（光学专业论文）不同激发光对叶片延迟发光的影响.pdf

摘要 摘要 本文采用超微弱发光测量系统研究了在不同激发光照射下口红吊兰叶片的延迟发 光变化曲线，获得在不同激发光照射下超微弱发光与叶片生理状态的联系以及不同激发 光对不同发育时期的叶片的影响。 结果发现：( 1 ) 口红吊兰叶片延迟发光强度的变化整体上是随激发光波长的增加而 增强，表明激发光对延迟发光强度的影响主要集中在长波段。在全波段的光照射下叶片 的延迟发光强度最大，衰减最慢，衰减参数最大。而在单波段下延迟发光强度小，衰减 快；衰减参数1 p 随激发光波长的增加先是不断的升高，然后快速上升达到最大。这表 明植物叶片在全波段的光照射下系统内的相互作用最强，而在单波长的光照射下叶片系 统内的相互作用较弱。( 2 ) 不同激发光对不同发育时期的叶片的影响。植物叶片在全 波段下延迟发光强度随着叶龄的增加整体上是增强的；延迟发光衰减参数总的变化趋势 是先增加再减小。而在单波段的光照射下延迟发光强度随着叶龄的增加先是不断的增 强，然后是下降：延迟发光衰减参数先是缓慢的下降，然后是缓慢的增大。不同叶片在 同一激发光照射下的变化曲线虽然在分散程度上有区别，但是其变化趋势是相似的。 这些实验结果说明：通过在不同激发光照射下叶片延迟发光的变化规律可以看出， 延迟发光反映了生物系统内各组成部分之间的相互作用的大小，显示了组成部分间偶联 程度，还可以从系统角度反映生物体内的生理状态和代谢情况；不同激发光对不同发育 时期的叶片有很大的影响，不同激发光对不同发育时期的叶片的影响的变化规律与叶片 从幼年到衰老整个过程中生理代谢的变化规律很相似，说明不同激发光有可能对叶片自 然衰老的研究有一定的促进作用，或许可以作为一种新的生物物理方法来研究衰老的机 理。 关键词口红吊兰超微弱发光延迟发光不同激发光衰减参数 a b s 廿a c t a b s t r a c t u s i n gt h eu l t r a - w e a kl u m i n e s c e n c ed e t e c t i v et e c h n o l o g y ，w es t u d yt h ev a r i e t yc u r v eo f d e l a y e dl u m i n e s c e n c ep l ) o fa e s c h y n a n t h u s p u l c h e rl e a v e si l l u m i n a t e db yd i f f e r e n te x c i t e d l i g h t w eg a i n e dt h er e l a t i o nb e t w e e nt h ep h y s i o l o g i c a ls t a t eo fp l a n tl e a v 销a n dt h e u l t r a - w e a kl u m i n e s c e n c ei l l u m i n a t e db yd i f f e r e n te x c i t e dl i g h t , a n dt h ee f f e c to fd i f f e r e n t e x c i t e dl i g h to np l a n tl e a v e sa tt h ed i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d t h er e s u l t ss h o wt h a t ：( 1 ) t h ed li n t e n s i t yv a r i e t yo fa e s c h y n a n t h u s p u l c h e rl e a v e sa l w a y s s t r e n g t h e n e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fe x c i t e dl i g h tw a v e l e n g t h , w h i c hi n d i c a t e st h a tt h e i n f l u e n c eo fe x c i t e dl i g h to nd li n t e n s i t ym a i n l yr e p r e s e n ta ll o n gw a v e l e n g t h , b a n d s o nt h e c o n d i t i o no f t h ef u l l w a v e l e n g t he x c i t e dl i 曲t , d l + i n t e n s i t yi st h eb i g g e s t , a n dt h ea t t e n u a t i o n i st h es l o w e s ta n dt h ea t t e n u a t i o np a r a m e t e ri st h eb i g g e s t b u td li n t e n s i t yi sl o w e ra n dt h e a