（食品科学专业论文）中国主要出口虾类的分子鉴定标记研究.pdf

k e ro f t h em a j o r c h i n a ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt oz h e j i a n gg o n g s h a n gu n i v e r s i t y w u z h i g a n g d i r e c t e db yp r o f e s s o rd a iz h i y u a n c o l l e g eo ff o o ds c i e n c ea n db i o t e c h n o l o g y z h e j i a n gg o n g s h a n gu n i v e r s i t y j a n u a r y , 2 0 1 0 1 1 课题来源 国家质检总局科研项目 ( 2 0 0 6 i k l 4 4 ) i i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获 得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 签名：0 洱日期= 砷l 萨( 月1 7 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文的 规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：辩导师签名： 眺砂年f 月矿日 i v 目录 摘 要一1 a b s t r a c t 4 第一部分文献综述7 第一章概论7 1 1 中国主要虾类的生物学分类、特征、习性与分布7 1 2 全球虾类捕捞与养殖概况1 3 1 3 虾产品国际贸易状况15 第二章d n a 分子标记技术在虾类研究中的应用1 7 2 1 分子标记的种类及特点1 7 2 2 常用d n a 分子标记技术一l 7 2 2 1 限制性片段长度多态性1 7 2 2 2 随机扩增多态性18 2 2 3 简单重复序列多态性1 9 2 2 4 简誓序列重复间区d n a 标记2 0 2 2 5 扩增片段长度多态性2 0 2 2 6 核糖体基因间隔序列2 卜 2 3 虾类分子鉴定技术的研究进展一2 3 2 4 虾类遗传种质资源的研究进展2 4 2 5 课题的研究意义2 6 2 5 1 进出口贸易的要求2 6 2 5 2 种质资源保护的需求2 6 2 6 研究技术路线及预期研究结果2 7 2 6 1 核糖体基因间隔序列( i t s ) 研究方法2 7 2 6 2 扩增片段长度多态性( a f l p ) 研究方法2 7 2 6 3 预期研究结果2 9 2 7 本研究的意义与创新2 9 第二部分实验研究部分31 第三章中国主要出口虾类核糖体基因间隔序列( i t s ) 分析3 卜 3 1 材料与方法31 v 3 1 1 虾样品收集一3l 一 3 1 2 实验仪器与试剂3 3 - 3 1 3 基冈组d n a 提取3 4 3 1 4p c r 扩增- 3 5 3 1 5i t s l 序列测定一3 6 - 3 1 6i t s i 序列的系统进化分析3 7 - 3 1 7i t si 的r f l p 分析一3 8 - 3 2 结果与分析一3 8 3 2 1 虾d n a 的提取3 8 - 3 2 2 虾i t s 区的p c r 扩增及测序- 3 8 - 3 2 3 同一虾个体内i t s l 序列变异分析4 6 - 3 2 4 同一虾品种的不同群体i t s 遗传多样性分析一4 7 3 2 5 不同虾品种之间i t s i 序列的变异一4 8 3 2 6 对虾科对虾属品种的遗传进化分析一4 8 - 3 2 7 部分虾品种的i t s i 序列和r f l p 分析一4 8 3 3 小结与讨论一5 2 - 第四章中国主要出口虾类扩增片段长度多态性( a f l p ) 分析一5 5 4 1 材料与方法一5 5 4 1 1 实验材料- 5 5 4 1 2 实验仪器与试剂- 5 5 - 4 1 3 虾基因组d n a 提取- 5 6 4 1 4 模板d n a 纯度及浓度检测- 5 6 4 1 5d n a 双酶切、连接反应- 5 6 4 1 6 预扩增反应( p r e s e l e c t i v ep c r ) 一5 7 4 1 7 选择性扩增体系( s e l e c t i v ep c r ) 一5 8 4 1 8 毛细管电泳检测体系一5 8 - 4 1 9 数据收集和分析- 5 9 - 4 2 结果与分析一6 0 一 v i 4 2 1 虾基因组d n a 提取质量6 0 4 2 2 酶切连接结果6 0 4 2 3 预扩增结果一6 0 4 2 4 选择性扩增结果6 1 4 2 5 毛细管电泳检测结果6 l - 4 2 6 内标( m a i e r ) 稳定性一6 3 4 2 7 引物的稳定性6 3 4 2 8a f l p 标记对不同虾的种问鉴别效率一6 3 - 4 2 9 a f l p 标记对同种虾内不同个体的鉴别效率一6 5 - 4 2 1 01 2 对a f l p 引物对不同虾的扩增产物的多态性分析- 6 5 - 4 2 1 la f l p 指纹图谱对不同虾的鉴别效率6 6 - 4 2 1 21 2 对引物对不同虾的扩增多态性比较6 6 4 2 1 3 系统聚类分析6 8 4 3 小结与讨论7 卜 第五章我国沿海凡纳对虾养殖群体的a f l p 遗传变异分析7 3 - 5 1 材料与方法7 3 5 1 1 样品来源7 3 5 1 2d n a 提取7 5 5 1 3 酶切链接反应一7 5 5 1 4 预扩增反应- 7 5 5 1 5 选择性扩增反应- 7 6 - 5 1 6 毛细管电泳检测体系- 7 6 5 2 结果与分析一7 8 5 2 1 我国养殖凡纳对虾的遗传多样性7 8 5 2 2 不同凡纳对虾养殖群体之间遗传变异8 0 5 2 3 凡纳对虾群体的聚类分析8 0 5 2 4 凡纳对虾个体的聚类分析8 2 5 3 小结与讨论8 4 v i i 8 4 。