（食品科学专业论文）高纯度γ氨基丁酸的制备及脱色工艺研究.pdf

摘要 摘要 本论文研究了乳酸菌s k 0 0 5 发酵生产g a b a 中试工艺，并在此基础上对浓缩液的 脱色工艺进行了探讨。具体研究内容包括：纸色谱萃取分光光度法检测g a b a ：3 0 0 0l 发酵规模工艺论证；g a b a 浓缩液脱色工艺探讨及高纯度g a b a 的制备。 采用纸色谱萃取分光光度法和h p l c 法测定了发酵液中g a b a 含量，结果显示两 种测定方法获得的g a b a 含量基本一致，因而纸色谱萃取分光光度法可替代h p l c 法 测定发酵液中g a b a 。与h p l c 法相比，纸色谱萃取分光光度法检测成本低，适用于大 量g a b a 样品的测定。 论证了3 0 0 0l 发酵规模生产g a b a 及其提取工艺的可行性，总提取率为7 9 7 4 8 ， 成品中g a b a 含量为4 6 1 7 ( 占总固形物含量) ，该结果基本达到了3 0 0l 发酵规模的 生产水平。对g a b a 浓缩液的主要成分分析发现，色素是影响产品纯度的主要杂质， 对色素的定性实验显示其主要为焦糖色素，该色素对光和p h 值的变化都具有一定的耐 性，对温度有一定的敏感性。 n k a 一9 大孔吸附树脂是一种高效、选择性吸附脱色树脂，其吸附脱色过程为吸热过 程，主要表现为物理吸附，反应温度的升高有利于脱色的进行，但是当温度达到3 3 3k 时吸附效率不再提高。考察并确定了最佳固定床操作条件：p h 值为5o ，上柱流速为o 3 0 m h ，上柱温度为3 3 3k ，上柱浓度a 4 4 0 为o 9 4 l ，即浓缩液中总固形物含量为1 时色 素浓度。碱性乙醇再生剂结合了酸碱再生剂和乙醇再生剂的优点，具有良好的再生效果。 阴离子交换树脂是一类比较理想的脱色剂。色素在6 种阴离子交换树脂上的平衡吸 附数据符合f r e u n d l i c h 等温方程，大孔强碱性阴离子交换树脂d 2 0 1 是一种优良的色素 吸附剂。当温度低于3 1 3k 时，色素在d 2 0 1 树脂上的吸附传质过程主要受液膜扩散和 颗粒内扩散共同影响控制。交换动力学研究表明，适当温度升高( t 3 1 3k ) 有利于离 子交换反应的进行。离子交换脱色的最佳操作条件：p h 值为1 0 o ，上柱流速为o 3 0m m ， 上柱温度为3 1 3k ，上柱浓度a a o 为o9 4 1 ，即浓缩液中总固形物含量为1 时色素浓度。 复床式脱色工艺结合了大孔吸附树脂对色素和蛋白的高效选择吸附以及大孔强碱 性阴离子交换树脂对色素和盐高效吸附裂解的优点。采用将待脱色g a b a 浓缩液首先 经过n k a 一9 大孔吸附树脂，再通过d 2 0 1 大孔强碱性阴离子交换树脂的工艺，d 2 0 1 树 脂的交换量达到2 7 倍柱体积，产品的纯度达到9 0 8 ，具有很大的经济性。 关键词y 一氨基丁酸纸色谱萃取分光光度法脱色大孔吸附树脂阴离子交换树脂 a b s t r a c t g 锄a - a r n i n o b u t y “ca c i d ( g a b a ) p m d u c e db yl a c t o b a c i l i u ss k 0 0 5i nap i l o ts c a l e 3 0 0 0lb i o r e a c t o ra n dd e c o l o 肠n gt e c h n i q u eo fg a b aw e r es t u d i e di nt 1 1 i sp a p e l1 1 1 e p u 印o s ei st of i n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o nt op r o d u c eg a b aw i t hh i g hp u r i t yi nl a r g es c a l e t h ed e t e m i n a t i o no fg a b ab yp a p e rc h r o m a t o g r a me x t r a c t i o ns p e c t r o m e t r yw a sa l s o s n l d i e d d e t e m l i n a t i o no ft h eg a b ai nf e r m e n tb r o t hb yh p l c ( h i 曲p e r f o m a l l c el i q u i d c 1 1 r o m a t o g r a p h y ) a 1 1 dt h ep a p e rc l r o m a t o g r 印h ye x t r a c t i o ns p e c t r o m e t r ym e t h o ds h o 、v e dt 1 1 a t m et 、v om e t h o d sm a d es l i 曲td i f k r e n c e ，s u g g e s t i n gs p e c t r o m e t r i cm e t h o dc a nr e p l a c eh p l c