（食品科学与工程专业论文）苯基硼酸和tomac离子对溶剂萃取分离塔格糖.pdf

摘要 摘要 d 塔格糖是一种在自然界中稀有的天然己酮糖，是果糖的差向异构体，也是半乳糖 的醛酮异构体。d 一塔格糖是近年被发现的一种具有特殊保健功能的功能甜昧剂，具有能 量低、降血糖、抗龋齿、抗衰老、改善肠道菌群等功能。d 塔格糖安全无毒，在国外被 广泛应用于健康饮料、酸乳、糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、肉制品 等食品中。 d 塔格糖可由d 半乳糖通过化学法或生物法异构生成，因化学法具有反应周期短、 成本低、产量高等优点，本课题以化学法合成的d 塔格糖为原料，并采用苯基硼酸和 季铵盐( 三辛基甲基氯化铵) 离子对溶剂萃取法，旨在分离d 塔格糖与d 半乳糖，这 对d 塔格糖的产业化具有重要意义。 测定了苯基硼酸及其与糖络合生成的络合酸酸度常数和苯基硼酸和季铵盐离子对 溶剂萃取塔格糖或半乳糖的萃取平衡常数。从理论上肯定了苯基硼酸和季铵盐溶剂萃取 分离塔格糖和半乳糖方案可行。 研究了苯基硼酸和季铵盐离子对溶剂萃取分离d 塔格糖的工艺条件。通过单因素 实验，确定了以化学法合成的d 塔格糖为原料进行溶剂萃取分离d 塔格糖的工艺条件： p h1 0 1 2 ，苯基硼酸浓度0 0 4 - 0 0 8m o l l ，溶剂比0 5 1 5 ，磷酸缓冲液浓度0 6 0 - 0 8 0m o l l 。进一步利用响应面分析优化得到最佳萃取工艺条件为p h1 1 3 ，苯基硼酸浓 度o 0 5m o l l ，溶剂比0 9 8 ，磷酸缓冲液浓度0 7 0m o l l 。此时d 塔格糖萃取率、d 半乳糖萃取率、选择性系数分别为6 4 4 、9 3 、1 7 6 。由此确定了萃取级数为3 。并 研究确定了反萃取工艺条件为h c i 浓度0 7 5m o l l 、溶剂比1 0 。反萃取后，d 塔格糖 的回收率和纯度分别为9 2 2 、9 6 7 。 关键词：d 塔格糖；d 半乳糖；化学法；苯基硼酸；溶剂萃取；反萃取；分离；纯化； 响应面 a b s t r a c t a b s t r a c t a b s t r a c t ：d - t a g a t o s e ，ar a r en a t u r a lh e x o k e t o s e ，i sac 4f r u c t o s ee p i m e ra n dai s o m e ro f g a l a c t o s e d - t a g a t o s eh a sa t t r a c t e dag r e a td e a lo fa t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r sd u et oi t ss p e c i f i c h e a l t hb e n e f i t s ，i n c l u d i n gal o wc a l o r i cv a l u e ，a n t i g l y c e m i c ，n o n c a r i o g e n i c ，p r e v e n t i n ga g i n g a n di m p r o v i n gh e a l t h yb a c t e r i u me t c d t a g a t o s ei ss a f e ，n o n t o x i c ，c a nb ew i d e l yu s e di n f o o di nf o r e i g nc o u n t r i e s i tc a nb ea p p l i e dt oaw i d ev a r i e t yp r o d u c t so fs o f td r i n k ，y o g u r t ， d i a b e t e s s p e c i f i cf o o d s ，d i e tf o o d s ，c h e w i n gg u m ，c e r e a l s ，m e a ta n ds oo n d t a g a t o s ec a nb ep r o d u c e df r o mc h e m i c a lo rb i o l o g i c a lp r o c e s s i nt h i sp a p e r ， d t a g a t o s ea sr a wm a t e r i a lw a sp r o d u c e db yc h e m i c a lp r o c e s sd u et oi t sa d v a n t a g e s ，s u c ha s s h o r tc y c l e ，l o wc o s ta n dh i g hy i e l d i t so f g r e a ts i g n i f i c a n c et h a tt h ee x t r a c t i o no fd t a g a t o s e a n dg a l a c t o s eb