8 4 一 8 5 8 5 。8 7 。8 7 6 2 基于a f l p 标记和i t s 序列的系统聚类分析比较8 8 6 3 下一步的工作计划和展望一8 9 附件i ： 本研究涉及各种虾类形态图谱9 8 附件i i ：作者简历10 2 v i l l 表格目录 表1 - 1 十足目三种分类系统对照8 t a b l el - 11 1 1 ec o m p a r s i o no f t h r e ec l a s s i f i c a t i o ns y s t e mo fd e c a p o d a - 8 一 表l - 2 世界主要养殖虾品种及产量1 4 t a b l e1 - 2t h ei m p o r t a n tc u l t u r e ds h r i m ps p e c i e sa n dp r o d u c t i o n - 1 4 一 表3 - 11 1 个实验虾样品的分类，采集地点和i t s i 长度3 2 t a b l e3 一lt a x o n o m y , c o l l e c t i o ns i t e s a n dl e n g t ho f l t s 一1o f e l e v e np e n a e u ss p e c i e su s e di nt h i ss t u d y - 3 2 一 表3 - 2 对虾科对虾属5 种不同虾品种的微卫星序列多态性分析3 9 t a b l e3 - 2m i c r o s a t e i l i t ep o l y m o r p h i s m so ff i v es h r i m ps p e c i e si np e n a e u s - 3 9 - 表3 3 四种虾i t s 长度及预期的三种限制性内切酶酶切图谱- 4 9 t a b l e3 3s i z eo fr e s t r i c t i o nf r a g m e n t se x p e c t e dt ob ep r o d u c e db yt h es e l e c t e de n z y m e s - 4 9 表4 1 样品来源及分类5 6 t a b l e4 - lt h es o u r c ea n dc l a s s i f i c a t i o no fs a m p l i n g 。- 5 6 - 表4 - 2 预扩增及选择性扩增引物序列5 7 t a b l e4 - 2s e q u e n c e so f t h ep r e s e l e c t i v ea n ds e l e c t i v ea m p l i f i e dp r i m e rc o m b i n a t i o n s - 5 7 - 表4 3 “对a f l p 引物组合列表5 8 t a b l e4 - 3l i s to f 6 4p r i m e rc o m b i n a t i o n si na f l p a n a l y s i s - 5 8 - 表4 4 不同a f l p 引物组合对虾的扩增多态性6 6 t a b l e4 - 4p o l y m o r p h i s mo f p e n e a u sr e v e a l e db yd i f f e r e n ta f l pp r i m e rc o m b i n a t i o n s - 6 6 - 表4 - 51 2 对引物对不同虾的扩增多态性比较6 7 t a b l e4 - 5c o m p a r i s o n so f p o l y m o r p h i s mo f p e n e a u sr e v e a l e db y1 2a f l p p r i m e r s 6 7 - 表4 - 6 遗传一致度( 上) 和遗传距离( 下) 矩阵一7 0 一 t a b l e4 - 6g e n e t i ci d e n t i t y ( u p ) a n dd i s t a n c em a t r i x ( d o w n ) - 7 0 - 表5 1 供试材料及来源7 4 一 t a b l e5 1t h es o u r c e so f t e s t e dp o p u l a t i o ni n d i v i d u a l so f p v a n n a m e i 一7 4 - 表5 - 2 不同a f l p 引物组合对户v a n n a m e i 的扩增多态性7 9 t a b l e5 - 2p o l y m o r p h i s mo f p v a n n a m e ir e v e a l e db yd i f f e r e n ta f l pp r i m e rc o m b i n a t i o n s - 7 9 表5 3 凡纳对虾养殖群体间遗传多样性的a f l p 分析( 1 2 对引物) 8 1 - t a b l e5 - 3p o p u l a t i o ng e n e t i cd i v e r s i t yo f p v a n n a m e ib a s e do na f l pa n a l y s i s ( 1 2p r i m e rc o m b i n a t i o n s ) 一8 1 表5 - 4n e i s 遗传一致度( i ) ( 表右上角) 和遗传距离( d ) ( 表左下角) - 8 l - t a b l e5 - 4n e i sg e n e t