m e t l l o di ng a b aa s s a y a p p l i c a t i o n so ft h es p e c t r o m e t r i cm e t h o di ng a b as e p a r a t i o na i l d p u r i n c a t i o np m v e dt l l a tt h em e t h o dw a sr a p i d ，r e l i a b l ea n de f f 毫c t i v e i n v e s t i g a t i o no nt h ep r o d u c t i o no fg a b ab yl a c t o b a c i l l u ss k 0 0 5i nap i l o ts c “e3 0 0 0l b i o r e a c t o rs h o w e dt h a tt h em e t h o dw a sf 色a s i b l ea n dr e l i a b l e t h et o t a lr e c o v e r vr a t i ow a s 7 9 7 4 8 a n dt 1 1 ef i n a lp u r i t yo fg a b aw a s4 61 7 a r o u n dt 1 1 ew h o l et e c h n j q u e t h ec o l o r a n t c o n t e n to f e n r i c h e dg a b aw a sr e g a r d e da sk e yi n d e x e so f p u r i t yc a r 栅e li sm em a ms p e c i e s i nc o l o r a n t so fe n r i c h e dg a b a t h ec o l o r a n tc o n t e n tw a sn o ts e n s i t i v et om es o l a ra 1 1 dp h ， h o w e v e ri tw a ss e n s i t i v et ot h ed i f i 、e r e n c ei nt e m d e r a t u r e t h et h e m l o d y n a m i c so fa d s o r p t i o na 芏1 dd e c o l o m t i o nf o re n r i c h e dg a b ab yl l s i n g n k a 9a d s o r b e n tr e s i nw e r es t u d i e dt h er e s u l t ss h o w e dt 1 1 a tt h ea d s o r d t i o nd a t ao fn k a 一9 a d s o r b e n tr e s i nf i t t e dw i t hf r e u n d l i c hm o d e l s t h ec h a n g e so fa d s o r p t i o ne n t h a l p yv a l u e ( h ) i n d i c a t e dt 1 1 ee n d o t h e r i n i cr e a c t i o nw a ss p o n t a n e o u sa n dn a t u r eo ft 1 1 ep r o c e s s t h ea d s o r p t i o n a b i l i t yw a si m p r o v e dw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e ，b u tt h es u i t a b l et e m p e r a t u r ew a s3 3 3k f o r 血ee q u i l i b r i u mo fa d s o r p t i o ne m c i e n c yb e t w e e n3 3 3ka n d3 5 3k t h eo p t i m u mo p e r a t i o n c o n d i t i o n sw e r c ：p h5 o ，m ea d s o r p t i o nv e l o c i t yo fn o wo _ 3 0m m ，t h eo p e r a t i o nt c 【n p e r a t i l r e 3 3 3 ka i l dt 1 1 ei n l e tc o n c e m r a t i o n 4 00 9 4 1 e t h a n o li na l k a l i n ec o n d i t i o nw a st h ce m c i e n t r e g e n e m t i o n t h ea d s o r p t i o na n dd e c o l o r a t i o no fm a c r o p o r o u sa n i o ne x c h a l l g er e