（食品科学专业论文）L阿拉伯糖异构酶的酶学性质及酶法制备塔格糖研究.pdf

摘要 摘要 塔格糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀少糖的一种，稀少糖是指 在自然界存在但含量极少的一类单糖。塔格糖是果糖的“差向异构体”，在分子水平上， 除了第四个碳原子上的羟基和氢基团倒置外，d 一塔格糖与d 果糖的结构是一样的。塔格 糖的甜度是蔗糖的9 2 ，甜味与蔗糖相似，不产生不良风味和后味，是一种很好的甜味 剂。经过测试发现塔格糖没有毒性和致癌效应，在食品工业上可以安全使用。与蔗糖相比 塔格糖具有许多优点：低热量，塔格糖在体内只有2 0 被小肠吸收：同时具有抗龋齿、 降血糖，改善肠道菌群及良好的理化性质等。塔格糖作为一种具有保健功能的新型甜味剂， 将会拥有广阔的市场前景。 考虑到实验中数据的采集和处理，需要建立一种简便快速，有效地测定酶活力的方法。 根据d i s c h e 所介绍的半胱氨酸咔唑法，对塔格糖含量的测定条件进行了研究，确定了简 便快捷，重现性好的测定方法。 本实验室筛选得到的一株乳酸菌上口c 加6 a c f ，淞s k l 0 0 2 能产l 邛可拉伯糖异构酶，本文 对s k l 0 0 2 菌株的发酵条件进行了优化，确定发酵优化条件为( 叽) ：麦芽糊精2 8 ，酵母 膏1 0 ，玉米粉浆2 2 ，无水乙酸钠1 0 ，k 3 p 0 4 0 2 ，n a c lo 0 1 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 ，m n s 0 4 2 h 2 0o 0 5 ，l 阿拉伯糖2 5 。发酵初始p h8 4 ，培养温度3 7 ，接种量3 ， 培养时间1 2 h 。在此发酵条件下，酶活达到了72 8u m l 。 l 一阿拉伯糖异构酶为胞内酶，对三o c ，0 6 d c f ，“ss k l0 0 2 所产的l 邛可拉伯糖异构酶进行 粗酶提取及初步纯化。细胞超声波破碎1 0 m i n ( 冰浴，功率2 0 0 w ) ，离心除去菌体碎片 ( 9 6 0 0 r p m ，1 0 m i n ) ，上清液即为粗酶液。粗酶液先后通过硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、 得到初步纯化的l 邛可拉伯糖异构酶。 对初步纯化的l 一阿拉伯糖异构酶的酶学性质进行了研究。l 邛可拉伯糖异构酶粗酶的 最适反应温度和p h 分别为6 0 和7 o ；在p h 4 o 8 o 的范围内和3 0 6 0 下具有较好的 稳定性。“+ 、m n ”、m g ”、f e 2 + 等离子对l 邛可拉伯糖异构酶有激活作用，其中m n 2 + 的激 活作用尤其显著，而b a ”、z n 2 t 、c u 2 + 、s d s 对l - 6 可拉伯糖异构酶有抑制作用，其中b a 2 十、 z n ”的抑制作用显著，使酶完全失活。转化半乳糖的k m 为1 1 9 3 9 3 m m o i l ，v 。为 1 3 5 1 p g m i n 。 本文还对l 5 可拉伯糖异构酶生物合成塔格糖的工艺进行了初步探讨。用l - 5 可拉伯糖 异构酶的粗酶、1 0 和4 0 的湿重细胞转化生成塔格糖，最适半乳糖浓度0 8 3 m o l 几，4 0 的湿重细胞反应7 2 h 后，转化率达到3 8 9 1 。最后通过红外光谱测定，证明l 邛可拉伯糖 异构酶转化半乳糖生成的产物为塔格糖。 关键词：乳酸菌，l 阿拉伯糖异构酶，塔格糖 江南大学硕：l 学位论文 a b a t r a c t d 一切g a t o s e ，ar a r en a t u r a lh e x o k e t o s e ，i so n eo ft h er a r es u g a r s ，w h i c ha r ed e f i n e da s m o n o s a c c h a r i d e sa n dt h e i rd e r i v a t i v e sm a tr a r e l ve x i s ti nn a t i 鹏0 nam o l e c u l a rl e v e l d - t a g a t o s ei ss m l c t i l r a l l yi d e n t i c a lt od f 砘c t o s e ，e x c e p tf o ra ni n v e r s i o no ft h eh y d r o x y la 1 1 d h y d r o g e ng m u p sa tt h ef o u r t hc a r b o na t o m t h es w e e t n e s so fd t a g a t o s ei s9 2 m a to fs u c m s e 、v i t l las i m i l a rt a s t e i th a sb e e nt e s t e dt h a td t a g a t o s ec a nb eu s e di nf o o di n d u s t n rg