因公司 binding buffer 美国基因公司 washing buffer 美国基因公司 annealing buffer 美国基因公司 denaturation buffer 美国基因公司 1.3 主要试剂的制备 1.3.1 5% chelex- 100 储备液（室温保存） 试剂名称 加入量 chelex- 100 颗粒 5g 灭菌去离子水 100ml 1m naoh 调节 ph 值至 9- 11 研 究 论 文 13 1.3.2 5tbe 试剂名称 加入量 tris- 碱 27.5g 硼酸 13.75g 0.5m edta（ph 8.0） 10ml 双蒸水 至 500ml 1.3.3 30% ap（19:1） 试剂名称 加入量 丙烯酰胺 28.57 g 双叉丙烯酰胺 1.5g 双蒸水 至 100 ml 1.3.4 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶（30ml） 试剂名称 加入量 30% ap 10ml 5tbe 3ml 10%aps 350l temed 16l 尿素 7.2g 双蒸水 至 30ml 1.3.5 2变性上样 buffer 试剂名称 加入量 1m naoh 100 l 95%甲酰胺 9.5 ml 溴酚蓝 5 mg 二甲苯兰 5 mg 双蒸水 至 10ml 研 究 论 文 14 1.3.6 银染显色液 试剂名称 加入量 naoh 20g naco3 0.4g 双蒸水 至 1000 ml 1.3.7 0.5m edta（ph 8.0） 试剂名称 加入量 edta 18.6g naoh 2g 双蒸水 至 100 ml 1.3.8 denaturation buffer 试剂名称 加入量 naoh 4.0g 超纯水 500 ml 1.3.9 10washing buffer（ph7.6） 试剂名称 加入量 tris- 碱 0.302g 4m 乙酸 500l 超纯水 至 250ml 1.4 样本来源 100 份中国汉族无关健康个体血液样本 （包括新鲜抗凝血和fta 卡血 痕样本） ，其中男性样本和女性样本各 50 份。 2 实验方法 2.1 血液样本 dna 的提取 2.1.1 全血基因组 dna 提取试剂盒提取： 1) 取 200 l抗凝血放入 1.5ml eppendorf 管中， 加入 20 l蛋白酶 k 溶液， 混匀，加入 200 l缓冲液 gb 充分颠倒混匀，56水浴 10min，其间颠 倒混匀数次，溶液变清亮； 2) 加入 200 l无水乙醇，充分颠倒混匀， 将 eppendorf 管中所有溶液都加 入一个吸附柱中，将吸附柱放入收集管中，12000rpm 离心 30s，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中； 研 究 论 文 15 3) 向吸附柱中加入 500 l缓冲液 gd， 12000rpm 离心 30s， 倒掉收集管中 的废液，将吸附柱放回收集管中； 4) 向吸附柱中加入 700 l漂洗液 pw， 12000rpm 离心 30s， 倒掉收集管中 的废液，将吸附柱放回收集管中； 5) 向吸附柱中加入 500 l漂洗液 pw， 12000rpm 离心 30s， 倒掉收集管中 的废液，将吸附柱放回收集管中，12000rpm 离心 2min，倒掉废液， 将吸附柱室温放置 4min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，将吸附 柱转入一个干净的离心管中； 6) 向吸附膜中间位置悬空滴加 100 l 洗脱液 tb，室温放置 4min， 12000rpm 离心 2min，将溶液收集到离心管中，即为基因组 dna，- 80 保存； 2.1.2 fta 卡血痕样本 dna 的提取 1) 将 fta 卡上血痕剪下 33mm 大小，放入 500l 无菌蒸馏水中室温 浸泡 20min，其间震荡数次，12000rpm离心 30s，弃上清； 2) 加入 100l 5% chelex- 100 的悬浮液悬浮细胞核， 56保温 30min， 震 荡 10s； 3) 100煮沸 8min，震荡 10s，12000rpm离心 1min，除去与金属离子结 合的 chelex- 100 颗粒和其他非 dna 成分， 取含有 dna 的上清液直接 进行 pcr 或于- 20保存备用； 2.2 测序位置 在 genbank 上寻找包含 amelx 和 amely 的两段序列。x 染色体 上 amelx的 genbank号为 ng_012040， y染色体上 amely的 genbank 号为 ng_008011。 将两段序列在blast上进行比对，寻找包含多态性位点的同源区。确定 该段序列需要满足的条件： 小于50bp， 有足够长的同源序列设计引物， 即上下游同源区大于18bp， 多个点突变和插入缺失位点共同存在， 适 合设计pcr扩增引物及测序引物。最后选定的序列及其突变位点为： x： attgaatcccaagtaatcg ggt - gcctatcattggctattctagtc y： attgaatcccaagtaatctgacgactatcattggctattctagtc 2.3 引物 扩增引物用引物设计软件 primer5 设计，后用 oligo6进行评分，选出 研 究 论 文 16 最优引物对 （fig1） 。 测序引物用pyrosequencingtm实验引物设计软件assay design 设计，综合扩增引物，选取评分最高的测序引物。其中下游引物标 记生物素。 引物序列 上游引物 attgaatcccaagtaatc 扩增引物 下游引物 gactagaatagccaatgat 测序引物 attgaatcccaagtaatc 2.4 pcr 扩增 借鉴焦磷酸测序仪推荐的 pcr 循环参数，对本体系中以下关键组分 和环节进行调整、优化和完善。 mg2+浓度优化：设置 mg2+终浓度梯度(1.0， 1.5， 2.0， 2.5， 3.0mmol/l) 进行试验。 引物浓度优化：设置引物终浓度梯度(0.1，0.2，0.3 mol/l)进行试验。 