（食品科学专业论文）转基因生物Bt蛋白降解技术研究.pdf

摘要 转基因生物b t 蛋白降解技术研究 食品科学专业硕士研究生乔文静 指导教师赵国华教授 刘阳研究员 摘要 本文主要以苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 和转b t 基因水稻秸秆为材 料，研究紫外线辐照、c o c o y 射线辐照、蛋白酶、土壤分离微生物对b t 蛋白的降解作用，实 验结果如下： ( 1 ) 紫外线辐照可以降解b t 细菌中的b t 蛋白，降解率与紫外灯功率，b t 细菌与紫外灯 间距离及辐照时间有关。紫外灯功率越大、距紫外灯距离越小、辐照时间越长，b t 蛋白降解 率越高。在4 0w 紫外灯下2 0c m 处辐照2 4h ，b t 蛋白基本完全降解。 ( 2 ) c o c oy 射线辐照可以降解b t 细菌中的b t 蛋白，b t 蛋白降解率随6 0 c oy 射线辐照剂 量增大而提高，但辐照剂量超过2k g y 时，b t 蛋白降解率无显著增加。 ( 3 ) b t 细菌中提取的b t 蛋白在6h 内基本不会降解，且在6h 内温度、振荡等因素对 b t 蛋白的降解无显著影响。 ( 4 ) 在酶的最适作用条件下，所选7 种蛋白酶均可降解b t 细菌中提取的b t 蛋白，但在 3 0 ，p h7 0 时只有菠萝蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶可以完全降解b t 蛋白。综合考虑 价格、应用等因素后，最终选取中性蛋白酶作进一步研究。向1m l 饱和b t 蛋白溶液中加入 1 2u 中性蛋白酶，使二者在3 0 下反应2 0m i n 后，b t 蛋白可完全降解。中性蛋白酶也可降 解转b t 基因水稻秸秆中b t 蛋白，且降解率与酶底比、酶解温度及酶解时间均是正比。 ( 5 ) 从土壤中筛选出一株可高效降解b t 蛋白的f j b 3 细菌。将f j b 3 细菌培养2 4h 后， 取o 0 5m l 发酵上清液加入到9 9 5m l 饱和b t 蛋白溶液中，在3 0 下反应4h 后，b t 蛋白完 全降解。此外，f j b 3 细菌也可以降解转b t 基冈水稻秸秆中的b t 蛋白。在2 5 下，b t 蛋白 降解率最高，且b t 蛋白降解率随发酵时间延长而提高。发酵5d 后b t 蛋白降解率达5 9 6 3 ， 发酵3 0d 降解率可达8 3 5 3 。 关键词：b t 蛋白辐照蛋白酶土壤微生物 a b s t r a c t s t u d y o nd e g r a d a t i o nt e c h n i q u e so n t r a n s g e n i co r g a n i s m so f b tt o x i n c a n d i d a t e ：w e n ji n gq i a o a d v i s o r ：p r o f g u o h u az h a o p r o f y a n gl i u a bs t r a c t u s i n gb a c i l l u st h u r i n g i e n s i sa n ds t r a wo fb tt r a n s g e n i er i c ea sm a t e r i a l s ，i n f l u e n c e o fu v r a d i a t i o n , 6 0 c or a d i a t i o n ，e n z y m e sa n dm i c r o o r g a n i s m si s o l a t e df r o ms o i lo nd e g r a d a t i o no fb t t o x i nw a ss t u d i e d r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ( 1 ) u vr a d i a t i o nc o u l dd e g r a d eb tt o x i ni nb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s , a n du vl a m pp o w e r , d i s t a n c ef r o mp r o t e i nt ou vl i g h ta sw e l la si r r a d i a t i o nt i m ew e r ef a c t o r sc o n t r i b u t i n gt od e g r a d t i o n r a t e t h ed e g r a d t i o nr a t ei n c r e a s e dw i t hu vl a m pp o w e ra n