t t e n u a t i o ni sf a s t e ru n d e rt h es i n g l e - w a v e l e n g t he x c i t e dl i g h t ；t h ea t t e n u a t i o np a r a m e t e r1 p f i r s t l yg ou p 、析l t lt h ei n c r e a s eo fe x c i t e dl i g h tw a v e l e n g t h , t h e n1 pc o n t i n u e sf a s ta s c e n s i o n a n df m a l l yi tr e a c h e sa tt h em a x i n l u n l ，w h i c hi n d i c a t e st h a tt h ei n t e r a c t i o ni n s i d et h es y s t e m o ft h ep l a n tl e a v e si l l u m i n a t e db yt h ef u l l w a v e l e n g t hl i g h ti st h es t r o n g e s t ，b u tt h ei n t e r a c t i o n i n s i d et h es y s t e mo ft h ep l a n tl e a v e si l l u m i n a t e d 研t h es i n g l e - w a v e l e n g t hl i g h ti sw e a k e r ( 2 ) d i f f e r e n te x c i t e dl i g h ta f f e c t st h ep l a n tl e a v e sa tt h ed i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d d li n t e n s i t y o ft h ep l a n tl e a v e si l l u m i n a t e db yt h ef u l l w a v e l e n g t hl i g h ta l w a y si n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s i n go f l e a fa g e ；t h ed la t t e n u a t i o np a r a m e t e rl pf i r s t l ya s c e n d ，t h e ni ts l o w l yd e s c e n d n e v e r t h e l e s s ，d li n t e n s i t yo ft h ep l a n tl e a v e si l l u m i r a t e db yt h es i n g l e w a v e l e n g t hl i g h t f i r s t l yc o n t i n u o u s l ys t r e n g t h e nw i t ht h ei n c r e a s i n go fl e a fa g e ，t h e ni td e s c e n d s ；t h eg l o b a l t e n d e n c yo f t h ea t t e n u a t i o np a r a m e t e r1 pf i r s t l yi n c r e a s e , t h e ni td e c r e a s e t h o u g ht h ev a r i e t y c t r v eo fd i f f e r e n tl e a v e si l l u m i n a t e db yt h es a n l ee x c i t e dl i 出h a sd i f f e r e n c ei nd e 伊e e ，i t s v a r i e t yt e n d e n c yi ss i m i l a r i ss i m i l a r t h e s er e s u l t sp r o v et h a td lr e f l e c tt h em a g n i t u d eo ft h ei n t e r a c t i o no fe a c hp a r ti n s i d et h e p l a n ts y s t e m ，f u r t h e r m o r e ，i tc a l lr e f l e c tp h y s i o l o g ys t a t ea n dm e t a b o l i cc i r c u m s t a n c ei n s i d e a b s t r a c t t h es y s t e mo fp l a n tu n d e rd i f f e r e n te x c i t e dl i g h