ya ni o n p a i rs o l v e n to fp h e n y l b o r o n i ca c i da n dt r i o c t y l m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d ew e r eu s e di no r d e rt os e p a r a t eo fd t a g a t o s ea n dg a l a c t o s e p h e n y l b o r o n i ca c i da n di t sc o m p l e xf o r m a t i o nw i t hs u g a ra s s o c i a t i o nc o n s t a n t sa n d s t a b i l i t yc o n s t a n t sb e t w e e np h e n y l b o r o n a t ea n dt a g a t o s eo rg a l a c t o s ei na q u e o u sa n da p p a r e n t e x t r a c t i o ne q u i l i b r i u mc o n s t a n t sw e r ed e t e r m i n e d i ts h o u l db en o t e dt h a tt h et e c h n i q u eo f s o l v e n te x t r a c t i o nw a sa f f i r m e dt ob ef e a s i b l ef r o mt h e o r y i nt h i ss t u d y , t h ee x t r a c t i o np r o c e s sc o n d i t i o n sw i t hi o n p a i rs y s t e mw e r er e s e a r c h e d t h e i n f l u e n c eo fp h ，t h ec o n c e n t r a c t i o no fp h e n y l b o r o n i ca c i d ，s o l v e n tr a t i o ( o w ) a n dt h e c o n c e n t r a t i o no fp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o no ne x t r a c t i o nr a t eo fd t a g a t o s ea n dd g a l a c t o s e a n dt h es e p a r a t i o nf a c t o ro f t h e mf r o mt h ea q u e o u ss o l u t i o nw e r ee x a m i n e db ys i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t s i t s h o w e dt h a tt h ee x t r a c t i o n p r o c e s s c o n d i t i o n sw e r e p i l l0 12 ，t h e c o n c e n t r a t i o no fp h e n y l b o r o n i ca c i d0 0 4 0 0 8 m o l l ，s o l v e n tr a t i o0 5 0 1 5 0 ，t h e c o n c e n t r a t i o no fp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n0 6 0 - 0 8 0 m o l l 。r e s p e c t i v e l y t of u r t h e r o p t i m i z a t i o na n di m p r o v e m e n to ft h ee x t r a c t i o np r o c e s s ，t h er e s p o n s es u r f a c em e t h o dw a s c a r r i e do u tu s i n gc e n t r a lc o m p o s i t ef a c e c e n t e r e de x p e r i m e n t a ld e s i g nb yd e s i g ne x p e r t v e r s i o n7 1 6 ( s t a t - e a s e u s a ) i ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u me x t r a c t i o np r o c e s sc o n d i t i o n s w e r ep h1 1 3 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fp h e n y l b o r o n i ca c i d0 。