taqdna 聚合酶用量：taqdna 聚合酶(1u/l)，依次进行 0.5，1.0， 1.5，2.0u 梯度试验，确定最佳用量。 退火温度优化：设置退火温度梯度(45，47，48，50，52， 54)进行试验。 pcr 循环次数优化：在以上确定的最佳退火温度、模板浓度、mg2+ 浓度、引物浓度以及酶的用量条件下，设置pcr 循环次数梯度(40，45， 50 次)进行试验。 2.4.1 反应体系为 40 l，pcr 反应液各组份如下 总体系 40 l 10pcr buffer 4.0 l mg2+, 25mmol/l 1.5mmol/l dntp 0.2mol/l primer 0.2mol/l taq dna 聚合酶（1u/ l） 2.0 l 模板 dna 2.0 l 去离子水 28 l 研 究 论 文 17 2.4.2 反应循环程序 步骤 温度 时间 循环数 1 95 5min 1 95 15s 50 30s 2 72 15s 45 3 72 5min 1 4 8 1 2.5 焦磷酸测序 2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在进行焦磷酸反应之前， 需要用凝胶电泳进行简单验证。 通常情况下， 只需要进行琼脂糖凝胶电泳即可，但是本实验的pcr产物只有45bp，用琼 脂糖凝胶电泳不能得到较清晰的条带。 故本实验在测序之前大部分选择用 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。 1) 将制备好的 10变性聚丙烯酰胺凝胶安装于垂直电泳槽，冲孔，预电 泳 20min； 2) 取扩增产物 5l与上样缓冲液 5l混合后上样于 10变性聚丙烯酰胺 凝胶中电泳， 另加4l 20- 500bp长度范围的marker作为片段标准对照； 3) 凝胶缓冲液与电泳缓冲液浓度均为0.5tbe， 恒电压200v， 电泳2.5h； 4) 银染显色12，将凝胶剥下，双蒸水冲洗 15s； 5) 加染色液 0.1%的硝酸银溶液，摇床轻摇 5- 6min，双蒸水冲洗两次 ， 15s/次； 6) 加少量显色液，轻摇 15s，弃去反应液，加入 200ml 显色液（400l 甲醛/100ml显色液） ，轻摇约 10min，即可显带进行判型。 如果电泳结果得到较清晰的目的条带， 且非特异性条带较少不影响测 序，即可进行焦磷酸测序反应。 2.5.2 焦磷酸反应 2.5.2.1 dispensation order 在进行测序之前，需要先获得 dispensation order。打开 pyromark id 软件，点击 simplex entries，将引物设计软件中所保存的本实验的引物目 录引入，程序即可自动生成一个 dispensation order 和预期的 pyrogram。 研 究 论 文 18 然后根据本实验的需要简单调 整后所得 dispensation order 为 ： ctgatctgac。 2.5.2.2 单链分离纯化 首先取扩增产物30l， 加入33 l洗涤结合缓冲液 （binding buffer） 和2l 含有偶链亲和素(avidin)的磁珠 （beads） ， 在常温下孵育20分钟， 使得beads 与生物素结合。 被固定在磁珠上的pcr产物分别在180ml的70%酒精洗涤5 秒、120ml的变性缓冲液（0.2 mol/l naoh）（denaturation buffer）中变 性15秒，180ml 1洗涤液(10 mm tris- acetate) （washing buffer）中洗涤 15秒，使之变成单链。把单链dna模板转入29 l含1.5 l测序引物 （10 mol/l）的复性缓冲液（annealing buffer）中， 80杂交3 min，冷 却至室温，即可进行焦磷酸测序反应。 2.5.2.3 焦磷酸反应 打开 pyromark id 软件，点击 snp 主菜单区下的 snp runs，点击鼠 标右键选择 new snp run，输入 run name 等反应的信息，选择反应孔。 随后切换到设宴设计界面，选择合适的 entry，输入样本信息等。在 view 菜单中点击 run，即可显示本次实验要用到的酶混合物、底物混合物和各 种 dntps 的具体用量。 将酶混合物，包括dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺 苷双磷酸酶，以及底物混合物aps和荧光素溶于650 l 无核酶水中。将酶 混合物、底物混合物各3.6 l与1.8l annealing buffer的混合物加入反应孔 中，且将四类核苷酸(a、t、c、g)按照系统显示的量分别加入试剂舱固 定位置，在软件界面点击运行键run即可进行测序。 2.6 方法的准确性测试 用上述建立的方法对100份已知性别的健康无关个体样本（男女各50 份） ，进行测序分析，验证该方法的准确性。 结 果 1 测序结果 本实验理论上所得到的扩增产物amelx为44bp，amely为45bp。 pcr扩增后，将产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，实际扩增产物长度与理论 研 究 论 文 19 长度相符 （fig.1- 2） 。 测序结果， amelx的特异序列为： ggtgc， amely 的特异序列为： tgacga； 二者的差异为： 3个点突变位点g/t， t/a， c/a，和一个插入缺失位点/c。因此，女性（xx）的测序结果为： g/g、t/t、 /、c/c（fig.1- 3a），男性（xy）的测序结果为：g/t、 t/a、/c、c/a（fig.1- 3b），与预期模型（fig.1- 4）一致。 2 准确性测试结果 用本实验所设计的方法，对 100 份已知性别 dna 样本进行测序，均 得到正确的分型，分型成功率为 100%。 研 究 论 文 20 附 图 fig.1- 1 the score of primer design by oligo 6 研 究 论 文 21 fig.1- 2 the page results of pcr product 研 究 论 文 22 a b c