t d i f f e r e n te x c i t e du g h th a sg r e a ti n f l u e n c eo n t h ep l a n tl e a v e so ft h ed i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d t h er e g u l a t i o n s b e t w e e nt h ee f f e c t so f d i f f e r e n te x c i t e dn g h to nl e a v e sa tt h ed i f f e r e n tg r o w t hp e r i o da n dt h ep h y s i o l o g ym e t a b o l i s m o fp l a n tl e a v e sd u r i n gs e n e s c e n c ea r es i m i l a r , w h i c hs u g g e s tt h a td i f f e r e n te x c i t e dl i g h tm y b e h a v eac e r t a i np r o m o t i n gf u n c t i o n0 nt h es e n e s c e n c eo fl e a v e s ，a n dt h ed lt e c h n o l o g y p e r h a p sb e c o m ea n e wm e t h o do f b i o p h y s i c st os t u d yt h em e c h a n i s mo fs e n e s c e n c e k e yw o r d s ：a e s c h y n a n t h u s p u l c h e r u l t r a - w e a kh t m i n e s c e n c e d e l a y e dl u m i n e s c e n c e d i f f e r e me x c i t e dl i g h tt h ea t t e n u a t i o np a r a m e t e r m 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名： ：划：日期勘显年曼月l 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文祓查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“4 一) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 石词；敏绶耐叶h 廷都学位 论文，是我个人在导师( 鸯b 指导并与导师合作下取得的研究成果j 研究工作及取得 的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全 了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的备项法律、行政法规以及河北 大学的相关规定。 本人声明如下；本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书 面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反 本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人： ，塞! l墨 日期： ：塑! 墨：年垒月上日 作者签名：塞12墨 日期：2 塑墨年五月l 日 导师签名：享l 第1 章绪论 1 1 生物超微弱发光的概述 第1 章绪论 生物发光是光生物中唯一与其它由光产生的生物效应相反的过程，即由代谢反厦而 引起的发光。生物的发光现象可分为三种：由生物体内专门的体系发出的光称为“功 能化学发光。如萤火虫、发光细菌等生物的发光，属于特异发光酶系催化的结果，量 子效率极高，发光强度可达1 0 1 0 h v ( s e r a 2 ) ，光谱范围窄；受辐射诱导的光诱导发光， 又称为荧光，是光照射生物后，生物体向外辐射发光，这类发光强度衰减变化快，且辐 射光的波长比照射光的波长要长，如叶绿体的光照射发光；与生物体内代谢或破坏过 程相联系的超微弱发光，简称超弱发光( u l t r a - w e a kl u m i n e s c e n c e ) 1 1 。 我们所要讨论的生物超微弱发光是极为普遍存在的生物发光现象，只要是活的生 物，小至细菌微生物，大到植物、动物甚至人都有自发的光子辐射：这种光发射的强度 一般来说极其微弱，大约在1 - - 1 0 2 光子( c m - 2 s - i ) 的量级，相当于一支蜡烛在1 0 公里外 造成的照度，显然已经低于人眼的感光灵敏度；其波长范围为1 8 0 - - - 8 0 0 r i m 的从红外到 近紫外的超弱光子流【2 卅。