0 5m o l l 。s o l v e n tr a t i o0 9 8a n dt h e c o n c e n t r a t i o no fp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n0 7 0m o f l ，r e s p e c t i v e l y u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h e e x t r a c t i o nr a t ep e r c e n t a g ea n ds e p a r a t i o nf a c t o ro fd t a g a t o s ea n dd - - g a l a c t o s ew e r eo b t a i n e d t ob e6 4 4 ，9 3 ，17 6 ，r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r et h ee x t r a c t i o ns t a g e sw a sa f f i r m e dt ob e3 t h es t r i p p i n gp r o c e s sc o n d i t i o n sw h i c hw a sa l s os t u d i e di nt h i sp a p e rw e r et h ec o n c e n t r a t i o n o fh y d r o c h l o r i d ea c i d0 7 5m o l l ，s o l v e n tr a t i o1 0 ，r e s p e c t i v e l y a f t e rs t r i p p i n gp r o c e s s ，t h e r e c o v e r ye x t r a c t i o np e r c e n t a g ea n dt h a to fp u r i t yf o rd t a g a t o s ew e r eo b t a i n e dt ob e9 2 2 ， 9 6 7 r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：d t a g a t o s e ，d g a l a c t o s e ，c h e m i c a lp r o c e s s ，p h e n y l b o r o n i ca c i d ，s o l v e n t e x t r a c t i o n ，s t r i p p i n g ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是蠢人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 卅，u 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：刍镌叠 导师签名： f 鼍走 日 期： 7 ，f 甲 引言 1 引言 1 1d 塔格糖的功能特性及其在食品中的应用 稀有糖在碳水化合物的研究领域中，是一项重要的研究内容。国际糖协会( i s r s ) 将稀有糖定义为“在自然界中含量极少的一类单糖及其衍生物”【1 】。由于这些物质在膳食、 保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能，越来越受到人们的关注。但稀有糖在自然 界中含量极少，极大地限制了稀有糖的广泛应用。利用化学合成和生物转化法进行稀有 糖的大量生产，特别是后者，成为近年来的研究热点。d 塔格糖就是近年来受到重视的 一种的稀有糖。 1 1 1d 塔格糖的结构和理化性质 d 塔格糖是一种稀少的天然己酮糖，是d 半乳糖的醛酮异构体【2 】，也是果糖在c 4 上的差向异构体【3 ，4 】。d 塔格糖在碱性溶液中还与d 塔罗糖发生异构互变5 1 ，后者是d 半乳糖的差向异构体。 d 塔格糖和d 半乳糖，在水溶液中至少有6 种存在形式。其中直链结构含量很低， 主要以环状结构存在 6 1 。d 塔格糖在水溶液中的分子环状构象有o f , d 吡喃塔格糖( 7 9 ) 、 p d 吡喃塔格糖( 1 4 ) 、a d 一呋喃塔格糖( 2 ) 、3 - d 呋喃塔格糖( 5 ) 1 7 1 。 d 塔格糖为白色粉状晶体，易溶于水( 5 8 ，2 1 ) 。d 塔格糖在味觉和物理特性 上与蔗糖相似，无任何不良异味或后味，1 0 的塔格糖甜度约为蔗糖的9 2 ，是一种很 好的低能量甜味剂和填充剂0 1 。d 塔格糖还具有耐酸、耐热、耐碱等理化性质，在较 低温度下易发生美拉德褐变和焦糖化反应【5 川。d 塔格糖安全无毒 1 2 - 1 8 】。