r a s d t a _ 髀t o s eh a sl o wc a l o r i cv a l u e ，i na d d j 石o n ，“c a np r e v e n tt o o t l ld e c a y h a sn oe 丘b c to n p l a s m ag l u c o s el e v e l s ，i m p m v eh e a l t l l yb a c t e r i 啪f o rt h e s er e a s o n s ，d t a g a t o s eh a sr e c e i v e d i n t e r e s tr e c e n t l ya san o n - c a l o r i cs w e e t e n e rs u b s t i t u t ef o rs u c r o s e i t i sv e r yi m p o n a l l tt oe s t a b i i s haf 酤t ，c o n v e n i e ma 1 1 de 丘c c t i v em e m o df o rd a t ap r o c e s s i n 2 a c c o r d i i l gt ot h ec y s t e i n e c a r b a z o l et e s ti n t r o d u c e db yd i s c h e ，w es t u d i e dt e s tc o n d i t i o n sa n d s e tu pas i m p l ea i l dc o n v e n i e n t ，r e l i a b l em o m o r d as t r a mo f 口c f 0 6 口c 删k js k l 0 0 2w h i c hc a nd r o d u c el a r a b i n o s ei s o m e r a s ew a ss t o r e di no l l r l a b o r a t o r v tt h ee a b c to fn 喇e n t sa i l do t h e rc u l n l r a lc o n d i t i o n so nt l l el a r a b i n o s ei s o m e r a s e w e r es t u d i e d t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o n sa n dc u l t u r a lc o n d m o n sw e r e ( 2 l ) ： m a l t o d e x 岫n2 8 ，y e a s te x t r a c t1 0 ，c o ms t e e pl i q u o r2 2 ，c h 3 c o o n a1 0 ，k 3 p 0 4 0 2 ，n a c l0 0 l ， f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 ，m s 0 4 2 h 2 0o 0 5 ，l - a r a b i n o s e 2 5t h eo p t i m 啪 f 锄e n t a t i o nc o n d i t i o n s 、v e r ei n i t i a lp h8 4 ，c u l t i v a t et e m p e r a t l l r e3 7 ，i n o c u l a t i o nv o l m e3 ， f e 衄e n 诅t i o nt i m e1 2 h t h ee n z v i l l ea c t i v i t vr e a c h e d7 2 8u ，m l t h ec e l l sw e r ed i s r u p t e db ys o n i c a t i o na i l dc e m r i f u g e d ，山es u p e m l a t a mw a sf i l r t h e r p u r i 矗e db ya 砌o n j 啪s u l f a t e 舶c t i o n a t i o n ，d i a i y s j s p j r o p e n i e so f 出el a r a b i n o s ei s o m e r a s e w e r ea l s os t u d i e d t h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e m t u r ea 1 1 dp ho fl 一啪b i n o s ei s o m e m s ew e r e6 0 a n d7 o ，r e s p e c t i v e l mt h ee n z y m ew a ss t a b l ew i t h i np h4 o 一8 ou n d e r3 0 6 0 t h e a d d i t i o no fm n 2 + ，m 一+ ，f e z 十i o n se 1 1 l l a l l c e dt l l ee i l z y m ea c t i v i 饥，h e r e a s 廿1 ea d d i t i o no fb 一+ ， z n 肘i o n si n h i b i t e d “c o m p l e t e l yw i t hd g a l a c t o s ea ss u b s t r a t e ，k m = 1 1 9 3 9 3 m m o l l ， v 。