生物超微弱发光包含自发的发光( 自身发光) 和外因诱导的 发光两部分，其中光诱导的超微弱发光称为延迟发光( d e l a y e dl u m i n e s c e n c e ，d l ) 。随 着科学技术的不断进步，生物超微弱发光现象被越来越多的实验证实，生物超微弱发光 与生物系统的光合作用、生物氧化、解毒作用、肿瘤发生、细胞分裂、细胞死亡、细胞 癌变、细胞内和细胞间的信息传递与功能调节等重要的生命过程有着密切的联系【7 - 9 1 。 生物的超弱发光与生物体的生理生化和病理过程密切相关。因此，它可能是反映生物体 的生命状态十分有效而精确的指标，对阐明具体生物体的生长发育、遗传变异、细胞通 信、病变衰老及细胞死亡等基本过程有重要意义【l o 】。 河北大学理学硕十学位论文 1 2 生物超微弱发光的历史和研究现状 关于生物超微弱发光的研究，可以追溯到上世纪2 0 年代，1 9 2 3 年，苏联科学院院 士g u r w i t s c h 作了一个精彩的实验：两个靠近但不接触的洋葱，一个水平放置，另一个 则垂直放置，把两条洋葱的根各自放进两根玻璃毛细管内，垂直的根外面再套一个金属 管加以屏蔽，水平放置的根尖对准垂直的洋葱的一条根中部的- - d , 块分生组织( 此处有 一孔，既无金属又无玻璃) 。结果观察到分裂中的根尖细胞能刺激根中部的分生组织细 胞分裂的效应面向根尖的一侧分生组织比背向根尖侧分裂了更多的细胞。当时 g u r w i t s c h 把这种效应叫做致有丝分裂辐射，这种效应能被一块不透紫外光的玻璃所阻 挡，从而断定它是非常微弱的紫外光。由于当时的光检测器不够灵敏，这个发现未被承 认【1 1 , 1 2 】。 1 9 5 4 年以c o l l i 为首的物理小组对生物超微弱发光进行了进一步的研究。首次证明 生物体确实具有光子辐射的功能。他们采用光电倍增管直接探测到小麦、豆类、玉米在 萌发过程中的发光。其辐射波长为6 9 0 - - , 3 9 0 n m ，峰值在5 5 0 r i m 左右，强度为2 5 0 , - , 7 0 0 个h v ( s 锄2 ) 。6 0 年代以后，前苏联生理学家对生物系统的超微弱发光进行了全面的研 究。除了植物以外，他们还研究了动物组织的超微弱发光，例如青蛙的神经、肌肉，老 鼠的肝脏等，研究的样品多达9 0 余种，并将其转入应用e l l , 1 2 】。 7 0 年代以后，德国学者f a p o p p 等从实验和理论两个方面对生物的超弱发光进行 系统研究，他们研制了一台精度较高的生物超弱发光探测仪，采用循环冷却系统降低光 电倍增管的工作温度，以减少噪声，提高仪器的精度。他们的研究证实：d n a 是生物 超弱发光的一个辐射源，生物细胞间超弱发光具有一定的相干性，并提出生物超弱发光 与细胞间通讯有关的假设【1 3 】，并强调指出这是自然界普遍存在的一种现象，是生物体固 有的一种功能。 8 0 年代以后，超弱发光的研究已开始向细胞、亚细胞及分子水平深入。目前，国 际上研究生物超弱光子辐射问题的现状和发展趋势是：部分基础研究趋于成熟，正进入 大力发展生物超弱光子技术应用阶段。预计生物超弱光子技术近期将在医学、农业、食 品、环境科学等多领域得到重要应m t l 4 1 。 2 第1 章绪论 迄今，人们对超弱发光研究的结果可归纳为如下几个方面：( 1 ) 除极少数低级生物 如某些原生物和藻类外，大多数动植物均能自发地产生超微弱发光，但量子效率很低 ( 1 0 - 1 4 1 0 j 5 ) ，光子数强度很弱，生物进化程度越高，发光强度越大。( 2 ) 生物超微弱发 光的光谱从红外到紫外呈准连续谱，且波长随生物等级的升高而有一定的红移。( 3 ) 生 物超微弱发光强度与细胞的种类及其所处的代谢阶段有关，如正常细胞的延迟发光强度 随细胞浓度的增加而减少，而肿瘤细胞则相反。( 4 ) 外界因素对生物超微弱发光的影响 很大，如用不同浓度盐溶液处理的红豆种子的光子强度明显不同。( 5 ) “自由基”复合 反应和d n a 是超微弱发光的主要来源，断氧再给氧对萌发绿豆超弱发光的影响表明了 超微弱发光强度与活性氧自由基浓度正相关，有实验表明d n a 的构像变化对生物光子 的发射有影响。( 6 ) 生物光子具有非线性效应和高度的相干性。( 7 ) 生物超微弱发光是 生物固有的一种功能，它在细胞及组织间起传递信息的作用【1 5 】。 1 3 生物超微弱发光的机理 生物体在进行生理生化反应的过程中，处于基态的原子或原子团获得能量，其电子 从基态跃迁到激发态，处于激发态的原子或原子团不稳定，它将释放多余的能量回到基 态，能量的释放伴随有热、电离和光子的发射等，其中能量以光子形式释放的过程称为 生物的超弱发光。关于生物超弱发光机制的理论研究很多，可初步分为两大类。化学方 面主要有“代谢发光 机制，物理方面则以“相干辐射 机制为主。 1 3 1 “代谢发光”机制 “代谢发光 机制以光生物化学为基础，认为发光主要来源于氧化还原等代谢反 应，如脂肪酸氧化、酚和醛的氧化、h 2 0 2 的酶解、醌的氧化裂解、氨基酸的氧化等， 其中脂类自由基在超微弱发光中的作用尤为重要，因为在生物膜的磷脂中含有许多不饱 和脂肪酸，它们在一定条件下可以按照自由基锁链反应机制进行氧化反应，锁链反应的 特点是自由基在与其它分子反应后并不消失，而是转化为另一种自由基，因此，脂类锁 3 河北大学理学硕十学位论文 链氧化的过程包括在一自由基引导下，引发产生一脂自由基，然后此自由基继续发展， 并产生分支，从而产生更多的脂自由基，不饱和脂肪酸的氧化作用产生了过氧化自由基， 过氧化自由基复合时能形成处于激发态的过氧化物，其退激时即可产生超微弱发光。 “代谢发光”机制的实验依据来自多方面，小鼠肝脏微粒体的化学发光与脂类过氧 化的研究表明，脂肪酸的最大发光值或总发光值都与脂肪酸氧化酶呈线性关系；药物提 取物对超微弱发光和脂肪酸氧化酶有相似的抑制作用；脂肪酸氧化酶抑制荆 c 0 2 + m n 2 + h 9 2 + 和e d t a ( 乙二胺四乙酸) 等同样也抑制超弱发光【1 6 】。呼吸代谢抑制剂n a n 。 对萌发绿豆超微弱发光的抑制实验表明，萌发绿豆至少7 2 的超弱发光与呼吸作用等 氧化过程相关联，证明脂肪酸氧化是超弱发光的主要来源之_ 1 7 1 。 “代谢机制包括了活性氧生成与控制两个方面，能较好地解释自由基引起的超微 弱发光的可能性。然而，上述“代谢发光”机制并不能对生物超微弱发光的所有特点进行 解释，如：对生物超微弱发光的非线性效应、光子计数统计服从泊松分布、借助生物光 子细胞间的光通讯联络以及延迟发光不遵从指数而遵从双曲线衰减规律都无法解释；还 有对细胞有丝分裂时产生的超微弱发光，其波长在1 9 0 3 2 5 n m 的紫外波段，与代谢发光 的光谱范围( 4 5 0 7 0 0 n m ) 有所不同也不能解释。 1 3 2 “相干辐射”机制 以德国生物物理学家p o p p 为代表的小组从超微弱发光的物理机制出发，研究了生 物超微弱发光的光谱、光学透射性、光子计数统计和光照诱导的延迟发光的衰减动力学 以及生物超微弱发光与生物体的生理和病理过程的相关性和对生物体温度的依赖关系， 提出如下假说：一部分自发的和光诱导的生物超微马弓发光的光子( n t l “生物光子 ) ，起 源于生物系统内一个高度相干的电磁场，这种相干电磁场很可能是活组织内通讯联络的 基础，这就是生物光子的“相干辐射 机制( 又称“相干理论) 。 支持“相干辐射”机制的实验事实有：光子发射大体上不依赖于波长( 其相应激发态 的布居几率不服从玻尔兹曼分布) ；自发发光的非线性效应、延迟发光遵循双曲线规律 衰减、生物超微弱发光的光子计数统计接近于泊松分布。并且由细胞“视觉”的实验、小 鼠乳腺组织之间的光通讯实验也证实生物细胞之间确实可以通过生物光子进行通信联 4 第1 章绪论 络【2 1 。 近年来，各国学者在相干的生物光子领域又做了许多不懈的努力，在技术和实验研 究中取得一定进展。基于近年的实验数据的积累，生物光子学的相干理论也在突飞猛进 的发展。p o p p 对生物光子的信息特征、生化反应活性的作用，及生命体系的生长调节 和时空组织化与生物光子相干特性的关系作了深入探讨，认为生物光子是生长发育的 调节者，但生物光子发射强度变化并非单纯由生长速率变化所引起，如果存在有生物光 子的相干场，那么通讯效率就高很多，并指出了建设性干涉和破坏性干涉的信息和调节 意义。顾樵用量子理论的辐射场与声子库相互作用的模型系统来描写生物光子活性，用 3 种熵来表征有序度，成功地说明了树叶的光子具有比普通光源高得多的相干程度。 h y l a n d 依据f r o e m i c h 长程相互作用理论，解释了生物光子系统中的相干激发，并对脑 电图的有关数据，以及意识( c o n s c i o u s n e s s ) 和思维( m i n d ) 之间的关系进行了启发性的探 讨。当然，有关生物光子的理论，尚有待更多更坚实的实验来证实和确认【墙】。 “代谢发光 机制和“相干辐射 机制都只能解释部分超微弱发光现象，生命是一 种极其复杂的运动形式，每种生物都具有高度有序和复杂的结构，虽然生物超微弱发光 只是生物众多物理特性中的一个，但是它与生物的有序性及许多重要特性及其过程相关 联，包含着大量的生物学信息，产生机制非常复杂，目前人们对它的认识还具有一定的 局限性，仍需要在理论和实验两方面进行深入研究。 1 4 延迟发光的主要理论 芝 凝 ：譬 v 越 骥 紫 氍 o 毫1 2 尊绚箱北雒舶礴 ，f t m 轴 图l 为苔藓植物叶片经6 7 6 n m 红光照射后的延迟发光 5 0 年代初，s t r e h l e r 和a r o n l d 第一次发现绿色植物受光照后有发光现象，这种光 河北大学理学硕十学位论文 1 i , 量量量曼鼍曼罾量曼曼曼曼量量量皇曼曼曼皇曼曼曼量量量曼薯 诱导的发光叫做延迟发光( d l ) 1 9 1 。随着光探测灵敏度的提高，人们发现，延迟发光也 是所有活的生物都具有的共性。有人用苔藓植物( b r y o p h y l l ud a i g r e m o n t a n u m ) 的叶 片作了一个实验，图l 表示的是一种苔藓植物的叶片经波长6 7 6 n m 的红光照射后的延迟 发光，从图上可以看出：其延迟发光衰减不服从指数规律而是一条双曲线【2 0 】。这个实验 使人们开始探求延迟发光的机理。 延迟发光比生物的自发超弱发光在强度上高很多，便于探测，已成为研究许多生命 过程( 如癌变、植物种子的衰老) 的重要手段。