2 0 0 1 年，d 塔 格糖被美国食品与药物管理局( f d a ) 确认为普遍公认安全食品( g r a s ) t 1 9 】。同年， 塔格糖被f a o w h o 食品添加剂专家委员会( j e c f a ) 批准为食品添加剂，a d i 值为o 8 0m g k g d 【2 们。 1 1 2d 塔格糖的功能性质 d 塔格糖作为功能性甜味剂，主要包含以下功能： ( 1 ) 低能量 d 塔格糖在代谢过程中所消耗的热量比它所释放的净热量还要高【1 0 】，不会引起脂肪 沉淀，是一种新型的低能量甜味剂。 ( 2 ) 降血糖 机体摄入塔格糖后，小肠对葡萄糖的吸收会相应受到抑制，不致引起血糖波动【2 1 1 。 可有效抑制i i 型糖尿病患者的高血糖水平，缓解糖尿病症，抑制并发症发生【2 2 1 。 ( 3 ) 改善肠道菌群 d 塔格糖不易被小肠吸收( 约2 0 2 5 ) 。未被吸收的d 塔格糖则被大肠内的微生物 菌群利用，产生乙酸，丁酸，己酸等大量有益的短链脂肪酸【2 0 , 2 3 , 2 4 】。这些短链脂肪酸， 1 江南大学硕士学位论文 尤其是丁酸能有效抑制结肠癌、抑制肠道致病菌( 如大肠杆菌等) 以及促进乳酸菌等有 益菌增殖【”l 。 ( 4 ) 防龋齿 2 0 0 2 年1 2 月2 日美国f d a 确认塔格糖不会被1 2 1 腔内细菌分解，不会降低牙斑的 p h 值，引起龋齿2 6 1 。 ( 5 ) 其它功能 d 塔格糖可增强关键血液因子，促进血液健康，如减少凝血酶时间、部分凝血活酶 时间等 2 7 , 2 8 ，对贫血及血友病也有一定功效【1 1 】。d 塔格糖还可增强细胞对毒素的敏感性， 起到保护细胞的作用，如能显著抑制可卡因、呋喃妥英等对肝细胞的毒害作用【2 ”3 1 。此 外，d 塔格糖还具有抗氧化，延缓衰老等功能【2 ，3 2 ，3 3 1 。 1 1 3d 塔格糖在食品中的应用 d 塔格糖作为功能性甜味剂，已广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。2 0 0 3 年， 塔格糖在美国已作为蔗糖的替代品，广泛应用于健康饮料、焙烤食品、肉制品、保健食 品等食品中。表l 为d 塔格糖在食品中的用途及限量【3 4 1 。 表1d 塔格糖在食品中的用途及限量 t a b l elp r o p o s e df o o da p p l i c a t i o na n dm a x i m u ml e v e l so fu s e 1 2d 塔- 梏糖的生产 1 2 1d 塔格糖的自然分布 d 塔格糖在自然界中分布很广，但含量很少。在乳制品中存有少量的d 塔格糖， 一般为乳制品中乳糖被微生物利用发酵后的产物。 1 2 2d 塔格糖的生物转化 生物转化法是利用微生物代谢产物异构转化生成塔格糖 3 5 , 3 6 】，然后分离精制得到塔 格糖产品的方法。典型的生物转化方法有： ( 1 ) 利用微生物代谢产生的酶将己糖醇异构转化为塔格糖，如利用半乳糖醇脱氢 酶使d 半乳糖醇异构转化为d 塔格糖【3 7 - 4 0 l 。利用山梨醇脱氢酶【4 l l 、d 塔格糖3 差向异 构酶【4 2 1 ( d t a g a t o s e3 - e p i m e r a s e ，d t e ) 、d 阿洛酮糖3 差向异构酶【4 3 】( d p s i c o s e 2 引言 3 - e p i m e r a s e ，d p e ) 等使d 山梨醇异构转化为d 塔格糖。但半乳糖醇和山梨醇本身的生 产成本高，这种方法商业价值有限。 ( 2 ) 利用微生物代谢产生的酶将其它非稀有己糖异构成塔格糖【心】，如利用d t e 使d 果糖异构生成d 阿洛酮糖，再经多元醇脱氢酶( p o l yd e h y d r o g e n a s e ，p h d ) 和醛糖 异构酶转化为d 塔格糖【4 - 5 1 1 。l 阿拉伯糖异构酶 5 2 - 5 5 1 ( l a r a b i n o s e ，l a i ) 成为近年来 的研究热点，可使半乳糖转化为塔格糖。l a i 的最适温度和最适p h 与异构化条件不同 【5 6 】，会大大影响转化率。目前主要通过对l a i 进行分子改造【5 7 棚l 、基因改造【6 0 6 1 1 、固 定化【6 2 1 及工艺条件 6 3 , 6 4 研究等，解决l 舢生产塔格糖的诸多不利因素。 综上，生物转化法有其局限性，如生产周期长，产率低，成本高，难以满足工业化 生产要求。 1 2 3d 塔格糖的化学合成 化学合成法是以半乳糖为原料，主要通过异构化和酸中和两步合成d 塔格糖终产 物。其中异构化是整个化学合成反应的关键。首先以可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催 化剂，将半乳糖与金属氢氧化物反应异构，生成金属氢氧化物塔格糖复合物中间体沉 淀。再以酸中和，分离精制得到塔格糖产品【2 , 6 5 , 6 6 】。 化学合成d 塔格糖与生物转化法不同，生产周期较短，产率较高，成本较低，满 足工业化生产的基本要求。但在碱性反应条件下会形成副产物和化学污染物，这些副产 物使纯化步骤变得复杂和困难。