x - 1 3 5 l “m 证 d t a g a t o s ew a si s o m e r i z e d 疔o md g a l a c t o s eu s i n gl - a r a b i n o s ei s o m e r a s ei nt h r e ef o m l s ： c e l l 一疗e ee n 巧m e ，l oa n d4 0 ( w w ) w e tw e i g h tw h o l e c e l l e f f b c t so ft e m p e r a m r e ，e n 纠m e ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dr e a c t i o nt i m eo nt h ed g a l a c t o s ec o n v e r s i o nr a t i ow e r ed e t e h n i i l e d t h es u b s t r a t ec o n c e n 仕a t i o nw a sf o u n dt ob eo p t i m a la t0 8 3 3 m o l l ah i g h e rc o n v e r s i o ny i e l d o f3 8 9 ( w r w ) 、v a so b t a i n e da r e ra b o u t7 2h o u r sb yu s i n g4 0 ( w w ) w e tw e i g h tw h o l e c e l l f i n a l l y ，b yf t - i rs p e c t m m e t e rt e s t ，w ec o n 靠m l e dt h a tl - a r a b i n o s ei s o m e m s em e d i a t e dt h ei s o m e r i z a t i o n o f d g a i a c t o s ei n t od 协g a t o s e t h ep r o d u c t i o no f t h eb i o c o n v e r s i o nw a sd 也g a t o s e k e ”v o r d s ：三口c 加6 口c f ，f 搬，l a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，t a g a t o s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 盆聋量日期：以年6 月少日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：坌盗茎： 导师签名： 日期：加5 孑各稚 召纠d 年自日| jb 第一章绪论 1 1 稀少糖简介 第一章绪论 糖的生产可以追溯到公元1 7 世纪，从那时起制糖工业发展迅速。到2 0 0 2 年，全球的 糖产量达到每年1 3 3 亿吨。随着食品、甜食、软饮料中糖的添加量的增加，健康问题也 越来越受到人们的关注，糖尿病、肥胖、癌症和心血管疾病患者每年都在增加。但是甜味 又是人们十分喜爱，日常饮食中不可能缺少的一种调味，如何让人们在享受甜味的同时远 离疾病已成为当今关注的热点。木糖醇的成功应用，使得寻找传统甜昧剂的替代品成为可 能。木糖醇是一种五碳多羟化合物，具有对人体有利的性质，如防止龋齿和治疗儿童中耳 炎等。 木糖醇是一种稀少糖，国际糖协会( i s r s ) 对稀少糖的定义为“在自然界存在但含量 极少的一类单糖及其衍生物”【2 】0 淀粉、乳清粉、半纤维素等都可以作为工业化生产稀少 糖的原材料，从这些原材料中得到的d 一果糖、d 一半乳糖和d 一木糖等一系列单糖，可以应 用于稀少糖的生产j 。 理论推测自然界约存在5 0 种稀少糖，到目前为止已发现有3 4 种稀少糖，l 一型和d 一型 各占一半。主要研究的为d 一型稀少糖，而多数稀少糖的结构和功能仍没有研究清楚。 图卜1可生产稀少糖的四糖、五糖、六糖的树形图 坚塑查兰堡主堂垡堡奎 各种稀少糖的生产方法需要运用各种学科的知识，包括发酵技术、分子生物学、酶技 术和生物化学【2 j 。首先对生物催化剂进行分离纯化，然后寻找从可以方便获得的原材料( 淀 粉、乳清粉) 中大量生产稀少糖的方法，最后研究这些稀少糖对人们的日常生活和健康有 利的性质。稀少糖的各种新颖的生理学功能已经被发现，例如d 一阿洛糖能有效抑制活性氧 元素的产生，这可以应用于医药研究。稀少糖具有能应用广泛的特征【2 】。 