i ci d e n t i t y ( a b o v ed i a g o n a l ) a n dg e n e t i cd i s t a n c e ( b e l o wd i a g o n a l ) a m o n gp v a n n a m e i l hp o p u l a t i o n - 8 1 - 表5 5 凡纳对虾不同养殖群体的分子方差分析8 4 t a b l e5 - 5a m o v a a n a l y s i so f p v a n n a m e if r o md i f f e r e n tf a r m e dp o p u l a t i o n s - 8 4 - i x 插图目录 图2 - 1a f l p 的一般过程2 2 f i g 2 - 1g e n e r a lp r o c e s sf o ra f l p 2 2 图2 - 2r d n a 示意图一2 3 f i g 2 - 2s k e t c hm a po fr d n a 2 3 图2 - 3a f l p 对不同虾类鉴别及系统亲缘关系分析2 8 f i g 2 - 3a n a l y s i so fp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pa n dd i s c r i m i n a t i o nf o rd i f f e r e n ts h r i m ps p e c i e su s i n ga f l p - 2 8 - 图2 _ 4a f l p 对同一虾品种的不同地理群体的遗传变异水- 、f 和群体遗传分化分析2 8 f i g2 - 4g e n e t i cv a r i a t i o nl e v e la n dd i v e r s i t ya m o n gd i f f e r e n tg e o g r a p h i c a lp o p u l a t i o n so f t h es a m es h r i m p s p e c i e su s i n ga f l p 2 8 图3 - l 样品采集地3 3 f i g 3 lt h es o u r c e so f t h es a m p l i n g 。一3 3 一 图3 - 2 各种虾样品基因组d n a 提取结果3 9 f i g 3 - 2t h eg e n o m i cd n a e x t r a c t e df r o ms h r i m ps a m p l e s - 3 9 一 图3 3 各种虾样品i t s i 的p c r 扩增结果4 0 f i g 3 - 3t h ei t s ia m p l i c o n so f a l lt e s t e ds h r i m ps a m p l e s 一4 0 图3 - 4 日本对虾( p j f j d s ) 的测序图谱4 6 f i g 3 - 4t h ei t s ls e q u e n c eo f p e n a e u s j a p o n i c u s ( p j f j d s ) 4 6 图3 5 用n j 法构建基于i t s l 的供试对虾科对虾属备品种系统进化树分析5 0 f i g 3 5n e i g h b o u r - j o i n i n gt r e eb a s e do np h y l o g e n e t i ca n a l y s i so ft h e18 s - i t si 一5 8 sr d n as e q u e n c e s s h o w i n gt h er e l a t i o n s h i p so f p e n a e u ss h r i m ps p e c i e s - 5 0 - 图3 - 6 四种虾的i t s lp c r 产物经a f ai ，h h ai 酶切后结果5 卜 f i g 3 - 6p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m e r i s mr e s u l t so fi n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e rla m p l i c o nf r o m4s h r i m pu s i n gr e s t r i c t i o ne n z y m e sa f ai ( 1 e f t ) a n dh h ai ( r i g h t ) - 51 一 图3 - 7 四种虾的i t s lp c r 产物经n a e1 ，x s p1 酶切后结果5 l - f i g 3 - 7p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m e r i s mr e s u l t so fi n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e rla m p l i c o nf r o m4s h r i m pu s i n gr e s t r i c t i o ne n z y m e sn a ei ( 1 e f t ) a n dx s pi ( f i g h t ) 一51 一 图4 - 1 虾样品基冈组d n a 琼脂糖电泳图谱6 0 f i g 4 - la g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so f g e n o m i cd n ao f p e n a u e s - 6 0 - 图4 - 2 虾d n a 酶切连接后琼脂糖扩增电泳图谱6 1 - f