本研究就是利用新的分离手段将化学合成的塔格糖从混 合物中分离出来。 1 3d 塔格糖的分离纯化 单糖间分离的常用方法有色谱法【6 7 - 7 0 1 、离子交换膜法1 7 1 1 、超临界c 0 2 萃取法 7 2 , 7 3 】、 液膜分离法 7 4 - 7 6 】和溶剂萃取法【7 7 】等。色谱法和离子交换膜法适宜于实验室研究，不宜于 进行大规模工业化生产。超临界c 0 2 法设备需耐高压，工艺条件和成本较高，也难于工 业化生产。目前，国际上对如何分离d 塔格糖与其它单糖尚没有公认的高效方法，探 索一种d 塔格糖与其他单糖间分离的新方法，对d 塔格糖的大规模生产具有重要意义。 1 3 1 溶剂萃取法分离d 塔格糖 溶剂萃取，又称液液萃取，是化工生产中常用的分离方法，主要用于液体混合物的 初步分离。溶剂萃取是一个复杂的物理化学过程，其所依据的是溶质在两个互不相溶或 部分互溶的液相间的分配平衡。这种分离技术装置简单，操作容易，通常在常温或较低 的温度下进行，易于实现大规模生产，在工业发展和环境保护方面占有重要地位。为着 眼于工业化生产，本研究利用苯基硼酸和季铵盐溶剂萃取分离塔格糖，开辟了一种新的 分离途径。 亲脂性的苯基硼酸能与具有二醇基团的塔格糖( 或半乳糖) 反应，生成环状酯类化 合物。在碱性环境下，苯基硼酸呈阴离子态，与塔格糖( 或半乳糖) 络合形成稳定的硼 3 江南大学硕士学位论文 酯。由于塔格糖( 或半乳糖) 分子结构不同，与苯基硼酸结合的能力不同。依据这一效 应，可以以苯基硼酸为萃取剂分离塔格糖和半乳糖。为使塔格糖从水相中萃取到有机相 中，一般加入助萃取剂三辛基甲基氯化铵( t r i o c t y l m e t h y l a n u n o n i u mc h l o r i d e ，t o m a c ) 来中和其负电荷【7 8 , 7 9 】。g r i f f i n 和s h u | 8 0 】利用溶剂萃取法成功萃取葡萄糖和木糖醇，并研 究了不同硼酸衍生物的萃取效果。本研究在此基础上进一步改进，用萃取及反萃取法分 离塔格糖和半乳糖。 1 3 2 离子交换树脂脱盐脱色 离子交换树脂可和溶液中的阴阳离子交换，除去溶液中的盐类。离子交换树脂还具 有吸附性能，能够吸附除去色素，尤其是大孔型离子交换树脂的吸附性能更强。为了达 到较好的脱色效果，一般采用大孔型离子交换树脂【8 。 1 4 立题背景与意义 甜味剂是当今世界各国食品添加剂行业研究的一项重要内容，特别是无热量、非营 养性高倍甜味剂，是各国科学家研究最多的一个领域。近年来，物质生活水平的提高和 生活节奏的加快，使得生活方式病如肥胖病、糖尿病、心血管病和龋齿等日益突出。这 些生活方式病同饮食习惯及膳食结构有关。控制营养过剩、限食高脂肪、高糖和盐的食 物越发引起人们的重视。开发具有安全、无营养、低( 无) 热量的甜味剂，成为发展的 重点。2 0 0 8 年世界甜味剂市场规模达到2 9 8 2 亿美元，在食品添加剂市场中占有重要地 位。国际甜味剂发展趋势，今后五年作为新甜味剂的糖醇和强力替代用甜味剂消费量将 增加1 5 2 5 。d 塔格糖作为一种新型的低能量功能性甜味剂，在食品、医药、化妆品 等领域中得到广泛应用，具有广阔的市场前景。因此分离d 塔格糖显得尤为重要。 本文选取以化学法合成d 塔格糖为研究对象，通过苯基硼酸溶剂萃取选择性分离 d 塔格糖和d 半乳糖，开辟一种分离塔格糖的新途径，并着眼于d 塔格糖的规模化生 产。这对加快我国甜味剂市场的发展，完善和加强功能性食品的开发具有重要意义。 1 5 本课题研究的内容 本课题的主要研究内容有： 1 ) 测定苯基硼酸和硼酯在水溶液中的酸度常数和稳定常数； 2 ) 利用苯基硼酸溶剂萃取塔格糖或半乳糖，测定萃取平衡常数，确定萃取影响因 素及其水平； 3 ) 利用串联的阴阳离子交换树脂对化学合成塔格糖初样脱盐脱色，并进行单因素 试验和响应面优化设计，确定最佳萃取工艺条件； 4 ) 确定反萃取工艺条件，得到纯度较高的塔格糖样品。 4 实验材料与方法 实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验材料 d 塔格糖标样( s i g m a 公司，分析纯) ：d 半乳糖、3 ，5 二硝基水杨酸( 国药集团，生 化试剂) ；苯基硼酸、三辛基甲基氯化铵( 进口，化学纯) ；3 1 3 阴离子交换树脂、0 0 1 7 阳离子交换树脂( 江苏苏青水处理集团) ；氢氧化钙、无水氯化钙、正己烷、正辛醇、 浓硫酸、磷酸、盐酸、咔唑、盐酸l 半胱氨酸均为分析纯，国药集团。 2 1 2 主要实验仪器 安捷伦高效液相色谱仪、s h o d e x 示差折光检测器、s u g a r p a r k l 糖柱、h l 2 b 型数显 恒流泵、层析柱、低温水浴振荡、尤尼柯2 1 0 2 p c 型紫外可见分光光度计、d z f 6 0 2 1 型真空干燥箱、梅特勒d e l 3 2 0 p h 计、冷冻干燥机、n i c o l e tn e x u s4 7 0 型傅立叶变换红 外光谱仪等。 2 2 实验方法 2 2 1 检测方法 2 2 1 1 分光光度法 1 ) 塔格糖的测定 硫酸咔唑法【2 , 8 2 , 8 3 。