s i i l sw e r es t u d i e d t h es i xa n i o na d s o r b e n t sw e r ec o r r e l a t e dw i t hf r e u n d l i c hm o d e l so fi s o t l l e h ne a u a t i o na i l d m eb e s ta d s o r b e n tw a ss e l e c t e d t h ek i n e t i cp r o c e s so fa d s o r p t i o na 1 1 dd e c 0 1 0 r a t i o nb yd 2 0 1 w a sa n a l v z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t ht h ee x t e m a ld i f f u s i o na 1 1 dt 1 1 ep a r t i c l ed i f f l l s i o n w e r et l er a t e - c o n t r o l l i n gs t e p t h eo p t i m u r no p e r a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ： p hl o 0 ，l e a d s o r p t i o nv e l o c i t y o ff l o wo 3 0m h ，t h eo p e r a t i o nt e m p e r a t u r e3 1 3 ka 1 1 dt h ei 1 1 l e t c o n c e n t r a t i o na 4 4 0o 9 4 1 t h ec o m b i n ed e c o l o r a t i o nt e c l l l l i a u ew a ss t u d i e db a s e do nt h ea d s o r b e n td e c o l o r a t i o n a n di o n e x c h a n ed e c o l o r a t i o n t h ee n r i c h e dg a b aw a sd e c o l o r i z e db vt h en k a 一9 a d s o r b e n tf i r s t l ya n dt l e nd e c o l o r i z e db yt h ed 2 01a n i o ne x c h a 工l g er e s i n i tw a sp r o v e dt l l a t t h ec o m b i n ed e c o l o r a t i o nt e c h n i q u eh a sg o o dp r o p e n i e so f r e d u c i n gp r o t e i nc o n t e ma n d d e c 0 1 0 r i z i n ge f f b c t t h ef i n a lp u r i t vo fg a b a w a s9 08 k e y w o r d s ：g a b a ，p a p e rc h r o m a t o g r a p h ye x t m c t i o ns p e c t r o m e t 阱d e c 0 1 0 r a t i o n ， m a c r o p o r o u sa d s o r b e n tr e s i n ，m a c r o p o r o u sa n i o ne x c h a n 2 er e s i n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 馘：墨垫日期：赫乡月肋 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：五钆导师签名：至三堡 日期：c ) 6 年占月钿 第一章绪论 第一章绪论 1 1y 氨基丁酸概述 1 1 1y 一氨基丁酸的理化性质 名称：y 氨基丁酸( y a m j n o b u t v r i ca c i d ，g a b a ) 别称：y 一氨酪酸 结构： 一 u | | h 2 n - ，t n w 相对分子质量：1 0 3 1 2 ； c a s ：5 6 1 2 2 ： 解离常数：p k ( 一c o o h ) = 40 3 ，p k ( 一n h 3 + ) = 1 05 6 ； 形状及呈味性：白色片状或针状结晶，微臭； 溶解性：极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、乙醚和苯； 熔点：2 0 2 ： 毒理性：l d 5 0 ( 大鼠，腹腔) = 5 4 0 0m k 。 1 1 2y 氨基丁酸的生物活性及其生理功能 v 氨基丁酸是一种广泛分布于动植物体内的非蛋白氨基酸。