生物系统受到光照后系统内形成了许多 激发态，如果任何一个激发态与激发态之间没有相互作用的话，激发态弛豫速率d n l d t ， 应该与激发态的数量力成正比，即 譬= 一砌( i - i ) = 一肘l d t 由此，延迟发光应服从指数衰减规律。如果激发态之间存在着相互作用，最简单的 情况可以写成 譬= 一4 刀2 ( i - 2 ) 出 1 式中的4 与1 1 式中的衰减常数k 一样，是一个常数。由i - 2 式得到一个服从双曲线规 律的延迟发光衰减动力学方程，即： 1 ( 0 = 4 7 ( t - t o ) 2( 1 3 ) 许多实验表明，生物系统的延迟发光一般遵从1 4 代表的双曲线衰减规律： l ( t ) = a ( t - t o ) 。1 7 ， ( 1 4 ) 若p = 1 2 ，1 4 式就变成l 一3 式，代表最简单的情形。人们发现，衰变参数p 依赖 于细胞的浓度，而它对浓度的依赖关系与细胞的癌变有关。这不仅表明延迟发光用于医 学诊断的潜在价值，而且说明细胞之间的相互作用与细胞本身的特性有关。生物延迟发 光的双曲衰减规律充分说明了生物系统内各个激发态分子之间是相互偶联的，它们很可 能通过在生物系统内存在的电磁场相互联系，而这正是相干场的重要特征。 生物的延迟发光与生物体内的细胞分裂、细胞死亡、光合作用、生物氧化、解毒作 用、肿瘤发生、细胞内和细胞间的信息传递与功能调节等重要的生命过程有着密切的联 系【2 1 , 2 2 1 ，通过对生物延迟发光的测量和分析就可以深入细致的了解这些生命过程，在此 第1 章绪论 基础上还可以利用各种手段( 物理的、化学的、医学的等) 人为地调节生物延迟发光以控 制生命过程，它作为一种极其灵敏的计时器已经开始用于各个领域，并有着很好的发展 前景。 延迟发光与光形态建成和光合作用等生长代谢过程密切相关。植物的延迟发光强度 万仅与其叶绿素含量有关，而且也与植物样品的光合作用强弱、细胞有丝分裂及生长代 谢程度有关。谭石慈等人发现：延迟发光与光合作用过程紧密联系，叶片延迟发光的直 接探测可能作为检测植物光合作用能力的一项指标，从而为检测植物光合作用的生化过 程以及光合效率提供一种新方法【冽；王维江、邢达等人通过对千日红花蕾、翠菊等植物 样品的研究发现：植物的延迟发光强度也与植物样品的光合作用强弱，细胞有丝分裂及 生长代谢有关，处于细胞有丝分裂活跃期的花瓣延迟发光较强，而成熟花瓣则由于细胞 有丝分裂缓慢或停止表现延迟发光很弱甚至没有【2 1 1 。另外，通过人们对延迟发光的实验 研究发现：红光或黑暗的条件不利于光合作用，使植物幼苗呈现黄化现象；红闪光对绿 豆幼苗叶片的生长不利，混合的( 红，绿，兰) 闪光对绿豆幼苗得生长也不利；蓝光明 显影响水稻幼苗的光合速率，使其远远低于普通白光下的光合速率；大豆和玉米在白光 下生长得最快；黄瓜在蓝光下生长较快【2 4 】。总之，延迟发光对农作物、花卉、蔬菜的生 长都有影响。 综上所述，延迟发光不仅与光合作用原初反应，电子传递以及光合磷酸化等过程有 密切关系，而且延迟发光本身也是伴随光合作用而产生的，所以通过研究延迟发光可以 反映光合作用中能量转化的一些状况。延迟发光在照光停止后的毫微秒到几分钟内都可 观察到，它反映了光合作用高能产物的暂时储存特性，当其回复反应时会重新布居叶绿 素的单线激发态【2 5 1 。另外，延迟发光还对植物的许多生理生化过程( 如叶片的生长和衰 老、气孔开闭、碳水化合物和蛋白质代谢及基因表达) 有显著的影响。根据已有的研究 结果，植物体内延迟发光的强度与植物细胞的生理状态密切相关，外界变化所造成的胁 迫会使发光强度增加。所以研究延迟发光对于了解外界激发光和植物细胞的生理状态之 间的关系有一定的借鉴意义。 7 河北大学理学硕十学位论文 1 5 生物超微弱发光的应用 生物超微弱发光研究的深入和发展为生命科学的研究带来新的动力和技术。光作为 一种现象，自有它的产生、变化、消亡过程，这个过程无时不在地反映着生命体内部的 生理状态，因而超微弱发光作为生命活动的一个特定指标在生物各个领域中得到较为广 泛的应用。事实上超微弱发光作为一种极其灵敏的指示器，已经开始用于医学、药理学、 农业、环境科学及食品学等领域中。 1 5 1 医学方面 超弱发光是人在正常和病理条件下生化代谢过程的一种反映，尤其与肿瘤的发生和 发展紧密相关，这种相关性可经过体液( 血液或尿液等) 直接检测。患者血清超弱发光水 平依肿瘤类型不同而不同，通过对人体血清发出的超弱发光的测量和分析可以非常准确 地诊断许多疾病，血清超弱发光水平作为一种灵敏的生物物理指标可作为肿瘤早期检测 和诊断依据之一【2 6 1 。 癌细胞与正常细胞的超弱发光相差很大，在癌症研究中有一个鉴别肿瘤和炎症的因 子是极其有用的：锣一p e e p e b p g h e p e o ，这里下标“o 和b 刀 分别相应于正常人和病人；e p e 表示由交流电诱发超弱发光所探测到的辐射强度，研究 结果得出：肿瘤患者彳为正，炎症患者，为负 2 7 1 。有研究表明：人肝癌h e p g 2 细胞 的超微弱发光强度明显高于人肝细胞株q z g ，细胞浓度及鲁米诺、双氧水浓度变化能 影响细胞超微弱发光强度，超微弱发光反映了肿瘤细胞的功能状态，检测肿瘤细胞超微 弱发光强度可作为一项敏感的肿瘤细胞生理及代谢指标哪! 