dd i s t a n c eg r o wd o w n , w h i l ei r r a d i a t i o n t i m ed e c r e a s i n g ( 2 ) 6 0 c or a d i a t i o nc o u l dd e g r a d eb tt o x i ni nb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，a n db td e g r a t i o nw a s e n h a n c e dw i t hd o s eo f 6 0 c oi n c r e a s i n g h o w e v e r t h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc h a n g eo i ld e g r a t i o no f b tw h e nt h ed o s ee x c e e d i n g2k g y ( 3 ) p u r i f i e db tt o x i nc o u l dn o tb et od e g r a d e db a s i c a l l yw i t h i n6h i na d d i t i o n ，f a c t o r ss u c ha s t e m p e r a t u r ea n ds h o c k i n gh a sn os i g n i f i c a n ti m p a c to nd e g r a t i o n o f b tw i t h i n6h “) u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n so fe n z y m e s , a l lt h es e v e np r o t e a s e ss e l e c t e dc o u l dd e g r a d e p u r i f i e db tt o x i n h o w e v e r , o n l yb r o m e l a i n , n e u t r a lp r o t e i n a s c a n da l k a l i n ep r o t e a s ec o u l d c o m p l e t e l yd e g r a d eb tt o x i na t3 0 p h7 0 i nv i e wo fp r i c ea n da p p l i c a t i o n , n e u t r a lp r o t e i n a s c w a ss e l e c t e df o rf u r t h e rs t u d y b tt o x i nc o u l db ec o m p l e t e l yd e g r a d e db ya d d i n g1 2u p r o t e a s et o1 m lo fs a t u r a t e db tt o x i ns o l u t i o na n dm a k i n gt h e mr e a c tf o r2 0m i na t3 0 1 2 i na d d i t i o n n e u t r a l i i i 两南大学硕+ 学何论文 p r o t e i n a s cc o u l da l s od e g r a d eb tt o x i ni nb tt r a n s g e n i er i c e ，a n dd e g r a d a t i o nr a t ew a sp r o p o r t i o n a l t or a t i oo fe n z y m ea n ds u b s t r a t e h y d r o l y s i st e m p e r a t u r ea sw e l la sh y d r o l y s i st i m e ( 5 ) ae f f i c i e n tb a c t e r i af o rb tt o x i nd e g r a d a t i o nw a ss r e e n e da n dc o d e d 笛f j b 3 b tt o x i n c o u l db ec o m p l e t e l yd e g r a d e db ya d d i n g0 。