非蛋白组成氨基酸常以 游离态或结合小肽的形式( 不超过1o 个氨基酸残基) 存在于生物体内，由于该类氨基 酸具有独特的化学结构，因此常常表现出特殊的生物功效和药用价值，除y 氨基丁酸外， 类似的氨基酸还有牛磺酸、左旋多巴等【2 j 。 g a b a 是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性传递物质，介导了4 0 以上的抑 制性神经传导，哺乳动物脑内有3 0 的神经元突触以g a b a 为神经递质肼】。随着研究 的进一步深入，发现g a b a 主要通过与其a 、b 、c 三种特异性受体相互作用，发挥出 重要的生理活性【乱。研究表明，人类的多种神经和精神疾病( 如癫痫、焦虑、抑郁、疼 痛和老年痴呆等) 均与大脑中g a b a 的异常及相关受体的功能障碍有关。适量补充 g a b a 可以促进大脑中膜蛋白的整合、g a b a 受体和一些与神经相关的蛋白和酶的合 成，从而增强脑组织的新陈代谢，促使脑细胞活动旺盛，恢复脑细胞功能，改善老年人 的感觉功能以延缓衰老，同时对神经也具有营养作用【4 6 。 临床医学认为，g a b a 对哺乳动物心血管系统有重要的调节作用7 1 。1 砒( a h a s h i 等 首次报道了g a b a 对心血管系统的作用，并通过动物实验中证明了g a b a 对血压与心 率的调节作用是中枢性的。a j l ( o u a c c i o 等【8 1 首次论证了g a b a 对血压和心率的中枢性交 感抑制机制。我国学者孙妙坤【9 】用电离子透入法揭示了动脉压力反射在交感神经元上的 抑制性递质是g a b a ，从而揭开了心血管活动中枢调节之谜。在g a b a 食品的临床应 用中，g a b a 降低血压功效已经得到了确认。2 0 0 2 年，k a z m i 等报道了g a b a 复合 江南大学硕士学位论文 风味调料对轻度高血压和高血压患者的血压具有改善作用，经过2 周实验，试验组的血 压显著降低，同时并未观察到任何生理毒副作用。 医学研究表明，作为三羧酸循环的旁支，g a b a 能抑制谷氨酸的脱羧反应，与 酮戊二酸反应生成谷氨酸，有效降低血氨，它还能促使更多的谷氨酸与氨结合生成尿素 排出体外，从而解除氨毒，改善人体肝肾机能。 已报道g a b a 在医药方面的用途还包括：促进人类自身的生长激素的分泌、改善 睡眠障碍、促进酒精代谢、治疗c o 中毒和消臭等1 2 】。 1 1 3y 一氨基丁酸的自然分布、合成代谢与制备 g a b a 在自然界分布非常广泛，在许多动植物组织中都有一定含量【1 3 】。天然存在的 g a b a 含量都比较低，植物组织中g a b a 含量通常在o 3 3 2 5 岫1 0 l 儋之间，研究表明， g a b a 的积累是植物体对外界条件激烈变化时应激反应的产物，g a d 的激活和g a b a 转氨酶的钝化可以促进g a b a 的积累。在动物体内，g a b a 主要分布于神经组织中， 在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，含量是单胺类含量的1 0 0 0 倍，而在外围器官中 含量很少i l ，因而直接从动植物体内提取g a b a 并作为食品配料的可行性不大。 作为一种化学物质，早在1 8 8 3 年人类就开始尝试人工合成g a b a ，并取得成功。 g a b a 合成的主要途径是谷氨酸经过g a d 催化的脱羧反应，在一些情况下，g a b a 也 可由鸟氨酸和丁二氨转化而来，但这些物质都是由谷氨酸生成的，所以说谷氨酸是 g a b a 的唯一来源【1 5 。 在细菌和哺乳动物大脑中，g a b a 首先在g a b a 转氨酶的催化下，和a 一酮戊二酸 发生转氨作用形成琥珀酸半醛( s s a ) 和谷氨酸，然后s s a 在琥珀酸半醛脱氢酶氧化形 成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和g a d 催化的谷氨酸脱羧反应一起，构成了n 酮 戊二酸氧化成琥珀酸的另一条支路，即g a b a 支路 1 ”，类似的支路在高等植物中也有 发现。g a b a 代谢途径如图l l 。 琥1 7 酸三谈酸循环 l 二靛“扑 图1 1 g a b a 代谢途径 第一章绪论 g a b a 天然存在含量低，因此很难从一些天然组织中大量提取分离，目前主要的获 取方法有化学合成法和生物合成法两种。 化学合成法反应条件剧烈，主要是通过v 氯丁氰的取代水解反应实现，将邻苯二甲 酰亚氨钾与y 氯丁氰在1 8 0 反应，然后将产物与浓硫酸回流，再结晶提纯而得。另外 还有一些化学合成方法，多见于专利文献的报道，成本较高，得率较低，并且在生产工 艺中使用危险溶剂，甚至是强腐蚀、有毒溶剂 】，其产品主要应用于生化研究。总的 来说，采用化学合成法制备g a b a 很难在食品工厂实现，其制品也不能被认为是一种 天然食品添加剂。 生物合成法主要采用生物材料中的g a d 转化谷氨酸生产g a b a 。g a b a 合成及代 谢途径的研究为生物合成g a b a 的研究提供了铺垫。与化学法相比，生物合成法具有 条件温和、安全和成本较低的优点。