吸取5 0 p g m l d 塔格糖标准溶液0 、o 1 、0 2 、0 3 、0 4 、0 5 、 0 6 、0 7 、o 8 m l 于试管中，用去离子水补足至l m l ，加入0 2 m l 半胱氨酸盐酸盐溶液 和6 m l 硫酸溶液，混匀后立即加入0 2 m l 咔唑酒精溶液并混匀。于6 0 恒温水浴1 0m i n ， 取出冰浴1 0 m i n ，于5 6 0 n m 处比色。以d 一塔格糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制 d 塔格糖标准曲线，方程为y = 0 0 2 6 3 x 0 0 0 4 2 ，r 2 = 0 9 9 9 7 。 2 ) 还原糖的测定 3 ，5 二硝基水杨酸法8 4 1 。分别取0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m g m l 的d 半乳糖标准溶 液l m l ，分别置于2 5 m l 具塞试管中，以去离子水作空白对照，于5 4 0 n m 处比色。以 半乳糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制还原糖标准曲线，方程为尸0 3 0 1 7 x 0 0 0 8 5 ， r 2 = 0 9 9 9 0 。 2 2 1 2 高效液相色谱( h p l c ) 法 h p l c 条件：色谱柱：s u g a r p a r k l6 5i t i i t i 3 0m m ；流动相：去离子水；检测器： s h o d e x 示差折光检测器；柱温：8 5 ；流速：0 4m l m i n ；进样量：1 0 此。 2 2 1 3 薄层层析法检测 薄层层析法用于快速检测样品中的单糖组分【8 5 】。薄层层析条件为： 展开剂：乙酸乙酯：异丙醇：水= 6 ：3 ：1 ( v w v ) ；显色剂：4 9 z 苯胺、4 m l 苯胺与 5 江南大学硕士学位论文 2 0 m l8 5 磷酸共溶于2 0 0 m l 丙酮中；8 5 烘烤1 0m i n 。 2 2 2 化学法合成d 塔格糖 以2 0 的d 半乳糖为原料，加入等体积的3 m o l l 的c a ( o h ) 2 浆状物，0 0 2 m o l l 的c a c l 2 催化剂，混合反应3 0m i n ，异构生成金属氢氧化物d 塔格糖复合物中间体沉淀， 然后用两种方法得到d 塔格糖。第一种方法【2 】直接以磷酸中和该复合物中间体，调节 p h 至5 4 ，离心得到d 塔格糖初样i ，于h p l c 下检测，如图1 ( a ) 所示。塔格糖、半乳 糖浓度分别为3 8 6 7 、7 5 0m g m l ，塔格糖产率为4 7 0 。此法得到的塔格糖含量较高， 但副产物较多，为后续分离带来困难。第二种方法分步进行，离心取复合物中间体沉 淀，加入少量水溶解制成溶液，并以磷酸中和该溶液，调节p h 至5 4 ，再次离心得到 d 塔格糖初样i i ，于h p l c 下检测，如图1 ( b ) 所示。塔格糖、半乳糖浓度分别为2 4 6 2 、 2 6 3 7m g m l ，塔格糖产率为2 9 9 。此法得到的塔格糖含量相对较低，产率也较低，但 副产物较少，利于萃取分离。 图1 塔格糖初样的h p l c 图( a ：塔格糖初样i ，b ：塔格糖初样i i ) f i g 1h p l cs p e c t r ao fd - t a g a t o s e ( a ：c r u d ei b ：c r u d e ) 6 实验材料与方法 2 2 3 脱盐脱色 2 2 3 1 离子交换树脂预处理 阳离子交换树脂0 0 1 7 和阴离子交换树脂3 1 3 在使用前分别按下述方法再生【8 6 】： 阳离子交换树脂0 0 1 宰7 _ 质量分数5 的n a c l 浸泡4 h _ 蒸馏水清洗一质量分数4 的n a o h 浸泡4 h _ 自来水洗至p h 9 o 叶质量分数4 的h c l 浸泡4 h 去离子水洗至p h 6 0 阴离子交换树脂3 1 3 一质量分数5 的n a c i 浸泡4 h 叶蒸馏水清洗一质量分数4 的 h c i 浸泡4 h _ 自来水洗至p h 5 0 质量分数4 的n a o h 浸泡4 h 一去离子水洗至p h 8 0 2 2 3 2 离子交换树脂串联脱盐脱色 在两根西2 5 x 3 0 0 m m 的玻璃柱中，分别装填再生好的阴阳离子交换树脂。按先阳后 阴顺序连接并用去离子水平衡【4 n ，待树脂平衡后将糖液泵入，进行脱盐脱色。控制样品 流速1 0 m l m i n ，进样体积和柱体积分别为2 0 m l ，5 0 m l 。然后用去离子水洗脱，收集 样品【2 1 。 2 2 4 苯基硼酸酸度常数的测定 p h 电位滴定法【7 8 j 。即取一定量的苯基硼酸( 5 5 c 真空干燥，下同) 溶于磷酸缓冲 溶液( 缓冲溶液p h 利用4 m o l ln a o h 溶液调节) 中，并置于3 0 水浴摇床振荡3 h 。 待平衡后测溶液p h 值及苯基硼酸含量。 