0 5m lo ff e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n to ff j b 3w h i c hh a d b e e nc u l t i v a t e df o r2 4ht o9 9 5m lo fs a t u r a t e db tt o x i ns o l u t i o na n dm a k i n gt h e mr e a c tf o r4ha t 3 0 ，i na d d i t i o n ，f j b 3c o u l da l s od e g r a d eb tt o x i ni nb tt r a n s g e n i er i c e t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f b tt o x i nr e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e la t2 5 c a n dd e g r a d a t i o nr a t ei n c r e a s e dw i t hf e r m e n t a t i o nt i m e i n c r e a s i n g t h ed e g r a d a t i o nr a t er e a c h e d5 9 6 3 a n d8 3 5 3 a f t e r5a n d2 5df e r m e n t a t i o no ff j b 3 r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：b tt o x i n ；r a d i a t i o n ；p r o t e a s e ；m i c r o o r g a n i s m si s o l a t e df r o ms o i l i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 舻：乔未萄鳓期：年衫月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 j ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：留不保密， 口保密期限至年月止) 。 多口日 学位论文作者鲐乔啻匆锄签名 签字日期： 力p 年月日 签字日 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1b t 蛋白概述 b t 蛋白是由苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 产生的杀虫晶体蛋白。苏 云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，菌体短杆状，产芽孢，单生或形成短链，包括许多亚 种。当菌体生长到一定阶段形成芽孢时产生b t 蛋白，也称杀虫晶体蛋白( i n s e e t i e i d a lc r y s t a l p r o t e i n s ，简称i c p s ) i l2 1 。b t 蛋白是一种伴胞晶体。其形状、大小、数目依亚种与菌株的不 同而异，一般呈菱形、长菱形、方形等形状，但也有圆形或椭圆形、三角形、镶嵌形、无定 形等，每个营养体可形成一个至数个伴胞晶体。 b t 蛋白对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、双翅目( d i p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、膜翅目 ( h y m e n o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e r a ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 、食毛目( m a l l o p h a g a ) 等多种昆虫， 以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性【3 】。 1 1 1b t 蛋白分类 b t 细菌多数菌株都能产生多种类型的b t 蛋白，不同亚种甚至同一亚种不同菌株b t 蛋白 的多肽成分都不同。1 9 8 9 年h o f t e 和w h i t e l e y l 4 , 5 】根据b t 蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同， 将已经发现的4 2 种b t 蛋白分为5 群1 4 亚类。其中具有溶血溶细胞作用的2 7k d ab t 蛋白基 因被命名为c ”基因。其他只有杀虫活性的1 3 皿类命名为狭义的b t 蛋白基因，即c r y 基因。 c a l a b r a s en i c k e r s i n l 6 1 根据苏云金芽抱杆菌b t 蛋白组成的差异将之分为三类：i 类含单一 1 4 0k d a - 1 6 0k d 蛋白，类则含1 5 0k d 和6 0k d 两种，类仅产生单一的低分子量蛋白。 