1 2 功能性甜味剂 1 2 1 功能性甜味剂的定义 除营养( 一次功能) 和感觉( 二次功能) 之外，还具有调节生理活动( 三次功能) 的 食品称为功能性食品，进一步明确定义为“其成分对人体能充分显示身体防御功能、调节 生理节律以及预防疾病和促进康复等有关身体调节功能的工程化食品”【3 1 。 相对应于“功能性食品”( f i l l l c t i o n a lf o o d s ) 而出现的“功能性甜味剂”( f l l i l c t i o n a l s w e e t e n e r s ) 可定义为“具有特殊生理功能或特殊用途的食品甜味剂”，也可理解为“可代 替蔗糖应用在功能性食品中的甜味剂”【4 】。它包含两层含义： ( 1 ) 最基本的，对健康无不良影响的，解决了多吃蔗糖无益于身体健康的问题。 ( 2 ) 更高层次的，对人体健康起有益的调节或促进的作用。 作为一种理想的功能性甜味剂，需要同时具备：在机体中的代谢途径与胰岛素无关， 进入体内后不会引起血糖波动，可供糖尿病人食用：不是口腔微生物的适宜作用底物，不 会引起牙齿龋变，甚至具有抗龋齿活性：具有某些特殊的生理功能，如促进机体肠道中双 歧杆菌的生长繁殖；绝对的食用安全性；良好的味觉特性，无不良口味或后昧；适宜的溶 解度与稳定性，以便在食品工业中的应用：价格适宜，生产成本不能太高等条件。且还需 具备以下三点之一： ( 1 ) 不参与机体代谢，进入体内后将原原本本地排出体外，能量值为零。 ( 2 ) 不被机体消化吸收，代谢方式类似膳食纤维，能量值很低或为零。 ( 3 ) 虽可完全被机体消化吸收，但甜度较大或很大，在正常摄入范围内所提 供的能量值较低或很低。 然而，目前人们已发现的所有功能性甜味剂。尚没有一种能达到这种理想化的要求。 因此，人类对功能性甜味剂的研究与探索，仍在继续进行中。 1 2 2 功能性甜味剂的分类 根据上述定义，可将属于功能性甜味剂的产品分类如下【4 】： ( 1 ) 功能性单糖，包括高果糖浆、结晶果糖和l 一糖等。 ( 2 ) 功能性低聚糖，包括异麦芽酮糖、乳酮糖、棉子糖、大豆低聚糖、低聚果糖、 低聚乳果糖、低聚木糖和低聚异麦芽糖等。 ( 3 ) 多元糖醇，包括赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、异麦芽 糖醇和氢化淀粉水解物等。 ， 第一章绪论 ( 4 ) 糖苷，包括甜菊苷、甜菊双糖苷、二氢查耳酮和干草甜素等。 ( 5 ) 二肽，包括甜味素和阿力甜等。 ( 6 ) 蛋白质，包括索马甜、莫奈林和奇异果素等。 ( 7 ) 蔗糖衍生物，例如三氯蔗糖等。 ( 8 ) 人工合成甜味剂，包括糖精、甜蜜素和安赛蜜等。 1 3 功能性甜味剂塔格糖 1 3 1 塔格糖的结构与性质 塔格糖( t a g a t o s e ) 是果糖的“差向异构体”，在分子水平上，除了第四个碳原子上 的羟基和氢基团倒置外，d 一塔格糖与d 一果糖的结构是一样的【5 1 。 hh o hhhh p - d 果糖p _ d 塔格糖 图1 2d 塔格糖的结构 纯净的塔格糖为白色无水晶体物质，无臭，熔点1 3 4 ，玻璃化温度1 5 。塔格糖的 水溶性较好，溶于水后会引起沸点升高和冰点降低，但并不吸热，因此不会产生清凉的口 感。塔格糖的吸湿性较低，酸性条件下的稳定性很好，在p h 3 7 范围内均可稳定存在。 它很容易发生美拉德反应，在较低温度下即可发生焦糖化反应【6 1 a 塔格糖的甜度可以达到蔗糖的9 2 ，甜昧与蔗糖非常相似，没有后昧也不会产生任何 不良风味。相对而言，塔格糖的甜味刺激较蔗糖快，和果糖相似。此外，塔格糖对强力甜 昧剂还有很好的协同增效作用，包括甜蜜素、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜、甜菊糖、纽甜和 三氯蔗糖等【”。 1 3 2 塔格糖的功能 1 3 2 1 低能量 机体所摄取的塔格糖，并不能被小肠所完全吸收。被小肠吸收的塔格糖，经糖酵解途 径代谢，未被吸收的塔格糖直接进入大肠后， 短链脂肪酸，几乎完全被机体重新吸收代谢。 几乎被其中的微生物菌群完全发酵，产生的 动物实验显示，塔格糖在代谢过程中所消耗 的能量比它释放的可利用能量还要多，不会引起脂肪沉淀，所提供的能量远低于蔗糖。因 此，塔格糖是一种新型的低能量的甜味剂，可以减少肥胖症的发生嘲。 1 3 2 2 降低血糖 塔格糖在机体内的吸收率较低，不会引起机体血糖水平的明显变化，很适合糖尿病人 3 翌堕查兰堕主兰垡笙苎 食用。研究发现，对于健康人和糖尿病i i 型患者，塔格糖的摄入不会引起血糖和胰岛素水 平的明显变化，而且可以明显抑制糖尿病患者因摄入葡萄糖所引起的血糖升高。在摄入一 定量的葡萄糖前先按不同剂量摄入塔格糖，发现塔格糖可以明显减缓血浆中葡萄糖值的增 长，随着塔格糖摄入剂量的增多，这种降低血糖的效果越明显【5 1 。塔格糖抑制血糖升高的 机制可能在于，塔格糖除吸收率较低外，同时还抑制了小肠对葡萄糖的吸收。另据专利报 道，塔格糖可缓解改善糖尿病的症状，抑制各种病发症的发生 9 】。 