2 2 5 糖。苯基硼酸络合酸酸度常数的测定 p h 最小值法1 8 7 , 8 8 。即向体系内加入塔格糖或半乳糖，溶液p h 不再随之降低至某一 稳定值。 2 2 6 硼酯稳定常数的测定 p h 电位滴定法【7 8 8 7 _ 9 1 1 ，同2 2 4 。 2 2 7 两相溶剂萃取 2 2 7 1 料液制备 一定浓度的塔格糖( 或半乳糖) 溶液或经脱盐脱色的化学合成塔格糖初样，利用磷 酸或碳酸缓冲溶液调节其p h ，作为萃取料液。将苯基硼酸与三辛基甲基氯化铵溶于正 己烷：正辛醇( 8 5 ：1 5 ) 的有机溶剂中，作为萃取剂。 2 2 7 2 两相溶剂萃取 将一定比例的料液和萃取剂盛于5 0 m l 的具塞锥形瓶中，置于3 0 的水浴摇床中振 荡( 2 0 0 - a ：5 r p m ) 3 o h 。待萃取平衡后，将其倒入2 5 0 m l 的分液漏斗中静置0 5 h 。测定 萃取前后水相溶液中的塔格糖和半乳糖含量，求得萃取率和回收率及其选择性系数。 塔格糖或半乳糖的萃取率可定义为： e ( ) 2 靠灯0 0 ( 1 ) 7 江南大学硕士学位论文 选择性系数口定义为： ，1，1 口= 二堕逍 ( 2 ) c r tc 阢 式中c e ，c r 分别为塔格糖( 或半乳糖) 在有机相和水相中的浓度；珏，昧分别为有 机相和水相的体积。下标t ，g 分别表示塔格糖和半乳糖。 选择性系数a 表征了塔格糖和半乳糖从水相转移至有机相的难易程度。一般来说， a 越大，选择性系数越高，分离效果越好。 2 2 7 3 响应面优化设计 为了更好地分离塔格糖，在单因素的基础上，对萃取工艺条件进行优化。选择p h ， 苯基硼酸浓度，溶剂比及缓冲液浓度为影响的主要因素。4 因素3 水平的c c f d 的中心 组合设计见表2 。 袁2c c f d 的中心组合因素水平表 t a b l e2f a c t o r sa n dl e v e l so fc e n t r a lc o m p o s i t ef a c e - c e n t e r e dd e s i g n 2 2 8 多级萃取与反萃取 多级萃取中水相溶液则为上次萃取的萃余相，需再度调节其p h ，其它条件不变。 以一定浓度的h c l 溶液为反萃剂【8 0 l ，溶剂比为1 0 ，其它条件不变，进行反萃取。 8 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 苯基硼酸样品酸度常数的测定 在水溶液中，苯基硼酸以游离态的b 和阴离子态的b o i - i - 形式存在，两者间存在如 图2 所示的平衡： 2 2 + 鞴_ 薹 图2 苯基硼酸与糖络合化学平衡 f i g 2e q u i l i b i u mo nc o m p l e xf o r m a t i o nb e t w e e nb o r o n a t ea n ds u g a r b + h 2 0 b o h 一十h + ：心( 3 ) 测定苯基硼酸浓度的方法有多种，如荧光检测法 8 7 , 8 8 1 ，紫外光谱检测法 7 8 , 8 7 1 等。游 离态的b 在紫外区有吸收( 图3 ) ，阴离子态的b o h - 在紫外区则无吸收，利用这一特性 测定苯基硼酸样品在不同p h 条件下的含量。 0 8 凸 o 0 6 0 4 0 2 0 z 1 3 02 2 0 2 4 02 6 02 8 03 0 0 v n m 图3 苯基硼酸( p h 7 4 ) 的紫外吸收光谱曲线( 苯基硼 酸0 0 0 1m o l l ，0 1 0m o l l 磷酸缓冲溶液) f i g 3a b s o r p t i o ns p e c t r ao f p h e n y l b o r o n a t ea tp h 7 4 ( p b a0 0 01m o l l ，p h o s p h a t eb u f f e r0 10m o l l ) 9 6789 1 0 1 11 2 p h 图4 苯基硼酸的p h 滴定曲线( 苯基硼酸0 0 0 1 m o l l ，0 10m o l l 磷酸缓冲溶液) f i g 4t h ep ht i t r a t i o nc u r v ef o rp b a ( p b a 0 0 01m o l l p h o s p h a t eb u f f e ro 1om o l l ) 善参 楚 尸m o 一洲k - 1 0 胪0 5 4 3 2 1 0 0 d o 0 0 0 0 江南大学硕士学位论文 溶液的p h 及其中的 b 】，可分别通过p h 计及紫外可见光分光光度计测定。由化学 反应方程式( 3 ) 知， 必叫礼g 晶 由式( 4 ) 可求得不同p h 条件下苯基硼酸的酸度常数p 墨值，见表3 。 表3 不同p h 条件下测定苯基硼酸p k a 值( 2 5 ) t a b l e3t h ep k ad e t e r m i n a t i o no fp b au n d e rd i f f e r e n tp h 宰为测定三次平均误差限。下同 图4 为苯基硼酸的p h 滴定曲线。