l e r e c l u s 则将苏云金芽抱杆菌杀虫晶体蛋白的s d s p a g e 图谱分为五类：一类含c r y l 和c r yi i ， 分子量约为6 7k d 和1 3 0 1 4 0k d ；二类仅含c r y i ，分子量约为1 3 0 1 4 0k d ；三类仅含c r y l l i ， 分子量约为6 7k d ；四类贝q 为c r y i v ，分子量为1 3 0k d ，6 7k d 和2 7k d ，另一类则仅含分子 量约为钧5 0k d 的杀虫晶体蛋白，各类都表现出不同的杀虫活性谱i 7 1 。 1 1 2b t 蛋白的抗虫机理 b t 蛋白主要为6 内毒素，通常以原毒素形式存在，被昆虫摄食后，在昆虫肠道碱性环 境下溶解，原毒素被蛋白酶降解成毒性的多肽，可以跟敏感昆虫中肠道上皮细胞表面的特异 性受体相互作用，不可逆的破坏细胞，使细胞膜穿孔，破坏细胞的渗透平衡，破坏离子通道， 离子运输中断，细胞线粒体功能丧失，无法合成a t p ，细胞丧失功能，引起细胞肿胀裂解， 使昆虫停止取食，最终导致死亡【8 9 1 ，另外，由于离子渗漏，引起了离子梯度的破坏，也扰 乱了中肠内正常的跨膜电势及酸碱平衡，影响了养分的吸收1 0 1 。 两南大学硕十学位论文 昆虫中肠液的酸碱度和蛋白酶的组成是影响伴孢晶体与原毒素活化的主要因素。不同目 昆虫的中肠液差异很大，如大多数的鞘翅目幼虫中肠液为中性或略偏酸性( p h6 5 7 o ) ，其主 要蛋白酶为半胱氨酸蛋白酶 1 q 。鳞翅目幼虫中肠液呈碱性( p h8 0 1 0 5 ) ，其主要的蛋白酶是 胰蛋白酶为主的丝氨酸蛋白酶1 1 2 1 。双翅目的幼虫中肠液呈弱碱性，也是以胰蛋白酶为主。对 6 内毒素的降解活化和内毒素作用的专一性与中肠酸碱度和酶液的组成密切相关。这也是不 同的c r y 基因编码蛋白的杀虫谱有所不同的原因。中肠液的酸碱度影响伴孢晶体在消化道的 溶解速度、溶解程度和杀虫的专一性l l3 1 。 内毒素与靶细胞膜上受体的结合是b t 蛋白作用的关键环节，毒素与受体结合的改变是产 生抗性的主要原因。结合的改变表现在3 个方面：( 1 ) 毒素与细胞膜上受体的结合由于竞争性 抑制作用( c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n ) 而受阻；( 2 ) 受体一级结构的改变导致受体结合位点的减少； ( 3 ) 受体二级结构的饰变( s e c o n d a r ym o d i f i c a t i o n ) 导致受体结合位点的减少，即指受体结合蛋白 的某些残基的改变从而影响毒素与受体间的结合，如烟草毒蛾的受体结合蛋白a p n 为一种糖 原蛋白，它含有多个特异性的糖基结合点，这些结合点的饰变直接影响毒素在受体上的结合 作用。因此这些特异性位点的变化，也可能是抗性产生的机理之一f j 4 j 。 1 2 转b t 基因作物概述 转基因作物指利用生物技术，把从动物、植物或微生物等生物体中鉴定、分离的目的基 因插入植物基冈组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物【”l ，相比原来种植的作物 来说它们都具有一些优良的农艺性状和特殊的经济价值 1 6 - 1 9 。基因工程的实现主要分为三个 步骤：1 ) 以人工方法在现有的生物中取得所需要的d n a 片断，利用m r n a 复制所需的d n a ， 即人工合成基因。2 ) 将人工合成的基因输入到新细胞当中去，并使其与新细胞中原有的d n a 相组合，即d n a 的重组。3 ) 筛选和培养有外源基冈的细胞或组织，使其产生正常健康的转基 因植物，通过有性繁殖将优良性状传递给下一代。近年来转基因作物在培育抗虫、抗病、抗 逆境、抗除草剂和高产优质农作物新品种等方面取得了令人瞩目的成绩【l 引。 人们分离并导入到植物中而获得转基因抗虫植物的b t 基因很多【2 0 2 ，但获得转基因抗虫 棉的b t 基因己见报道的仅有c r yia b l 2 2 - 2 3 1 和c r yia v 等少数几种。现在国内许多实验室和 公司先后将不同株系的b t 蛋白基因导入烟草、棉花、玉米、水稻、番茄、甘蔗、小麦、大豆、 花生、马铃薯等6 0 多种植物，并且有多例表达转修饰b t 基因的作物进入田间试验和商品化 生产。 根据农业生物技术应用国际服务组织( i s a a a ) 2 0 0 8 年2 月2 7 日在北京发布的全球转基 因作物概况报告，自1 9 9 6 年开始产业化以来，全世界转基因作物种植面积连续1 2 年稳定增 长，2 0 0 7 年又较2 0 0 6 年增长了1 2 ，总面积已达1 1 4 3 亿公顷，相当于1 9 9 6 年面积的6 7 2 第1 章文献综述 倍。