1 3 2 3 改善肠道菌群 机体所摄入的塔格糖仅有2 0 被小肠吸收，那部分不能被小肠吸收的塔格糖在结肠中 被一些微生物菌群选择性发酵，促进有益菌增殖，抑制有害菌生长，起到明显改善肠道菌 群的作用，是一种很好的益生素。同时，塔格糖发酵还产生大量有益的短链脂肪酸。尤其 是丁酸，它是结肠上皮细胞利用的主要原料，在控制结肠上皮细胞的生长繁殖上有重要作 用，并能起到抑制结肠癌、抑制肠道致病菌( 如大肠杆菌等) 以及促进乳酸菌等有益菌生 长的作用【1 0 】。 1 3 2 4 抗龋齿 研究发现塔格糖是一种不能被口腔中的微生物所利用的单糖，不会降低牙斑的p h 值， 因而不会引起龋齿。塔格糖在抑制牙菌斑，消除口臭方面有较好的效果，因此在口腔产品 方面用途广泛，可用于抑制龋齿、牙龈炎等牙齿疾病，消除口臭以及洁齿等3 。2 0 0 2 年 1 2 月2 日，美国f d a 发表申明，基于诸多科学研究成果，可以确认塔格糖不被口腔细菌 发酵，不会导致龋齿“1 。 1 3 2 5 其他功能 另据专利报道，塔格糖对促进血液健康十分有利【1 2 】，有助于提高雌鼠怀孕的几率并促 进母体及胚胎健康1 3 】。此外，塔格糖还可以增强细胞对毒素的敏感性，并可显著抑制可卡 因( c o c a i n e ) 、呋喃妥英( n i t r o f u r a n t o i n ) 等对肝细胞的毒害作用f 1 4 】。 1 3 3 塔格糖的应用 1 3 3 1 在谷物食品中的应用 当塔格糖应用于谷物食品中时，应当充分注意到塔格糖的几个重要的物理特性，包括 高熔点、低玻璃化温度、晶体不吸湿、高溶解性、易结晶性及p h 稳定性等。尤其要注意 塔格糖良好的美拉德反应的特性。温度较低时有利于增强风味，高温长时间处理则会导致 色泽过深和产生苦后味。如果谷物产品的挤压工序的温度相对较低( 1 3 0 ) ，且时间不长， 塔格糖即可作为唯一的甜味剂添加入其中，除能促进美拉德反应外，还能起到风味增效作 用。 在霜化谷物食品的生产中，在谷物表面喷涂一层碳水化合物溶液，干燥后溶液结晶， 在表面形成一层白色均匀的结晶糖层，这可增加谷物食品的甜度和延展性。塔格糖粘性低， 4 第一章绪论 能快速结晶且不易吸湿，可以延长谷物食品的货架寿命l 。 塔格糖与其他非结晶性甜味剂( 如低聚果糖、葡萄糖等) 混合使用，可以在谷物食品 表面形成稳定的，富有光泽的糖衣表面。塔格糖能增加糖衣涂层的甜味，同时有助于增加 食物的脆性，并防止结块。 1 3 3 2 在饮料工业中的应用 大多数碳酸软饮料的p h 值在3 4 左右，而塔格糖在p h 3 7 是非常稳定的，这使其能 很方便的被添加入此类饮料中，而生产工艺不需要作太大的改变。低卡路里的碳酸软饮料 和高糖量的碳酸软饮料相比，常常缺乏口感，在添加了1 塔格糖于高甜度碳酸饮料中后， 塔格糖不仅保证了饮料良好的口感，还明显减少了苦味和涩味，荠起到了风味增强和甜味 协同作用。感官分析显示，在柠檬汁和可乐饮料体系中，添加少量塔格糖就可以明显改善 产品的口感，降低因强力甜味剂( 如安塞蜜，糖精等) 带来的苦后味和涩味等，并使产品 的甜味刺激更快，口感更新鲜清爽。根据强力甜味剂的品种，终产品的甜度及感官要求( 口 感，后味和风味) 的不同，塔格糖和甜味剂的质量比通常为l ：1 l o o o ：1 ，更好的是在4 ：1 2 0 0 ：1 之间。此外，塔格糖还能增加饮料体系可溶性固形物的含量，使饮料口感更加饱满， 而这正是强力甜味剂所缺乏的。总之，总体上塔格糖能使低能量的清淡饮料的口感风味更 接近于以蔗糖增甜的高能量传统饮料1 6 ) 。 对于低脂高强度甜味牛奶饮料，如巧克力、酸奶和水果型饮料等，添加塔格糖能很好 的增加其风味，明显改善口感，获得理想的甜度和甜后味，降低因强力甜味剂产生的苦后 昧。特别对于巧克力乳饮料，塔格糖可增加浓郁的太妃糖风味【7 】。 1 3 3 3 在肉制品中的应用 腌肉、火腿等肉制品中含有相对高的碳水化合物( 2 7 ) ，容易造成微生物污染从而 导致经济上的损失。在肉制品工业中，对防腐剂、杀菌剂的要求非常严格，因此可以考虑 添加不能被微生物利用的碳水化合物到肉制品中。塔格糖不能被可以导致腐败的乳酸菌和 一些致病菌如大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等利用，若将其添加到肉制 品中，既可以发挥碳水化合物的功能作用，又能防止微生物污染。研究发现，添加了塔格 糖的肉制品在1 0 下保质期可延长三天【l “。 1 3 3 4 在糖果中的应用 塔格糖可作为唯一的甜味料应用于无糖巧克力中，而且工艺无须太大改变。将塔格糖 作为甜味剂添加到巧克力产品中后，可以发现巧克力的粘性和由d s c 测定出的吸热特性和 添加蔗糖时相似，不过添加塔格糖所得到的巧克力更加柔软。已有研究将塔格糖与菊粉 和异麦芽糖混合后应用到太妃糖的生产中体】。 垩塑查兰堡主堂垡堡苎 1 3 3 5 其他应用 塔格糖热量低，食后不会使血糖迅速升高，故可取代山梨醇作为糖尿病人食品中的专 用甜味剂，来生产各种低糖保健食品及减肥食品等。 塔格糖可以代替糖精或阿斯巴甜等用于市场上的各种咀嚼片中( 如维生素c 咀嚼片、 戒烟咀嚼片和清咽咀嚼片等) 作为甜味剂。此外，塔格糖还可以在泡腾片中。由于塔格糖 理化性质比较稳定，不会与泡腾片中的有机酸发生反应，且甜味纯正，故可取代糖精作为 其中的甜味剂f 1 8 】。 