常用DNA酶的总结.doc

1. T4DNA连接酶:本酶催化相邻DNA链的5-P末端和3-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，（将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键），需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。T4DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA5-磷酸末端和3-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。粘末端的连接反应:插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段DNA浓度及分子大小来计算。平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的25倍左右。与粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果。(0.05-0.1gul以上)。反应温度：该酶的最适温度为37，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16下进行。若反应1-2小时左右的话也可在室温下进行反应。抑制剂：T4DNA连接酶要求Mg2+，因此螯合Mg2+的EDTA的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。2. T4 DNA聚合酶： T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以依赖于DNA模板对5 端突出末端进行补平；同时可对3 端突出末端进行削平。也可以在结合有引物的单链DNA模板上，从53方向催化DNA合成反应。特点：T4DNAPolymerase由于同时具有53 DNA聚合酶活性和35 DNA外切酶活性（但不具有53外切酶活性），可以用于将5端突出末端补平、3端突出末端削平。T4DNAPolymerase的35 外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。用途：T4DNAPolymerase可用于催化以下反应：DNA5 或3 突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记DNA探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆。活性定义：37 30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。反应方法：例如，酶切完成后，没有进行任何处理，直接加入一点T4 DNA聚合酶、dNTP和BSA，37C 10min。失活或抑制：70加热10分钟可使T4 DNAPolymerase失活。金属离子螯合剂可以抑制T4DNAPolymerase的活性。一般的Klenow Fragment和T4 DNA Polymerase都有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，因此都可以用于补平和削平。所不同的是，T4 DNA Polymerase的活性更强。3. Klenow Fragment：又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片断(Large Fragment)。Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的53聚合酶活性和35外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的53外切酶活性。特点：对5 突出或3 突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。用途：双链DNA 5 端突出(5overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA 3 端突出(3overhang)的削平；5突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。 来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA 基因片段。Fermentas公司的Klenow Fragment有2种。一种是DNA Polymerase I Large Fragment (Klenow Fragment)，该酶用于补平的时候不会在补平后再多加碱基。另一种是DNA Polymerase I Large Fragment, Exonuclease MinusKlenow Fragment exo-，此酶没有3-5外切酶活性，因此不能用于削平；而且，此酶在补平的时候会在补平后再加一个或更多碱基，所以不太适合用于补平。4. T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）:T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK，该酶能够催化磷酸在g-位和双链/单链DNA或RNA的5-羟基末端以及3-单磷酸核苷间进行转移和交换：5-OH +NTP5-P+NDP。该酶还具有3磷酸酶活性，将3-磷酸基团从寡核苷酸的3磷酸末端、脱氧3-单磷酸核苷和脱氧3-二磷酸核苷上水解掉。用途：引物或PCR产物的5末端磷酸化以便进行连接反应。合成DNA接头(Linker) 的5末端磷酸化以便进行连接反应。DNA及RNA 5末端的标记，用作寡核苷酸探针。5. DNA聚合酶1:1.能催化单个脱氧核糖核苷酸连接到DNA链的3端.2.能沿5端到3端方向外切DNA(切除引物)3.能沿3端到5端方向外切DNA(纠错,或者说DNA损伤的恢复)6. DNA聚合酶2:1.发挥作用需要镁离子和铵根离子存在2.同样能参与DNA聚合酶1参与的反应,但聚合活性低3.能沿3端到5端方向外切DNA7. DNA聚合酶3:1.主要负责DNA链的延伸2.能沿3端到5端方向外切DNA在DNA的复制中,DNA聚合酶3负责合成冈崎片段,而DNA聚合酶1负责将RNA引物按逐个核糖核苷酸切除并替换成对应的脱氧核糖核苷酸,最后由DNA连接酶把各冈崎片段连接起来,复制完成.活性(37度时每个酶分子每分钟聚合的核苷酸数)：DNA聚合酶1为600，DNA聚合酶2为30，DNA聚合酶3为9000。8. DNA水解酶与DNA限制性内切酶的区别概述DNA水解酶：催化DNA水解的一种酶，在DNA水解酶作用下，DNA被水解为一个一个的脱氧核苷酸。任何能水解DNA的酶的统称，见到二酯键就切。限制性内切酶：能切割DNA分子内部的可识别序列的磷酸二酯键，见到识别序列的两侧的磷酸二酯键就切。9. DNA聚合酶和DNA连接酶的区别?DNA连接酶：是一种将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶。常用于基因工程，将目的基因连在载体(一般为质粒)上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键。DNA聚合酶：以已有的核酸序列作为模板，将4种脱氧核苷酸(A、T、G、C)按照模板的碱基排列顺序，以“碱基互补原则”依次连接，聚合成为一条新的DNA链。相同点都是连接的磷酸二酯键。10. DNA水解酶在哪里有作用,作用是水解DNA双链吗?DNA水解酶的作用位点在于磷酸二酯键