我国农业转基因技术的研发取得了重要进展，抗虫棉花已大规模推广应用，每年可创造 数百亿元的经济效益和巨大的社会、生态效益。转基因生物育种己成为最具活力的一项现代 农业技术，其发展势头不可逆转【2 4 1 。转b t 基因的研究也受到各地学者的重视，国内外的生 物工程热将把转基因植物的研究推向高潮。 1 3 转b t 基因作物安全性研究 目前转基因生物安全，是指防范农业转基因生物对人类、动植物、微生物和生态环境构 成的危险或潜在风险【2 引。自1 9 8 1 年克隆出第1 个b t 蛋白基冈以来，转b t 基因植物就引起了 全世界的极大关注【2 6 】。转基冈植物给人类带来巨大利益的同时，随之而来的生态风险问题倍 受关注。目前由于科学发展水平的限制，对转基因植物的环境安全性还没有一致的结论，特 别是缺乏系统、广泛的田间试验结果，尚不能作出精确的评价。转基因植物引发的人们对其 安全性的担忧的生态安全问题也成为国际争论的焦点，随着转基因研究的不断深入，也会不 断出现新的环境安全性问题。 转基冈植物安全性是个复杂的大课题，其核心内容是食品和生态安全【2 7 一引。首先，因转 b t 基因植物多为农作物，故其食品安全性最为人们所关注。食用后对人体会不会造成急性或 慢性损害。其次，转b t 基因的植物在杀灭害虫的同时也不可避免地影响生态系统中的其他生 物，改变生态平衡，产生的后果难以估量。 转基因植物的农业生态安全问题包括基因漂移导致的遗传污染、转基因逃逸、转基冈的 非靶标效应、抗病虫性衰退及生物多样性下降、碳等元素循环发生变化等【2 9 】。转基冈棉花释 放到田间后，是否会将所携有的外源基因转移到近缘野生植物中，或是否会破坏自然生态环 境，打破原有生物种群的动态平衡是现在转基因棉花安全性的研究重点【3 0 】。 1 3 1 转b t 基因植物土壤生态系统的影响 转基因植物带来巨大利益的同时，随之而来的生态风险问题备受关注。转b t 基因植物的 长期种植可能会使b t 蛋白通过不同的途径进入土壤，并在土壤中残留、富集，而土壤生态系 统是生物物质循环和能量转化过程的重要场所，因此，b t 蛋白在土壤中的积累将可能使土壤 特异生物类群功能、土壤生物多样性以及土壤酶活性等受到不同程度的影响。 b t 蛋白土壤残留大量研究主要集中于转基冈植物与近源物种之间的基因漂流f 3 1 3 2 1 、靶标 害虫抗性f 3 3 1 、对非靶标生物的影响等3 4 - 3 5 1 。由于转b t 植物的长期种植可能会使b t 蛋白在土 壤中残留、富集。而土壤生态系统是生物物质循环和能量转化过程的重要场所，b t 蛋白在土 壤的富集很可能影响土壤的特异生物功能类群以及土壤生物多样性【3 6 】。因此，b t 蛋白在士壤 中的残留及其对土壤生态系统的影响近年来逐渐受到国内外广泛关注 3 两南大学硕十学位论文 在基因漂流方面，随着转基冈植物不断释放，大量基因漂流进野生植物基因库，进而扩 散起来，影响基因库的遗传结构，给生物多样性造成严重危害，转b t 基因植物已经证明在玉 米、棉花等作物上，通过花粉向近缘非转基因植物中转移。张长刮3 7 1 等研究转基因棉花品种 的花粉扩散规律表明，在距棉1m 处的抗性株率高达1 1 2 。在昆虫产生抗性方面，由于转 b t 基冈植物体在整个生育期都能稳定地表达b t 蛋白，害虫在整个生长周期都受到b t 蛋白的 选择，将促使害虫对转b t 基冈植物产生相应抗性，不仅会削弱转b t 基因植物本身的效益， 而且会导致杀虫剂的再次使用。这给以转基冈植物为食的敏感昆虫的更大的选择压力，从而 加速昆虫产生抗性。t a b a s h n i k a s l 总结了在实验室选择条件下对b t 蛋白产生抗性的害虫：鳞翅 目- 烟芽夜蛾、甜菜夜蛾、海灰翅夜蛾、粉纹夜蛾、小菜蛾、地中海粉螟( a n a g a s t ak u e h n i e l l a ) 、 粉斑螟( c a d r ae a u t e l l a ) 、印度谷螟、枞色卷蛾( c h o r i s t o n e u r af u m i f e r a n a ) ，鞘翅目黑杨叶甲 ( c h r y s o m e l as c r i p t a ) 、马铃薯甲虫、双翅目五带淡色库蚊、黄猩猩果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 、家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 。在食品安全方面，目前用于商业种植的转b t 基因作 物，其杀虫的专化性很强，主要是针对目标害虫，对人及家畜无害【3 9 】。迄今为止的研究表明 来自遗传改良生物的食品无毒性，或营养上的无毒性，但仍然缺少长期实验的结果和更深入 细致的研究。因此人们对食用转b t 基冈植物仍很有顾虑。 