在早期的研究中，发酵法生产g a b a 一般以大肠 杆菌为生产菌，发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨和矿物质等。在发酵过程中， 利用大肠杆菌产生的脱羧酶作用，将l 谷氨酸转化为g a b a ，然后分离纯化得到产品 1 8 】，但是绿色食品的生产，直接使用大肠杆菌是不允许的，生产上安全性存在隐患问 题。近期国内外一些学者正在通过基因改良微生物的方法进行g a b a 合成的研究，虽 然此途径可大幅度提高目标产物产量，但基因改良微生物在食品安全和遗传稳定性方面 存在不确定因素，至今在学术界仍存在争议，目前尚未见报道基因改良的微生物用于 g a b a 的生产。 乳酸菌、酵母菌、曲霉菌【l o ”j 等一些安全性高的微生物在g a b a 类食品的制备中已 有应用，部分已经实现产业化。 1 1 4 乳酸菌生物合成y 一氨基丁酸 乳酸菌是公认的安全微生物，在食品工业中( 如发酵乳、肉制品、泡菜、面包和酒 类生产等) 应用十分广泛并有着悠久的历史。在对乳酸菌的使用的过程中发现，耐酸生 长是其一大特点，而且耐酸机制多种多样。根据最新的一些研究报道，天然乳酸菌的耐 酸生长机制可能与它们含有的g a d 活力有关1 2 。”j ，这启示我们可以利用它们生物合成 g a b a 【2 4 ，2 5 】。从1 9 9 6 年至今，国外已有一些报道利用微生物生产g a b a ，并将其应用 于食品的生产，但是在国内尚未见相关报道，有待深入的开展研究。本实验室自许建军 博士开始，研究利用乳酸菌生物合成g a b a ，通过筛选优良高产的安全菌种，以及培养 条件的优化确定，g a b a 的合成水平达到252 l 发酵液，之后经过几代研究者的辛勤 努力，最新的3 0 0l 中试生产g a b a 研究表明，乳酸菌s k 0 0 5 生物合成g a b a 成本低 廉、质量稳定，这在国内g a b a 的生物合成领域处于领先水平，在国际上也达到先进 水平。表1 1 总结了目前国内外利用生物技术制备g a b a 的研究。 江南大学顶：i 学位论文 ec 0 k l d c t o b d c i l l t eb r e v 趣 i f 0 1 2 0 0 5 埘0 月c m p i ，ml f 0 4 5 2 0 三日c f 0 6 口c i 朋坩f r o mk i m c h i 触弘胁i k - 3 ) l 口c t o b d c i l t m sd t d n f n r m n m 1 0 未报道 胁”c 甜p “p 舢坩c c r c 3 1 6 1 5 米胚芽中提取 转基因稻米 乳酸菌s k 0 0 5 乳酸菌s ( 0 0 5 乳酸菌s y f c 0 2 乳酸菌s k 0 0 5 余敦寿，崔俊鑫阢2 7 】 y 0 k u y a l n as 等【2 4 】 k o n ol ，h i m e n ok 【2 8 】 掘江典子等( 日本p h a r m a f o o d s ) 爱宕世高，户田登志也， 奥平武则f 2 9 】 【3 0 】 s u y c ，w a n gj j ，l i n t t 等 ( 台湾) 川 山口化研株式会社 黄大年等( 中国水稻研究 所，杭州) 许建军( 江南大学，无锡) 钟环宇( 江南大学，无锡) 刘清等( 江南大学，无锡) 崔晓俊( 江南大学，无锡) 工艺研究 一 日本烧酒k a s u 1 0 5 叽 食品k o i i 制作 p h a r m a - g a b a s u d e 卜g a b a ( f u j i c c o 株式会社) o r y z a g a b a ( 0 r a z y 株式会社) 固态发酵 g a b a 纯品 高产y 氨基丁酸大米 ( 中国浙江) 液态发酵 液态发酵 液态发酵 g a b a 纯品 1 2 0p g 幢干基 2 0 1 21 r 氨基丁酸的脱色工艺 本课题组在生物合成g a b a 的工艺中，考虑到生产成本因素，以玉米浆、大豆粕 等农副产品为主要生产原料。这些原料本身成份非常复杂且含有大量有色物质，与此同 时，g a b a 的生产过程中采用了高温灭菌、真空浓缩处理等操作步骤，因此g a b a 发 酵液的色泽比较深。 1 2 1g a b a 发酵液色素的来源 发酵液的色素主要来源于： ( 1 ) 培养基原料中的玉米浆和大豆粕等成分含有大量的天然色素和含氮物质。在培 养基的配制过程中，原料中的可溶性物质将溶解在发酵液中，虽然在发酵过程中，微生 物的生长代谢将消耗部分营养物质，但是大量残余的色素仍然会保留在最终发酵液中： ( 2 ) 微生物代谢过程中会分泌出色素等一些次级代谢产物； ( 3 ) 铁制的发酵设备接触酸、碱后发生化学反应，从而造成设备被腐蚀，游离出许 多铁离子，这一方面使得发酵液变为红棕色，另一方面铁离子与发酵液中酚类物质结合， 生成紫黑色色素； 4 g j j j 叫 慨呲 m 嗽m m 踹 踹 删嗽 洲 1 2 3 3 笫一章绪论 ( 4 ) 生产工艺中高温灭菌、加热处理以及浓缩等操作，可能产生大量色素： 糖类物质受热时发生焦糖化反应产生深咖啡色的焦糖色素： 还原糖同发酵液中的游离氨基酸或蛋白质链上氨基酸残基的游离氨基发生美 拉德反应产生的褐色色素。 