在口香糖中加小剂量的塔格糖可以延长甜味释放的时间，增加特殊风味。塔格糖既可 以添加到口香糖内，也可以用做涂层。 在医药中塔格糖可用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的粘合剂及口腔消毒剂中。 另外，塔格糖还可作为香烟产品的添加剂】。 1 4 塔格糖的来源 1 4 1 塔格糖的自然分布 塔格糖广泛存在于自然界中，许多食品( 如灭菌牛乳、超高温灭菌乳、乳粉、热可可、 各种干酪、某些品种的酸乳、婴儿配方食品) 以及某些植物药物中都存在有一定量的塔格 糖【2 0 1 。 表1 1 是含有塔格糖的食品及其中塔格糖的含量。 表1 1 塔格糖在各种食品中的含量 食品 m g ，l ( g 消毒牛奶 热可可牛奶 奶粉 s i m i l a c 婴儿食品 e n i l 婴儿食品 p a m a s a n 奶酪 挪威羊奶干酪 切达干酪 羊乳干酪 羊乳酪 超高温牛奶 b a 天然酸奶酪 热带椰枣树 乳酸菌和链球菌的代谢物 2 3 0 0 0 1 4 0 1 0 0 0 8 0 0 4 2 3 1 0 1 5 2 0 1 7 2 9 含糖量的3 0 含量范围可测 1 4 2 塔格糖制各的化学方法 塔格糖的化学合成是以半乳糖为原料，主要包括异构化和酸中和两个步骤2 ”。首先 第一苹绪论 以可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催化剂，使半乳糖与金属氢氧化物发生异构化反应，生 成金属氢氧化物一塔格糖复合物中间体沉淀。然后，以酸中和复合物中间体，得到塔格糖 终产物。其中，半乳糖可由乳糖水解而得。 半乳糖异构化是塔格糖化学合成反应的关键步骤。基于成本的考虑，金属氢氧化物反 应物最好采用c a ( o h ) z ，或c a ( 0 h ) ：与n a 0 h 的混合物。一般是加入c a ( o h ) 。混合水而成的水 溶浆，或者加入石灰( c a o ) 混合水发生水合作用后的产物。碱金属盐( 或碱土金属盐) 催 化剂通常采用c a c l ：，用量约为半乳糖摩尔数的1 5 。异构化反应应在碱性、低温条件下 进行，控制在p h l o 、一1 5 4 0 范围内。 酸中和的目的是生成不溶性金属盐，而将塔格糖从复合物中间体中释放出来。剩余的 离子通过离子交换树脂除去。中和酸可使用h 。s o 。、h 3 p o ；或h c l 等，以c o 。为最佳。根据反 应体系的根据反应体系的p h 值来控制酸中和反应的进程，当p h 5 0 ) 时应该较稳定。 4 3 3 2p h 对l 阿拉伯糖异构酶的影响 许多研究表明，p h 对酶活性的影响不是由于酸、碱作用了整个酶分子，影响了整个 酶分子的解离状态，而是由于酸、碱改变了酶的活性中心或与之有关的基团的解离状态。 按照4 2 3 8 和4 2 3 9 所描述的方法测定酶反应的最适最适p h 和酶的p h 的稳定性曲 线，结果如图4 4 和4 5 所示。 。器 躲 蒌! ： o 234 5678910 l 】 p h 图4 4 酶反应最适d h 曲线 童器 蕊器 弱 0 01234 56 7 891 0 l l p h 图4 - 5 酶的p h 稳定性曲线 l 堡型茎生：堕垫塑塑墨塑矍堕堡壁：塑生丝! 墨丝塑墼鉴堕堂丝堕堕塑 从图4 4 和图4 5 可以看出，粗酶的最适反应p h 为7 o ，比k i m 【2 8 1 等测得的最适p h 低15 ，这可能与酶的来源不同有关。p h 稳定范围较宽，在p h4 o 8 0 范围内放置lh 后，酶活能保持8 0 以上。 4 3 3 3 金属离子对l 阿拉伯糖异构酶的影响 许多金属离子会对酶活性产生影响，本实验选取一些金属离子，研究它们对l _ 5 可拉 伯糖异构酶的影响，结果见表4 3 。 表4 3不同金属离子对l 邛可拉伯糖异构酶活性的影响 金属离子相对酶活力 不添加 10 0 n a c l1 0 4 k c lo 盘8 c a c l 2 o 5 4 l i c l 13 9 b a c l 一 m n c l 2 7 6 8 a 1 2 ( s 0 4 ) 3 1 18 m g s 0 41 7 2 c u s o do 5 9 f e s 0 41 6 8 z n s o d0 1 2 e d t a 0 9 0 s d so2 5 注：“一”指未检出或痕量，离子浓度为5m m o l l ，s d s5 0m m o l 几 由表4 3 的结果可见，n a + 、l r 、m n 2 + 、a l 3 t 、m g “、f e 2 对l 阿拉伯糖异构酶有激 活作用，其中m n “的激活作用尤其显著，这与k i m 2 8 】和y o o n 【5 0 】等人的研究结果相符， 这表明m n ”可能对l 一阿拉伯糖异构酶分子多聚体结构的稳定性很重要。而k + 、c a 2 + 、b a 2 + 、 c u ”、e d l a 、s d s 对l 邛可拉伯糖异构酶有抑制作用，其中b 矿、z n 2 + 的抑制作用显著， 使酶完全失活。 