如果长期重复种植这些转b t 植物，就会造成b t 蛋白在土壤中的累积，破坏土壤生物多 样性，并最终威胁到整个土壤生态系统4 0 4 2 1 。 1 3 2 转b t 基因植物杀虫蛋白进入土壤途径 土壤是生态系统中物质循环和能量转化过程的主要场所，转基因植物外源基因表达的毒 蛋白可通过多种途径进入土壤生态系统大面积种植转b t 基因植物后，转b t 植物在生长期可 持续通过根部向土壤中分泌b t 蛋白另外，含b t 蛋白的植株表面残体脱落物、植株伤口流出 物、木质部流体以及花粉等都会释放到土壤，造成b t 蛋白在土壤中累积的可能，特别是植物 收获后，大量b t 蛋白随植株残体留在土壤中，这些b t 蛋白在土壤中能否长期残留并累积主 要依赖b t 蛋白浓度的增加速率、微生物降解速率和非生物因素的钝化速率等因素的作用：近 年来，b t 蛋白在土壤中的残留动态及其对土壤生物学特性的影响逐渐受到国内外的b t 蛋白 进入土壤的途径转b t 基因植物的外源基因及其表达毒蛋白可以通过许多途径进入土壤生态 系统，其中最直接的途径包括三个方面。 1 3 2 1 植株残体 转b t 植物在收割前后遗留在田问的植株残体是外源基因及其表达产物进入土壤的最主 要途径，尤其是随着植物秸秆还田技术在农业生产上的大面积推广应用。z w a h l e n 【4 3 1 等报道， 玉米收割后，每公顷玉米田中会有2 - 6 t 玉米残茬留存，若种植转b t 基因玉米，残茬中的b t 蛋白通过翻耕与土壤颗粒结合，在2 0 0d 后仍能从土壤中被检测到；水稻生产实践中秸秆还 4 第1 章文献综述 曼量曼曼曼曼量詈曼曼曼曼曼曼鼍量曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼舅曼曼曼舅曼曼曼i i 皇曼皇篡量舅舅曼皇曼曼曼曼曼量曼曼曼量鼍喜皇曼皇曼鲁曼曼曼曼曼曼 田技术的推广应用，也为转b t 基因水稻释放的毒蛋白进入土壤并在土壤中累积提供了条件。 1 3 2 2 根及根系分泌物 转b t 植物的根系也表达b t 蛋白，水培和土培实验均证实了转基因玉米的根系分泌物中 有活性b t 蛋白，同时其根系分泌物也在源源不断向这些植物根际周围的土壤生物圈导入b t 蛋白。s a x e n a l 4 4 1 等首次报道了转b t 基因植物根系分泌毒蛋白的研究结果：用转b t 基因玉米 的根系分泌物在室内喂养欧洲玉米螟幼虫，5d 后幼虫死亡率达9 5 1 0 0 ；其后的研究还发 现，转b t 基因玉米、水稻和马铃薯的根系分泌物中b t 蛋白的释放量不同，而在转b t 基因油 菜、棉花和烟草的根系分泌物中没有检测到b t 蛋白。 1 3 2 3 花粉 绝大多数转b t 植物在花粉中表达b t 蛋白，而且表达的量很高。因此，转b t 植物的花粉 落入田中是b t 蛋白进入土壤中的一条重要途径，这也成为转基因植物中外源基冈逃逸的主要 渠道之一。 1 3 3 转b t 基因植物杀虫蛋白对土壤中的残留 试验表明，b t 蛋白进入土壤后，与土壤粘粒( 蒙脱石和高岭石) 、腐质酸和有机矿物聚 合体等表面活性颗粒迅速结合，且进入土壤后，这种结合态较之游离态，更难被土壤微生物 降解，而且保持长期杀虫活性。当转b t 基冈植物释放后，进入土壤杀虫蛋白的生物活性是评 价其环境状况和对非目标物种潜在风险的重要参数。c r e c c h i o 等不仅深入研究了从4 种不同 土壤中纯化的腐殖酸与纯化的b t 蛋白之间的动态吸附解吸平衡规律【4 5 1 ，还模拟自然土壤( 蒙 脱石腐殖酸- a l 羟基聚合体混合物) 对纯化的b t 蛋白的吸附特性，研究结果表明，在第1h 内，纯化的b t 蛋白的吸附达到总吸附量的7 0 ，在8h 内产生了最大吸附【蚓，有机矿物聚 合物的吸附量与b t 蛋白的量成正比。b t 杀虫晶体蛋白在土壤中的活性存留，b t 蛋白与土壤 颗粒的结合，增加了其对生物降解的抵抗性，从而保护了b t 蛋白的杀虫活性，因而能够在土 壤中长期残留。t a p p l 4 7 l 等研究表明，添加到土壤中的纯化的b t 蛋白可与土壤微粒结合，在 灭菌土壤中能够保持杀虫活性，且存留时间至少可达2 3 4 d ；然而即便是在非灭菌条件下4 0 d 后，活性持续时间与粘粒含量呈正比，而与土壤p h 值呈反比。 近年来，欧洲研究人员公布了几项基因农产品对人体健康和生态环境具有潜在危害的实 验结果，致使抵制转基的情绪不断蔓延，也加深了人们对转基因植物安全性的担忧【4 8 】，究转 基因植物的安全性就变的越来越重要。转基因植物安全性是个很复杂的问题，其核心是食品 和生态安全【2 8 4 9 1 。首先因转b t 基因植物多为农作物，故安全性最为人们所关注。食用后对 人体会不会造成损害是人们的首要想法，于转b t 基因的植物，其在杀灭害虫的同时也不可避 免地影响了生态系统中的其他生物，改变了自然界中长期存在的生态平衡，有可能产生难以 估量的后果。 