1 2 2g a b a 溶液中色素的性质与分离 众所周知，发酵产品中的色素十分复杂，色素的形成机理也不甚清楚。为了得到高 品质的g a b a 产品，有必要对色素的性质以及生产过程中形成的原因进行研究，以便 更好地改善工艺抑制色素的生成，并为后期的分离纯化提供依据。 1 2 2 1 色素的分离研究方法 色素的分离方法多种多样，根掘色素相对分子质量的不同，许多研究者盼3 6 ，”1 采用 s e p h a d e xg 系列、s e p h a c r y ls 系列凝胶过滤色谱以及透析方法开展研究；也有学者采用 色谱分离技术来分离色素，比如g o d s h a l l 与c 1 a r k e 利用s 5 0 0 葡聚糖凝胶渗透法结合分 光光度法分离有色物质；p a t o t l 和s m i i h 利用h p l c 方法分离到了有色物质；另外还有 利用模拟体系来研究糖类形成色素的种类和机理【3 “。 1 2 2 2 色素的物理和化学性质 p h 敏感性。p h 敏感性指色素由于p h 变化而显示出的不同颜色的性质，具有一定 规律性。通常采用i v 值( i n d e xv a i u e ) 来表示色素对p h 的敏感性f 3 2 q ”。i v 值为色素 在p h 9 0 和p h 4 0 的环境条件下在4 2 0m 波长下的吸光值的比值。该比值越大，表明 色素对p h 变化越敏感，反之亦然。一般来说，酚类、多酚类及黄酮类化合物的i v = 5 1 4 ， 即表示对p h 变化非常敏感：而焦糖色素的i v 在1 o 到l5 之间，说明它对p h 变化不 敏感，因此可以根据i v 值的大小对色素进行大致分类。g a b a 浓缩液中的色素i v 值大 约在1 o 至1 4 之间，所以它对p h 变化不敏感。 电荷性。天然色素和加工过程中产生的色素大部分都带电。例如，非酶褐变产生的 焦糖色素是一种复杂、多变、结构尚不明确的大分子高聚合物，不同条件下产生的红棕 色焦糖色素的电荷性均不相同口“。一般情况下溶液中色素的带电正负性及数量大小主要 取决于色素形成的条件和分散状态。 相对分子质量。相对分子质量的大小是辨别色素种类的有效方法，研究表明，色素 的相对分子质量与其形成条件有关。很多研究者叫测定了糖液中色素的相对分子质量， 发现其分布范围在1 0 0 1 0 0 0 0 0 之间，并把相对分子质量5 0 0 0 以上、外观呈黑色的色素 称为高分子色素；1 0 0 0 5 0 0 0 的称为中分子色素，1 0 0 0 以下的为低分子色素。 波谱分析法是当今有机化合物结构剖析的主要方法。糖类物质产生的色素物质中普 遍存在一c = o 、c h 、0 一h 等基团，因此红外吸收光谱法和紫外吸收光谱法是研究这些 色素结构的有效方法。b i l l k l y 【3 “利用红外吸收光谱法测定了一些色素物质在红外吸收的 波数。大量研究表明【3 2 强3 6 ，3 ”，糖类形成的色素含有发色基团和助色基团，在紫外区域 江南大学硕士学位论文 有特征吸收峰。由于单个发色基团的吸收波长在2 0 0 一4 0 0m 之间，属于非可见光区， 所以化合物仍为无色，但如果物质中含有两个或两个以上的发色基团，其间形成共轭体 系时，由于7 电子的离域作用，使激发这些电子需要的能量降低，所吸收光的波长移向 可见光区，使得化合物显色。研究表明1 3 “，一c = c 一是还原糖分解产物、类黑精、焦糖等 的基本结构，这类色素大多具有4 个以上的碳碳双键，由于共轭作用，吸收强度增强， 因此它们在溶液中能够呈现出颜色来。助色基团的吸收波段主要集中在紫外区，但如果 它们与发色基团或共轭键相连接，就使得它们的吸收波长向长波方向移动，因此呈现出 颜色。 1 2 3g a b a 脱色工艺 脱色即将混合物中的有色杂质去除。根据最终目的不同可分为：一、通过化学反应 将有色杂质变为无色物质；二、通过各种分离方法将目标物质与杂质分离。通过对离子 交换浓缩液的原料分析发现，浓缩液中色素含量是影响产品纯度的一个重要原因，因此 化学反应脱色不具备纯化产品的可行性。 根据体系的不同，分离方法可以分为均相体系和非均相体系分离两种【3 9 】。非均相体 系的分离方法包括筛分、过滤、沉降和离心等单元操作；均相体系的分离方法有吸收、 蒸馏、蒸发、萃取、吸附等单元操作。随着生产技术的不断发展，对物质纯度的要求也 越来越高，经典的分离方法，如多级蒸馏、多级萃取、结晶技术已远远不能满足实际需 要。吸附分离和离子交换技术经过几十年的发展，在石油、化工、冶金、食品和医药工 业等各行业中得到了广泛应用，尤其适用于食品工业脱色、脱臭，氨基酸的精制等等， 这为提高发酵法生产g a b a 的产品纯度带来了思路。 1 2 3 1 活性炭脱色 活性炭是工业上常用的脱色剂，其优良的吸附性能主要来自于本身发达的孔隙结 构。活性炭种类繁多，由于制造原料、工艺、用途不同，往往对不同的有色物质或其他 物质的吸附能力有比较大的差别，有些如带有芳香环的有色物质就容易被活性炭吸附而 除去。汪建明日9 j 等人利用活性炭对蔗糖的热聚合产物的脱色过程中，取得了较好的效果， 王芙蓉【40 等在对谷氨酸菌体蛋白水解液的研究中也发现得到了同样的效果。选用一种合 适的活性炭不仅能使脱色达到预期的效果而且还能够节约成本。