由图可知，p h 变化打破了苯基硼酸在水溶液中 的化学平衡，存在形式也随之发生改变。随着溶液p h 的不断增大，苯基硼酸在水溶液 中的主要存在形式逐渐由游离态的b 向阴离子态b o i - i - 转变。当水溶液p h 9 时， 【b o h - b 】，b o h 一成为其在水溶液中的主要存在形式。当水溶液p h 1 0 时， b 】不再随 溶液p h 的变化而变化，苯基硼酸在水溶液中的存在形式不再发生变化。理论上，苯基 硼酸的酸度平衡常数岛为温度的函数，不因溶液的p h 改变而改变。 结合图4 和表3 ，苯基硼酸存在形式变化较大的区域为p h 8 l o ，故以此计算苯基 硼酸p k a 值求得算术平均值为8 9 6 ，这与文献报道值相近【7 8 ，8 7 ，8 引。当水溶液p h 1 0 时， 苯基硼酸p k a 值相差较大，这可能是实验条件和误差所致。 3 2 苯基硼酸络合物平衡常数的测定 3 2 1 络合酸酸度常数的测定 苯基硼酸与糖反应机理非常复杂，游离态的b 与阴离子态的b o h - 均能与糖反应生 成硼酯，前者呈电中性称为络合酸，后者呈电负性称为碱式酯。这是因为b 中o b o 的键角为1 2 0 0 ，呈三角形为电中性；b o h - 中o b o 的键角为1 0 9 0 ，呈四面体构型【9 4 1 。 在碱性条件下，b o h - 较b 更稳定【7 8 1 ( 图2 ) 。故在萃取糖时，水相溶液需调节p h 至碱 性环境。换言之，水相溶液的p h 越高，越有利于糖的萃取。 测定络合酸酸度常数，可更直观地发现影响萃取的因素，为萃取因素的选择提供依 1 0 结果与讨论 据。本实验利用最低p h 值法，苯基硼酸浓度为0 0 0 1m o l l ，与溶液中添加的塔格糖或 半乳糖浓度相比，可忽略不计。为简便起见，现将苯基硼酸与糖反应简化为按l ：l 络合 反应，其化学方程式简化如下： 苯基硼酸与塔格糖( 或半乳糖) 按1 ：1 络合的反应方程式 b + s b s + 2 h2 0：k 。 ( 5 ) b o h 一十s b s 一+ 2 h 2 0：j o l( 6 ) 络合酸b s 在水溶液中的化学反应方程式 b s + h ，o b s 一+ h +：k 。( 7 ) 反应方程式式( 5 ) 、( 6 ) 、( 7 ) 中凰l 、凰1 分别为苯基硼酸与塔格糖( 或半乳糖) 按1 ：1 络合时的平衡常数，墨为络合酸的酸度平衡常数。 显而易见，络合酸b s 与b 共存于溶液中，【b s 未知。可利用最低p h 值法确定络 合酸的浓度【b s 】。在一定量已知浓度的苯基硼酸溶液中，加入塔格糖或半乳糖，致使溶 液的p h 值降低，其降低过程与加入的塔格糖或半乳糖量【s 】有关。由于b 与b o w 均可 与糖反应，但反应( 6 ) 更易进行。刚开始随着塔格糖或半乳糖的加入；反应方程式( 3 ) 、 ( 6 ) 化学平衡不断向右移动， 矿】不断增加，致使溶液的p h 值逐渐降低。 h + 增加， 反应( 7 ) 化学平衡向左移动，继续加入的塔格糖或半乳糖至一定量，溶液p h 值降为最 低，即此时溶液的p h 值不再随塔格糖或半乳糖的加入而降低。由于 s 】【b 】f ( 苯基硼 酸总量) 反应( 7 ) 向逆方向进行。此时可认为b 已转变为相应的络合酸b s 。忽略加 入塔格糖或半乳糖引起溶液体积变化，苯基硼酸的浓度即为生成络合酸的浓度，则【b s 】 b 】，。 1 0 0 9 0 8 0 迂 a 7 0 6 0 5 0 4 0 糖浓度t o o l l 。1 图5 络合酸隔的测定 f i g 5t h e 隔d e t e r m i n a t i o no fp h e n y l b o m n i ce s t e r s ( 0 0 01m o l lp b a ，0 10m o l lp h o s p h a t eb u f f e o 由反应方程式( 7 ) 知 胙m 吨龄 ( 8 ) 江南大学硕士学位论文 由式( 8 ) 可计算出络合酸b s 酸度常数p 届值，结果如图5 所示。当加入的塔格糖或 半乳糖量越多，实验结果也越准确，测得的络合酸b s 酸度常数墨也更接近其真实值。 由图可知，添加的糖不同，络合酸b s 酸度常数p k a 值也不同。这也说明苯基硼酸与不 同糖间的络合能力不同。忽略加入塔格糖或半乳糖引起溶液的体积变化，当向溶液内添 加塔格糖至2 0m o l l 时，其p k a 值趋于稳定，为4 7 0 。当向体系内添加半乳糖至1 5m o l l 时，其p 墨值趋于稳定，为5 8 4 。结果显示苯基硼酸与塔格糖间络合能力更强。值得一 提的是，实验同时证实糖浓度过大，对糖萃取不利。 3 2 2 硼酯稳定常数的测定 碱式硼酯( 以下简称硼酯) 稳定性是由p h 及溶剂决定的，具体过程机理相当复杂。 一般地，在不同条件下测定硼酯的稳定常数，可相应地了解影响硼酯稳定性的主要因素。 图6 为苯基硼酸与塔格糖或半乳糖在p h 7 8 下的络合反应平衡后的吸收光谱曲线。由图 6 可知，苯基硼酸在2 6 6 n m 处有最大吸收峰，随着塔格糖( 或半乳糖) 浓度的增大，苯 基硼酸的