5 两南大学硕十学位论文 转b t 基因植物的农业生态安全问题包括基因漂移导致的遗传污染，转基因的非靶标效 应、抗病虫性衰退及生物多样性下降。转基因植物进入大田试验和商品化生产阶段前进行生 态风险性评估是极其重要的矧。转b t 基因作物释放到田间后，是否会将所携有的外源基因 转移到近缘野生植物中，或是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡等都是 转b t 基因作物安全性的研究重点。 1 4 抗虫晶体蛋白降解 1 4 1 紫外线 紫外线( u v ) 对苏云金芽孢杆菌芽孢和晶体都有损伤作用，阳光中的紫外线是降低苏云金 芽孢杆菌制剂防治效果的首要因素。损伤机理可能是由于紫外线辐照后，晶体内的氨基酸产 生了过氧化物或氧化物自由基引起的；也可能与长时间的紫外线辐照破坏了伴孢晶体的表面 结构和形态，破坏了伴孢晶体蛋白的一级结构和立体结构，使之变脆，难溶于昆虫的胃液， 不能降解为具有杀虫活性的毒素蛋白，从而失去活力：也可能与阳光对苏云金杆菌晶体的钝 化作用和晶体蛋白的酪氨酸残基的受损有关。但大都归因于紫外线辐照使b t 蛋白失活。 l g n l f f o 纠5 1 1 认为紫外线辐照氨基酸产生自由基，使得b t 在大田条件下不稳定。c o h e n 掣5 2 1 根据拉曼光谱的研究和生物活性测定，提出紫外线辐照主要是引起了b t 蛋白的色氨酸和组氨 酸的破坏。有学者认为b t 蛋白与昆虫肠道上皮细胞受体相互作用需要色氨酸，色氨酸的破坏 导致b t 蛋白失去生物活性。 从田问残留来看，b t 蛋白经过2 3 d 的日光辐照基本失去活性【卯j 。崔云龙等将b t 菌置3 0 w 紫外灯下3 3c m 处辐照，辐照2h ，杀虫活性下降了7 8 ，辐照时间超过4h ，b t 蛋白基本全 部丧失活性。紫外线辐照影响b t 蛋白的溶解度。经紫外线处理过的b t 蛋白溶解度随辐照时 间延长而逐渐降低，紫外线辐照时间大于4h 就不能在碱性溶液中溶解，但还可以溶解在蚕 的胃液中，紫外线辐照时间超过5h 在碱性溶液和蚕的胃液中均不能溶解。电泳结果发现b t 蛋白条带随紫外线处理时间延长而迅速消失。电镜观察紫外线辐照4h 的b t 蛋白表面凹凸不 平，残缺不全，6 0 - 8 0 晶体棱角断失酬。随紫外线辐照时间的延长，b t 蛋白碱溶或酶解产 生的原毒素蛋白或毒性多肽的相对残留量呈现迅速下降趋势，同时，伴孢晶体对棉铃虫幼虫 的残留生物活性也迅速下降，二者表现出很好的一致性【5 5 j 。 1 4 2 土壤物理环境 转b t 蛋白降解的主要因素由土壤湿度、酸度、粘粒组成。首先，土壤湿度是影响b t 蛋 白在土壤中降解的原因之一 5 6 1 ，白耀字【4 5 1 等研究表明，淹水对c r yia b 降解的促进作用仅 发生在前1 2d 之内，此后多数时间内残留量在淹水与非淹水处理间无显著差异。其次，土壤 6 第1 章文献综述 酸度也是影响b t 蛋白降解的因素，在p h 值为中性的土壤中，生物测定法显示转b t 棉花和 玉米中的b t 蛋白的生物活性被很快降解。p h 值较低和粘土矿物质含量高的土壤不利于生物 的降解，而土壤中微生物的活性越高降解作用越快，如b t 蛋白在自然含有或人为加入高岭石 土壤中的杀虫活性比自然含有或人为加入蒙脱石的土壤高，且持续的时间长，其主要原因是 含蒙脱石的土壤p h 值高和细菌的活性强大程度上影响毒素蛋白在土壤中的降解。最后，不 少学者对b t 蛋白在土壤中粉粒、砂粒和泥砂粒级的土壤微粒上的吸附进行了研究，发现b t 蛋白不能吸附到砂粒和泥砂粒上，这是因为土壤中的粉粒、砂粒和泥砂粒不具有表面活性的 缘故。砂壤土和粘壤土中，转c r y l a b 基因棉花叶片和茎秆分解释放毒素的高活性状态可分 别持续2 8d 和4 0 7 1 。这种不同的结果是因为粘壤土中含有更高的土壤活性颗粒。s t o t z k y 等 对毒素蛋白在土柱中垂直运动的试验研究表明，在土柱中可检测到的b t 蛋白的含量与粘粒浓 度呈反比趋势5 8 1 ，说明b t 蛋白与土壤微粒的紧密结合大大减少了其在土壤中的降解。 1 4 3 土壤生物环境 b t 蛋白在土壤环境中失活或消除的途径个重要途径是通过土壤生物的作用【蝎1 。一方面是 昆虫消耗，即土壤中的b t 蛋白进入昆虫体内后被降解；另一方面是微生物的降解和最终的矿 化作用。这种降解方相伴或相继进行，其中土壤微生物是影响b t 蛋白在土壤中存留以及积累 的最关键冈子。土壤微生物对c r yia b 蛋白的降解影响显著，无菌士中c r yia b 蛋白的半消 减期明显长于有菌土中的，这和p a l m 等1 4 0 用y 射线处理土壤后的试验结果相似，据此可推 测，b t 稻粉碎叶中c r yia b 蛋白在试验的前6 d 大量释放，造成其快速降解的主要原因是 c r yia b 蛋白在自由态下被土壤微生物作为一种碳源或氮源分解利用所致。