实验中选用了6 种不同 类型的活性炭，研究它对g a b a 发酵液的脱色工艺，发现活性炭具有良好的脱色效果， 但同时它们均对g a b a 产生很强的吸附作用，产品回收率较低，因此需要另辟途径。 1 2 3 2 大孔吸附树脂脱色 大孔吸附树脂是一类新型的非离子型高分子吸附剂，常以二乙烯苯、苯乙烯或甲基 丙烯酸酯等原料聚合而成。与离子交换树脂不同，大i l 吸附树脂在整个颗粒内、外部都 具有表面活性，同时树脂本身的多孔网状孔穴结构对不同分子大小的化合物还具有筛选 功效。大孔吸附树脂具有吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸容易、再生处理简 笫一章绪论 便和耐酸碱、有机溶剂等特点，因此常用于分离、脱盐、浓缩及去除有机杂质，尤其适 用于从水溶液中分离低极性或非极性的化合物。 大孔吸附树脂对浓缩液中极性较小的有机物有较好的吸附，同时该技术成本低、工 艺要求简单，所以本文选择大孔吸附树脂代替活性炭来有效地吸附色素等杂质。 1 2 3 3 离子交换法脱色 离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。氨基 酸为两性电解质，在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，因此可对氨 基酸混合物进行分组或实现单成分的分离。阴离子交换树脂是氨基酸工业中应用最为广 泛的脱色方法之一。 国内外均有采用离子交换法从发酵液中提取氨基酸的报道。日本专利( j p 0 8 1 8 3 7 6 8 ) 报道了通过阳离子柱与阴离子柱提取脯氨酸，国内有许多关于利用离子交换法从发酵液 中提取异亮氨酸、缬氨酸、l 苯丙氨酸、l 一谷氨酰胺和l 一赖氨酸的报道4 h3 1 。 1 3 立题背景和意义 由于g a b a 具有确切的健康功效，在医学中g a b a 早己被广泛应用于治疗各种类 型的尿毒症、肝昏迷以及煤气中毒等所致昏迷症状，但是在食品中的应用还是基于近 来对g a b a 生物活性的最新研究成果。高血压是最常见的心血管疾病，在我国目前正 以每年新增3 0 0 万人的速度发展。与药品不同，作为纯天然的功能性食品，g a b a 功效 明显，对人体无毒副作用，日本于19 8 6 年成功开发出了富含g a b a 的g a b a r o nt e a ，自 投放市场以来，深受消费者特别是广大高血压患者的青睐：1 9 9 4 年，日本o r y z a 公司 成功开发出g a b a r g ，之后日本又相继开发出富含g a b a 的发芽糙米和乳酸菌、酵母 发酵的高g a b a 浓度的健康食品素材等。目前，在日本除o r y z a 之外，f u j i c c o 、大 洋香料、y a e g a k i 发酵研究所、p h a r m af o o d s 研究所等机构都在积极开发g a b a 食品素材，涉及的领域包括米胚芽、米糠、绿茶、南瓜、豆制品、西红柿、小球藻等等 m “j ，富集g a b a 后得到高附加值的保健食品和食品配料，广泛应用于奶粉、饮料、 果酱及发酵食品中2 0 ，3 0 ，4 7 ，4 ”，并取得了良好的经济价值。在我国，有报道在人参、国宾 茶、桑茶、中药黄芪等检测到g a b a ，但是人们普遍对g a b a 功效的认识还不够深入， 对于g a b a 在食品中的应用研究几乎为空白，因此有待大力开发。 随着社会的发展，我国的功能食品产业取得了长足的进步，2 0 0 0 年总销售额已超过 5 0 0 亿元人民币，但与发达国家相比，无论是功能食品产业的发展速度，还是有关食品 功能因子的基础研究，均存在明显差距。与此同时，食品的安全性越来越受到关注，食 用色素就首当其冲，商业上过去有用铵盐催化焦糖化反应的焦糖产品，但由于铵法生产 的焦糖中有4 一甲基咪唑生成，该物为致惊厥剂，有的国家已禁用铵法生产焦糖，近期苏 丹红事件也已为我国食品行业敲响了警钟，对此其中一个有效解决途径是提高产品纯 度，降低应用风险，这是一种能和消费者引起强烈共鸣的方法，美国天然产品超市稳步 江南大学硕士学位论文 增加的销售就证实了这一点。 目前，我国应用的t 一氨基丁酸主要依赖于进口。鉴于g a b a 生产技术的高难度性， 日本协和发酵株式会社开发的纯度为9 99 的产品，其市场售价高达1 0 0 0 0 元g ，而 国内的研究中只有本实验室在前期的3 0 0l 发酵中试的产品达到5 7 的纯度水平，规模 化生产g a b a 更是广大科研工作者急需解决的问题。由于国外技术保密，进一步提高 产品纯度的工艺尚未见报道，这极大地阻碍了g a b a 在国内的推广和应用，因此在实 验室中寻求种成本适中、快速有效的方法，从中分离出纯度较高的g a b a ，是本论文 研究的主要目标，本论文从学术的角度分析了影响分离过程的因素，这为将来更好的实 现g a b a 产业化生产奠定了基础，对打破国际上对g a b a 生产技术的垄断，实现我国 技术研发的自主性、提高我国产品在国际市场上的竞争力，发展民族工业都具有十分深 远的意义，同时也会产生极大的社会效益和经济效益。 