。 利用超弱发光还可以检测病人对某些药物是否过敏。临床上常用察问病史，皮肤试 验，血清学和细菌学等方法来检验，这些方法不是信息不足，就是手续繁复。一种灵敏 而简便的方法是利用超弱发光。具体作法是：在患病者血清中加人待检的药剂，观察混 合物的超弱发光。研究发现：与健康人的超弱发光相比，不耐药病人的超弱发光比耐药 病人的超弱发光高，利用这种方法检测快速、准确、无损【2 7 1 。 第1 章绪论 1 5 2 药理学方面 在药理学研究中，超弱发光也是个极其灵敏的指示器。有研究发现：中毒肝素对 小麦是毒性物质，鱼精蛋白对于小麦芽体的肝素中毒具有良好的拮抗作用【2 3 】。还有人对 中药药性进行了检测，发现湿热性的中药其发光值高于寒凉的中药，同一属性的中药， 其药性强弱不尽一致【2 9 】。 1 5 3 农业方面 在农业上，人们试图用超弱发光作为一种耐盐碱、抗旱、抗热、抗寒乃至抗穗发芽 能力的指标，从而为抗逆性育种提供了一种新的灵敏的物理方法，具有广泛的应用价值。 在耐盐碱方面，用n a c l 溶液对种子进行盐分胁迫处理结果显示，高抗盐品种的发 芽率和超弱发光强度均高于敏感品种，耐盐苜蓿的发光值、代谢和生长速率无大的变化， 敏感品种则有显著改变，盐分胁迫将降低超弱发光强度【2 9 1 。在抗旱性研究方面：在干旱 条件下，抗旱性强的小麦种子的萌发速度和发光强度较高；而不抗旱的品种萌发受阻， 发光强度显著下降。在抗寒性研究方面：用玉米种子所做的实验表明，在低温条件下抗 寒性强的品种萌发时的超弱发光明显高于不抗寒的品种，而且幼苗根系的超弱发光和最 低温度发光点与品种的抗寒性有关；这种种子在低温萌发时所表现出的种间发光强度的 差异与品种抗寒性表现的一致性表明，测定种子的超弱发光可能是筛选抗寒性品种的有 效方法。有关抗热性的研究表明，植物超弱发光也是一种反映抗热性的有效的指标，有 报道指出，小麦、玉米和棉花种子萌发时超弱发光值随环境温度升高而增大，温度升高 到一定程度时，超弱发光出现峰值；此后，随着环境温度进一步提高，超弱发光值呈指 数下降，直至芽种死亡；超弱发光出现峰值时的温度称临界温度，根据临界温度的高低， 可以判断作物抗热性的强弱【5 】。另外，不同抗穗发芽能力小麦品种完熟期和贮藏期幼苗 的超弱发光强度有相同趋势，体眠期短的品种( 易带穗发芽) 中抗品种 抗性品种。因此， 籽粒超弱发光强度可作为鉴定和筛选抗穗发芽品种的依据【捌。 另外，生物超微弱发光还可用于选择最佳施用农药的剂量和时间。作物喷施农药以 后发光强度的变化比作物生长指标( 生长量、叶面积、同化器官的重量等) 的变化要快得 9 河北大学理学硕士学位论文 多。实验表明如果用5x1 0 4 m o l l 的除莠剂作用，叶重才有变化的话，那么5x1 0 8 m o l l 的除莠剂就可以引起超微弱发光强度的显著变化。这样就可以根据施药后发光强度的变 化程度来选择最佳的施药剂量和时间【l i 】。 1 5 4 环境监测和地震预报方面 用s 0 2 ，c o ，n o 处理后的毛白杨叶片的发光光谱与处理前明显不同，发光强度显 著增强，根据不同污染物处理叶片光谱分布不同，可以把叶片光谱的变化作为一种生物 物理指标，可以从各种气体污染中识别s c h 污染；生活于含苯的水环境中的斑马鱼、鲤 鱼肝微粒体的发光强度与其它方法测量的结果有一定的相关性，故可将超微弱发光应用 于监测水中的苯污染；生活在不同水质量中的莲花、兰花，在一定波长范围内有不同的 发光强度，通过检测这些指示植物的发光变化来检查外部环境的污染程度【1 1 1 。地震发生 前，大气中有些物质含量明显增加，使一些植物的超微弱发光明显变化，探测这一变化 可为地震预报提供依据【”】。 1 5 5 食品的检验方面 在食品检验中，超微弱发光测量可以作为一种对化学分析的补充方法。超微弱发光 的灵敏度非常高，甚至可以检测一些利用化学方法不能很好检测的食品。例如，利用超 微弱发光测量技术通过鸡下的蛋能很好的区分生活在不同的条件下的鸡，而且超微弱发 光测量技术对牛奶消毒方法( 巴氏消毒或高温消毒) 、牛奶脂肪量的区分是一种非常有效 的方法【3 2 1 。超微弱发光测量技术在检测辐照后含蔗糖的食品方面也有用武之地【3 3 】。另 外，超微弱发光还可以检验白酒的质量，超微弱发光的高低与酒中氧化剂的含量有关， 超微弱发光值高，说明氧化激烈，酒易变性【l l 】。 生物超微弱发光具有广泛的应用前景，应用的基本思想是将其作为微观生命活动的 一种宏观表现，这种表现必然与各种细微的生命过程相联系。通过对生物体超微弱发光 的测量和分析可以深入地认识这些生命过程，而且在此基础上还可能利用各种手段人为 l o 第1 章绪论 地调节生物体的超微弱发光，以控制生命过程。现在，生物超微弱发光作为一种极其灵 敏的生物指标，已经在医学、药理学、农业、环境科学和地震预报等领域显示了诱人的 应用潜力。但是也应该看到在生物超微弱发光研究中还有许多重要的问题没有解决。首 先，对生物超微弱发光的生物学机制，有人认为是细胞分裂发光，有人认为与脂质的过 氧化作用有关，还有人认为生物超微弱发光是自由基的产物；另外，从量子光学的角度 看，生物超微弱发光的光子统计应该包含着大量的生物学信息。