i g 4 - 2a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so fg e n o m i cd n ad e a l e dw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m o l y s i sa n d c o n n e c t i o nr e a c t i o n 61 图4 3 预扩增电泳图谱6 卜 f i g 4 - 3e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so f p r e s e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n 6 1 图4 - 4 选择性扩增结果6 2 f i g 4 - 4e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so fs e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n 6 2 x 图4 5 不同引物组合对凡纳对虾样品的扩增电泳图谱6 2 f i g4 5e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so f p e n a u e sv a n n a m e ir e v e a l e db yd i f f e r e n tp a l m e rc o m b i n a t i o n s - 6 2 - 图4 _ 6 内标的稳定性测试电泳图谱6 3 f i g 4 - 6e i e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n sf o rs t a b i l i t yo fi n t e r n a ls t a n d a r d s - 6 3 - 图4 - 7a f l p 引物的扩增稳定性电泳图谱“ f i g 4 - 7e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so fa m p l i f i e dr e p e a t a b i l i t yf o ra f l pp r i m e rc o m b i n a t i o n - 6 4 - 图4 - 8a f l p 标记对不同虾的种间鉴别电泳图谱6 4 f i g 4 - 8e l e c 仃o p h o r e s i sp a t t e r n sf o ri d e n t i f i c a t i o no f a f l pm a r k e ro f t h ed i f f e r e n ts h r i m ps p e c i e s 6 4 - 图4 - 9 a f l p 标记对同种虾内不同个体的鉴别电泳图谱6 5 - f i g 4 - 9e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n sf o ri d e n t i f i c a t i o no f a f l pm a r k e ro f t h es a m es h r i m ps p e c i e s 一6 5 图4 1 0 对虾科不同属虾样品的系统聚类图6 9 f i g 4 1 0p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so f d i f f e r e n tg e n u si np e n a e u s 。- 6 9 - 图5 18 个凡纳对虾群体的地理分布7 4 f i g 5 - lt h eg e o g r a p h i c a ld i m e n s i o n a l i t yo f t h ee i g h tpv a n n a m e ip o p u l a t i o n - 7 4 图5 - 2 凡纳对虾群体a h 的基冈组d n a 电泳图谱7 5 f i g 5 - 2e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so fg e n o m i cd n ao fp v a n n a m e ia - h 。一7 5 - 图5 3 凡纳对虾群体a h 的基冈组酶切连接电泳图谱7 5 f i g 5 3a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sp a r e m so fg e n o m i cd n ao fp v a n n a m e ia hd e a l e dw i t hr e s t r i c t i o n e n z y m o l y s i sa n dc o n n e c t i o n 7 5 图5 - 4 凡纳对虾群体a h 的预扩增电泳图谱7 5 f i g 5 - 4e l c t r o p h o r e s i sp a a e m so fp v a n n a m e ia - ha f t e rp r e - s e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n - 7 5 - 图5 - 5 凡纳对虾群体a h 的选择性扩增琼脂糖电泳图潜( p 4 5 引物) 一7 6 f i g 5 5e l e c t r o p h o r e s i sp a u e m so fp v a n n a m e ia - ha f t e rs e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n ( p 4 5p r i m e rc o m b i n a t i o n ) 一7 6 - 图5 - 6 凡纳对虾群体a h 的选择性扩增琼脂糖电泳图谱( p 6 1 引物) 一7 6 - f i g 5 - 6e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so fp v a n n a m e ia - ha f t e rs e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n ( p 6 1 p r i m e rc o m b i n a t i o n ) - 7 6 - 图5 7 凡纳对虾群体a h 的选择性扩增毛细管电泳图谱( p 2 5 引物) - 7 7 f i g 5 - 7c a p l i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i so fpv a n n a m e ia - ha f t e rs e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n ( p 2 5p r i m e rc o m b i n a t i o n ) - 7 7 图5 8 凡纳对虾群体a h 的选择性扩增毛细管电泳图谱( p 5 2 引物) 一7 8 f i g 5 - 8c a p l i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i so fp v a n n a m e ia - ha f t e rs e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n ( p 5 2p r i m e rc o m b i n a t i o n ) - 7 8 一 图5 - 9 基于n e i s 遗传距离的凡纳对虾养殖群体的u p g m a 聚类关系图8 2 f i g 5 - 9u p g m ad e n d r o g r a mf o re i g h tc u l t i v a t e dp o p u l a t i o n so f p v a n n a m e ib a s e do nn e i sg e n e t i cd i s t a n c e - 8 2 图5 1 0 基于n e i s 遗传相似性系数的8 8 个凡纳对虾个体的u p g m a 聚类图8 3 f i g 5 - 1 0u p g m a p h y l o g e n e t i cc l u s t e ro f 8 8i n d i v i d u a l so f p v a n n a m e i b a s e do nn e i sg e n e t i cs i m i l a r i t y - 8 3 - 附图l 凡纳对虾9 8 s u p p l e m e n t a r yf i g 1p e n a e u sv a n n a m e i - 9 8 - x i 附图2 日本对虾9 8 s u p p l e m e n t a r yf i g 2p e n a e u s j a p o n i c u s 9 8 附图3 宽沟对虾9 9 s u p p l e m e n t a r yf i g 3p e n a e u sl a t i s u l c a t u s 9 9 附图4 哈氏仿对虾9 9 s u p p l e m e n t a r yf i g 4p a r a p e n a e o p s i sh a r d w i c k i i - 9 9 - 附图5 刀额新对虾9 9 s u p p l e m e n t a r yf i g 5m e t a p e n a e u se n s i s - 9 9 - 附图6 鹰爪虾1 0 0 s u p p l e m e n t a r yf i g 6t r a c h y p e n a e u sc u r v i r o s t r i s - 10 0 - 附图7 戴氏赤虾10 0 s u p p l e m e n t a r yf i g 7m e t a p e n a e o p s i sd a l e l - 10 0 - 附图8 中华管鞭虾1 0 0 s u p p l e m e n t a r yf i g 8s o l e n o c e r ac r a s s i c o r n i s - 10 0 一 附图9 罗氏沼虾101 s u p p l e m e n t a r yf i g 9m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i - 101 - 附图l o 日本沼虾1 0 1 s u p p l e m e n t a r yf i g 10m a c r o b r a c h i u mn i p p o n n e n s i c 101 - 附图l l 克氏原螫虾1 0 1 s u p p l e m e n t a r yf i g ? l 、p r o c a m b a r u sc l a r k i - 1 0 1 - x l l 摘要 虾的种类繁多，仅联合国粮农组织( f a o ) 列出的具有商业或具有潜在商业价值 的虾就有3 0 0 多种，为重要的经济水产品之一。据f a o 统计，全球每年捕捞和养殖 虾的产量约为6 0 0 万吨，其中约6 0 进行国际贸易。目前虾产品年出口值超过1 4 0 亿美元，占渔业总出口值的1 6 ，在国际贸易中具有重要地位。当前，中国沿海养 殖和捕捞( 含海水和淡水) 的虾主要有斑节对虾( p e n a e u s m o m