1 4 本课题的研究内容 本课题的研究内容主要有： ( 1 ) 设计一系列优化实验，确定一种简便、经济、有效、适合大量样品定量的g a b a 测定方法； ( 2 ) 在3 0 0l 发酵工艺生产g a b a 的基础上，进一步放大到3 0 0 0l 发酵水平，论 证工业化生产的可行性和可靠性，并分析工艺的特点及其物料性质，为分离纯化具有较 高纯度的g a b a 提供依据； ( 3 ) 吸附及离子交换热动力学研究，在选择出合适的脱色树脂基础上，对影响吸 附及离子交换平衡的因素进行分析： ( 4 ) 固定床工艺研究，以脱色率、g a b a 回收率以及交换容量为指标，考察不同 工艺条件对提取进程的影响，并优化高纯度g a b a 提取工艺条件。 笫二章纸也黹萃取分光光发往测定y 一氩基丁酸研究 第二章纸色谱萃取分光光度法测定丫一氨基丁酸研究 2 1 前言 定量化学分析是科学研究的基础之一。作为神经递质的g a b a ，最早开展研究的是 在医学领域，近年来国内外关于g a b a 已报道的测定方法有：色谱分析法1 4 ”j 、联用 技术( 5 7 瑚】、光谱分析法和放射受体分析法等，由于医学研究领域的特殊性，决定 了这些方法不适用于大规模的定量分析。 本实验室前期的研究发现，发酵液成分复杂，含有大量微生物代谢副产物，除了高 效液相色谱法外的其他检测方法都具有一定的局限性。h p l c 法具有检测速度快、分辨 率高、灵敏度好、柱子可反复使用等优点，但由于操作步骤复杂、仪器维护繁琐和价格 昂贵等缺点，限制了其在实验室的应用和推广，因此建立一种简单、有效及费用低廉的 检测方法至关重要。 纸色谱是最简单的液液相分配层析，它利用各组分极性及化学结构的差异，在适 当的条件下能将不同的组分彼此分丌，它在原理、影响因素以及对某些混合物的分离等 方面，与t l c 相似。g a b a 能与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，该化合物可在含有铜 离子的乙醇溶液中溶解，且溶液颜色的深浅与g a b a 含量成正比，因此通过分光光度 计可以测定样品中g a b a 的含量。本章研究了纸色谱萃取分光光度法测定g a b a ，并 将它与高效液相色谱法( h p l c 法) 进行了比较。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要实验材料 g a b a 发酵液 y 一氨基丁酸( 纯度9 9 9 ) 邻苯二甲醛( o p a ) 新华1 号层析纸 茚三酮 硫酸铜 无水乙醇 正丁醇 冰醋酸 醋酸钠( 色谱纯) 甲醇( 色谱纯) 乙腈( 色谱纯) 其他分析试剂 实验室制备 s i g m a 公司 s i g m a 公司 杭州新华纸业有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 分析纯 江南大学颂：匕学位论文 2 2 2 主要实验设备 a g i l e n t1 1 0 0 型高效液相色谱仪 u v l1 0 0 型紫外一可见分光光度计 层析缸( m 1 5 3 0c m ) p x y d h s 型隔水式电热恒温培养箱 d g g 一9 0 7 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 s h z 一8 8 台式恒温水浴振荡器 7 2 2 型分光光度计 微量注射器 一次性使用薄膜手套 美国安捷伦公司 北京瑞利分析仪器公司 上海华岩仪器设备有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海森信实验仪器有限公司 江苏省太仓市实验设备厂 上海第三分析仪器厂 无锡市东升玻璃仪器厂 扬州市邗江顺达塑料厂 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 展开剂及洗脱剂的配制 展开剂：正丁醇：冰醋酸：水= 6 ：l ：3 ( v v ) ( 内含o 5 茚三酮) 在棕色容量瓶中混合 定容，转移至分液漏斗振摇后静鼍分层，弃去下部水层，取上层有机相静置2 日后供展 开使用。 洗脱剂：7 5 乙醇：c u s 0 4 - 5 h 2 0 = 3 8 ：2 ( v w ) 2 2 3 2 样品预处理 5m lg a b a 发酵液加入2m ll o 的三氯乙酸( v v ) ，振荡均匀，离心( 2 ，0 0 0 g ， 1 0m i n ) ，取上清液稀释一定倍数，经o 4 5h m 滤膜过滤备用。 2 2 3 - 3 纸色谱萃取分光光度法测定g a b a 取新华1 号层析纸，点样4ul ，点样线距离层析纸底部和两端各2 oc m ，样品间距 为2 5c m ，点样完毕后制成圆筒。先悬于层析缸中饱和1h ，再放入展开剂中，以上行 法【6 2 】在3 0 恒温条件下垂直展开至距层析纸上端2c m 处，取出风干后于电热恒温鼓风 干燥箱中加热显色。 将与标准品r f 值( 相对迁移率) 相同的斑圈剪下，置于2 5m l 具塞试管中，添加5 m l 洗脱剂后恒温振荡洗脱，以未点样点，且与标准品r f 值及面积相同的空白斑圈为参 比，于最大吸收峰处比色，并从标准曲线中查出g a b a 含量。 2 2 3 4 纸色谱萃取分光光度法测定g a