真正起主要作用的是什 么，还需要进一步探索，如何通过生物超微弱发光的光子统计测量获得有实用价值的生 物学信息，乃是一个重要的理论和实际问题。 植物的超微弱发光是研究的热点，植物的超微弱发光可以提供细胞分裂、生长发育、 生物有序性以及植物受外界影响的程度等重要信息，为我们研究生命过程提供了一种直 观、灵敏、实时、无损的检测方法。本文采用生物超微弱发光探测技术对植物叶片的超 微弱发光进行测量，获得植物叶片不同生长时期超微弱发光的变化规律以及在不同激发 光照射下超微弱发光与叶片生理状态的联系，获得不同激发光对不同发育时期的叶片的 影响；进一步验证了生物超微弱发光与生物系统内部组织存在密切联系，为揭示生物超 微弱发光的特性和物理机理提供了依据；不同激发光对延迟发光的影响和延迟发光的光 谱特性都是集中在长波段，是有一定联系的，这种联系有待于进一步的研究。若能将延 迟发光与超微弱发光光谱分析、生物学机理及某些关键的生物学过程联系起来，有可能 开辟全新的研究领域。 河北大学理学硕十学位论文 第2 章实验仪器和测量方法 2 1 生物超微弱发光的主要检测方法 由于生物超微弱发光的强度极其微弱，所以必须使用背景噪声极低和探测灵敏度极 高的光电探测仪器才能进行有效的探测。8 0 年代后期，以光纤微通道板像增强器为主 的光子计数成像技术给生物超微弱发光的研究提供了新的探测方法。虽然用于生物超微 弱发光的探测仪器种类很多，但按照仪器的结构和性能可以归为两大类：一类是以光电 倍增管为主的单光子计数探测系统，可提供生物超微弱发光总强度的时域信息；另一类 是以微通道板像增强器为主的生物超微弱发光图像探测系统，具有二维光子计数成像功 能，可同时获得有机体生物超微弱发光强度的时间和空间信息。 2 1 1 单光子计数探测系统 图2 1 同步单光子计数探测系统结构简图 图2 - 1 是同步单光子计数探测系统结构简图【3 4 1 。生物样品放在样品池中，小盒放在 1 2 第2 章实验仪器和测晕方法 暗室里，干涉滤光片用来选择性地让生物发射的特定波长的光通过，斩波器( 遮光片) 用 来分隔由光电倍增管本底噪声引起的暗计数率和由信号引起的真实计数率，以便实现噪 声自动扣除，这样可大大提高测量系统的信噪比和灵敏度。由光电倍增管输出的脉冲经 三级快脉冲放大器放大，用恒比定时甄别器将小于单光子脉冲的噪声小脉冲过滤掉，再 送入计算机进行数据分析和记录。用光电倍增管进行光电探测的方法主要有：1 ) 测量 输出光电流中直流成份的d c 方法；2 ) 测量输出光电流中交流成份的a c 法；3 ) 单光 子计数( s p c ) 法；4 ) 同步单光子计数( s s p c ) 法。在弱光下，它们的信噪比性能排列为： d c a c s p c s s p c 。在弱光测量中常用的是后两种方法。本实验所用的生物超微弱发 光探测仪器就是同步单光子计数探测系统( 中国科学院生物物理所研制) ，其原理图和图 2 1 一致。 2 1 2 超微弱发光图像探测系统 图2 - 2 超弱发光图像探测系统机构简图 图2 - 2 是超微弱发光图像探测系统结构简图【3 5 3 6 1 。该系统由样品盒池、变焦物镜、 微通道板像增强器、中继镜、背向照明致冷c c d 探测系统、监控器、计算机及打印机 等部分组成。光电探测系统是以微通道板像增强器为核心的超高灵敏度成像系统。生物 样品经变焦物镜成像在微通道板像增强器的光阴极上，光阴极的光敏波长在3 5 0 8 5 0 n m 范围内，透过输入窗口到光阴极上的光子由于光电效应转换成电子图像，电子透 1 3 河北大学理学硕七学位论文 镜将电子图像耦合到微通道板上，在微通道板的光纤通道内，电子经过加速并不断和通 道壁撞击，每个入射电子便会产生1 0 2 1 0 6 个次级电子，并保持图像的空间分布信息， 从微通道板出射的电子撞击荧光屏，重新激发出光子图像，再经中继镜投射到致冷c c d 的成像平面上，数据经控制器采集到计算机里，配合信号图像增益修正和背景噪声扣除 等技术，由计算机对图像进行显示并结合图像处理技术提高测量系统的成像质量。该类 仪器常见的有用微通道板像增强器组成的光子计数成像系统( m i c ，英国) ，由三极微通 道板像增强器作为光子计数成像探测器和四象限位置敏感器组成的光子计数图像采集 系统( p i a s ，日本) ，多阳极微通道阵列式光子计数成像系统( m a m a ，美国) ，利用高速 数字自处理器实时探测光子坐标的光子计数成像系统( d s p ，法国) 等。这些测量系统的 共同点是都采用像增强器作光电转换和放大。光子坐标的探测方法分别采用了c c d 、 四象限位置敏感器、多阳极阵列和专用数字信号处理器等。 在研究生物的整体性超微弱发光时常用光子技术探测系统，而研究机体不同部位的 超微弱发光的差别时常用图像探测系统。因为我们主要研究生物的整体性，所以我们用 的是光子探测技术，即采用的是生物超微弱发光测量仪( b p c 卜4 ) 。 2 2 生物超微弱发光测量仪 图2 - 3b p c l _ 4 超微弱发光图像探测实验装置 采用由中国科学院生物物理所研制生物超微弱发光测量仪( b p c 卜4 ) 进行测量， 1 4 第2 章实验仪器和测量方法 一i