据i b r a l l i m 【32 j 报道，m n ”对l - 5 可拉伯糖异构酶有激活作用，可以作为第二底物，加 入m n ”使酶与半乳糖的亲和力增加，降低了k 。，从而提高了反应速度。m n 2 + 的最适浓度 见图4 。6 。 2 0 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 o5 01 0 01 5 0 m n2 + 的量( m m o l l ) 图4 6m n 2 + 的最适浓度 在反应体系内，m n 2 + 浓度依次为0 、5 、l o 、5 0 、1 0 0 、1 5 0i i u n o l l ，由图4 6 可知 3 7 兰堕查兰婴主兰焦丝窭 m n 2 + 的浓度从5m m o l 几增加到1 0m m o l l 时，相对酶活迅速增加，5 0m m o l l 相对酶活 最高。当m n 2 + 的浓度大于5 0m m o i 几时，酶活力下降，可能的原因是过量的m n 2 + 对酶活 性有抑制作用，使表观k 。增加，从而导致酶活性降低。m n 2 + 的浓度过高时，酶活力下降 还可以认为是底物抑制作用。这种底物抑制现象通常可以解释为酶存在两种底物结合位 点，在金属离子浓度较高时，低亲和力型的位点占了大部分，从而抑制了在高亲和力型位 点发生的催化作用【5 5 】。 4 3 3 4l 阿拉伯糖异构酶的动力学常数测定 在酶动力学研究和实际应用中，k 。是酶反应的重要特征常数，而v 。也是一个重要 的常数。分别用5 6 6 7 、2 7 7 7 8 、5 6 6 6 7 、1 1 1 1 1 1 、1 6 6 6 6 7m m o l l 的半乳糖为底物( 用 p h 7 0 ，0 2 m o l l 的磷酸盐缓冲液配制) ，酶与底物在6 0 、p h 7 o 的条件下反应3 0 m i n ， 以单位时间内酶活的增加量作为酶反应的初速度。以酶反应初速度的倒数1 厂v 与底物浓度 的倒数l s 】作图， 所得的直线在横坐标上的截距为1 瓜。，在纵坐标上的截距为1 。a x ， 结果如图4 7 所示。 j o 1 6 r 2 = 0 9 9 6 2 一 1 4 一 1 2 1 o 8 o 6 0 4 o 2 图4 - 7l - 阿拉伯糖异构酶的1 ，v 与1 ，【s 】关系图 0 2 根据图4 7 中的回归方程计算得到l 一阿拉伯糖异构酶对半乳糖的k 。为1 1 9 3 9 3 m m 0 1 l ，v 。a x 为1 3 5 1p g m i n 。所得到的k 。是有报道的l 邛可拉伯糖异构酶对l _ 5 可拉伯糖 的k 。阐( 6 0m m o l l ) 的2 0 倍，而比y o o n 报道的l - 5 可拉伯糖异构酶对半乳糖的k 。( 1 4 8 0 m m o 儿) 要小。 4 4 本章小结 ( 1 ) 发酵得到的菌体细胞，用超声波破碎的方法提取l 阿拉伯糖异构酶，具体条件 为：工作功率2 0 0 w ，破碎时间1 0m i n 。 ( 2 ) 粗酶液的最适反应温度为6 0 ：最适反应p h 为7 o ；在6 0 保温1 h 能保持8 0 3 8 笙婴皇兰：堕垫堕塑墨塑堕竺墨里、_ 塑垄丝些丝塑堕堕堕堂丝垦竺壅一 左右的酶活，7 0 保温1 h 残余酶活下降到2 0 以下，8 0 时基本失活。在p h 4 o 8 o 的 范围内放置1 h 具有较好的稳定性。n a + 、l i + 、m n ”、a l ”、m g ”、f e 2 + 对l 邛可拉伯糖异 构酶有激活作用，其中m n 2 + 的激活作用尤其显著，k + 、c a 2 + 、b a ”、z n ”、c u ”、e d l a 、 s d s 对l 一阿拉伯糖异构酶有抑制作用，其中b a 2 + 、z n 2 + 的抑制作用显著，使酶完全失活。 ( 3 ) 酶与底物在6 0 、p h 7 o 的条件下测定l 一阿拉伯糖异构酶的动力学常数，以半 乳糖为底物的k 。为1 1 9 3 9 3m m o l l ，v 。为1 3 5 1p m i n 。 江南大学硕士学位论文 5 1 前言 第五章酶法生产塔格糖工艺研究 酶法生物转化合成塔格糖与化学法生产塔格糖相比，具有反应条件温和，安全等优点， 是近年来国外研究的热点。本章主要研究了l 一阿拉伯糖异构酶生产塔格糖的工艺条件， 并利用高效液相制备塔格糖，通过与塔格糖标样的红外光谱比较，证明本实验酶反应得产 物为塔格糖。 5 2 材料与方法 5 2 1 实验材料 5 2 1 1l 阿拉伯糖异构酶 ( 1 ) l 一阿拉伯糖异构酶粗酶液：乳酸菌s k l 0 0 2 按照第三章所优化的发酵条件，培 养1 2h ，发酵液冷冻离心( 4 ，8 0 0 0r p m ，1 0m i n ) ，弃去上清液，沉淀用0 2m o l l ，p h 7 o 的磷酸盐缓冲液洗涤2 次，沉淀分散于0 2m 0 1 l ，p h7 o 的磷酸盐缓冲液，终体积是发 酵液体积的1 1 0 ，超声波破碎功率2 0 0w ，时间1 0m i n ，离心除去菌体碎片( 9 6 0 0r p m ， 1 0 m i n ) 。 ( 2 ) l o 、4 0 ( w w ) 湿基细胞：乳酸菌s k l 0 0 2 按照第三章所优化的发酵条件， 培养1 2 h ，发酵液冷冻离心( 4 ，8 0 0 0r p m ，1 0m i n ) ，弃去上清液，沉淀用o 2 m o l l ， d h 7 o 的磷酸盐缓冲液洗涤2 次，菌体分别按1 0 和4 0 ( w w ) 的比例分散于o 2 m o l l ， d h 7 o 的磷酸盐缓冲液中。 5 2 1 2 主要化学试剂 d 一半乳糖 国药集团化学试剂有限公司 氯化钙 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 氢氧化钠 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 盐酸中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 所有化学试剂除标明外均为分析纯( a r ) 5 2 2 主要实验仪器 7 2 2 型可见分光光度计 超级恒温水浴 电子精密天平 磁力搅拌器 4 0 上海精密科学仪器有限公司 上海实验仪器厂 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 泰县分析仪器厂 jl， 第五章酶法生产塔格糖工艺研究 v c x 5 0 超声处理器 t g l 6 w s 台式高速离心机 s h z 8 8 台式恒温水浴振荡器 d z f 6 0 21 型真空干燥箱 冷冻干燥机 f t - i rs p e c t r o m e t e r n i c o l e s o n i c s & m a t e n a l s u s a 长沙湘仪离心机仪器有限公司 江苏太仓实验设备厂 上海精宏实验设备有限公司 p a r 七s & s e r v i c el a b c o n c o t h e r m oe i ，日= t r o nc f ) r p n r a t i n n 5 2 3 主要实验方法 5 2 3 1 半乳糖转化率测定方法 采用改进的半胱氨酸一咔唑法，计算反应一段时间后总反应体系中生成塔格糖的量 与反应体系加入半乳糖的量的比值，即为半乳糖转化率。 5 2 3 2 红外光谱样品制备 用高效液相制备塔格糖，采用c a 2 + 型阳离子交换柱，流速o 4m l m i n ，柱温3 0 ， 根据塔格糖标样的保留时间收集样品中相应保留时间的组分，经真空干燥箱浓缩，再由冷 冻干燥得到塔格糖晶体，备红外光谱用。 5 3 结果与讨论 5 3 1 酶法生产塔格糖工艺研究 5 3 1 1 最适加酶量的确定 采用l 邛可拉伯糖异构酶粗酶液、1 0 、4 0 ( w w ) 湿基细胞，保持反应体系内半乳 糖浓度0 8 3m o l l ，反应p h7 o ，反应温度6 0 ，测定不同加酶量时的塔格糖含量，结果 如图5 。1 到图5 3 。 看9 0 j 8 0 v 吲7 0 篓6 0 萎5 0 oo5ll52253 加酶量( l ) 图5 1 粗酶液最适加酶量 b o 1 v 翊 缸 器 堙 垫 4 0 2 0 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 00 2o 4 060811 2 细胞添加量( l ) 5 - 21 0 湿基最适添加量 江南大学硕士学位论文 o0 1020 30 40 5 0 6 细胞添加量( 札) 图5 34 0 湿基最适添加量 从图5 1 到5 3 可以看出，在底物浓度相同的情况下，l 一阿拉伯糖异构酶粗酶液、 1 0 、4 0 ( w w ) 湿基细胞的最适添加量是不同的。粗酶液和1 0 湿基细胞的添加量接 近，在实验处理过程中，粗酶液和1 0 湿基细胞的酶液在细胞重量上接近，所以添加量 也相似。4 0 湿基细胞所需的添加量较少，这可能是浓度较高的原因。在实验中用l _ 5 可 拉伯糖异构酶粗酶液、1 0 、4 0 ( w w ) 湿基细胞时要采用不同的添加量。 5 3 1 2 温度对转化率的影响 考虑到l 邛可拉伯糖异构酶的最适反应温度和温度稳定性，选用5 0 、6 0 、6 5 的反应 体系分别进行反应，反应条件为：用l 一阿拉伯糖异构酶粗酶液，半乳糖浓度0 8 3m 0 1 l ， 反应p h7 o ，测定不同温度下，转化率随时间的变化曲线，结果如图5 _ 4 a 2 5 2 0 誊1 5 替 鼍1 0 蜱 5 0 一5 0 4 87 29 61 2 0 时间( h ) 一6 0 r 6 5 图5 4 温度对转化率的影响 从图5 4 可以看出，温度对转化率的影响十分显著，6 0 时转化率最高。5 0 的转化 率低于6 0 的转化率，这可能是反应温度未达到酶的最适反应温度：6 5 的转化率最低， 且增长速度缓慢，这可能是因为温度过高，使酶失活，对转化率产生影响。 枷娜姗珊瑚m印o 1山丑jv删如耱罂拇 -一一 第五章酶法生产塔格糖工艺研究 5 3 1 3 底物浓度对转化率的影响 分别采用粗酶液、1 0 和4 0 湿基细胞转化半乳糖，反应体系中的半乳糖浓度依次为 0 5 6 、o8 3 、1 6 7m 0 1 l ，反应p h7 0 ，反应温度6 0 ，反应7 2h 后测定半乳糖转化率， 结果见图5 5 至5 8 。 2 0 一1