c r yia b 在有菌 水稻土中的降解快于无菌土中，表明土壤微生物存在可加快c r yia b 蛋白的降解，其降解过 程可用指数方程进行拟合。 1 5 检测b t 蛋白方法 传统上，对混合蛋白中的目标蛋白进行检测和定量分析，通常使用的是s d s p a g e 电泳 与w e s t e r n 印迹分析法、酶联免疫测定法( e n z y m el i n k e d i m m u n s o r b s e n ta s s a y ，e li s a ) 、生物 测定法。 s d s - p a g e 电泳与w e s t e r n 印迹分析法操作复杂，灵敏度不够。e l i s a 测定的是2 0 世纪 8 0 年代初利用抗原抗体特异性结合以及酶法测定原理建立起来的免疫学技术，操作简单、快 速，灵敏度强，检测极限高。1 9 9 5 年，t a p p 掣5 9 】用该方法测定土壤中的b t 蛋白，灵敏度达 每克土壤中含3n g b t 蛋白的最低极限。但也有研究表明，b t 蛋白进入土壤后就会迅速地被具 有表面活性的十壤颗粒吸附并紧密结合，目前没有很好的方法将它们提取出来，这部分蛋白 7 两南大学硕十学位论文 用e l i s a 法难以检测【6 晰2 1 但是b t 蛋白与土壤颗粒紧密结合后仍对敏感昆虫具有毒性，传 统的生物测定技术被用于研究土壤中b t 蛋白的残留。s i m s 等和z w a h l e h 等用烟蚜夜蛾 ( h e l i o t h i sv i r e s 2 c e n sf a b r i c i u s ) 和玉米螟( o s t r i n i an u b i l a l i sh q b n e r ) 做试虫分别研究了土壤中 b t k 毒素的降解以及在土壤环境条件下转基因玉米组织中b t k 毒素的降解动态。t a p p 等5 9 1 用烟草叶蛾做试虫，研究了b t k 毒素的降解与土壤矿物质理化特性的关系。生物测定技术也 有自身的缺点，首先，操作复杂且受到试虫的影响；其次，土壤中的成分很复杂，除了b t 蛋白对供试昆虫有毒性外，很可能还有其它的对试虫有毒性的成份，这些因素都会影响测定 的结果。 s d s p a g e 电泳原理：由于s d s 是一种阴离子去污剂，能破坏蛋白质分子之间或其他成 分之间的共价键联结，使蛋白质变性，改变原来的构象，形成s d s 一蛋白质复合物，呈带大 量负电荷的杆状分子。因此，在s d s 一聚丙烯酞胺凝胶中，s d s 蛋白质复合物的迁移率不再受 蛋白质的电荷、构型的影响，只取决于蛋白质的分子量，运用该原理，可测定蛋白质的分子 量。 e l i s a 原理：e l i s a 测定的是2 0 世纪8 0 年代初利用抗原抗体特异性结合以及酶法测 定原理建立起来的免疫学技术，操作简单、快速，灵敏度强，检测限极高。1 9 9 5 年，t a p p 等f 5 8 】片j 该方法测定土壤中的b t 蛋白，灵敏度达每克土壤中含3n g b t 蛋白的最低极限。但也 有研究表明，b t 蛋白进入土壤后就会迅速地被具有表面活性的土壤颗粒吸附并紧密结合，目 前没有很好的方法将它们提取出来，这部分蛋白用e l i s a 法难以检测i 舡6 2 1 本文采用s d s p a g e 电泳法和e l i s a 法。s d s p a g e 电泳法测定从b t 菌中提取得b t 蛋白，因为提纯的b t 蛋白浓度高，用s d s p a g e 电泳法可以很好的测定。e l i s a 法测定转 b t 基因水稻秸秆中b t 蛋白。因为s d s p a g e 电泳法灵敏度不够，而转b t 基因水稻秸秆中 b t 蛋白的含量通常很低，所以很难用s d s p a g e 电泳法测定转b t 基冈水稻秸秆中b t 蛋白。 8 第2 章绪论 第2 章绪论 2 1 立题思路 转b t 基因作物近年得到迅速的发展，大规模地种植转b t 基因作物也极有可能对农林生 态系统产生多方面潜在的危害。但是由于科学发展水平的限制，对转基因植物的环境安全性 还没有一致的结论，特别是缺乏系统、广泛的田间试验结果，尚不能作出精确的评价。转基 因植物的生态安全问题是世界各国科学家的研究热点1 6 3 】。 土壤中生活着丰富的生物类群，是一个重要的地下生物宝库，它们在土壤生态系统中起 着重要的作用而这些转入了外源基因的b t 抗虫植物在大田释放中对土壤非目标生物的影 响，尤其是随着商业化进程加快导致的对土壤生物多样性的影响是一个亟待引起人们重视的 研究领域。转b t 基冈植物可以通过不同的形式向土壤中释放b t 蛋白，b t 蛋白被土壤中的活 性颗粒吸附后会抑制微生物对其降解，致使b t 蛋白在土壤中长期滞留甚至富集，并且依然保 持杀虫活性，因而可能对土壤中非靶标生物造成不良影响，还可能影响土壤酶的活性，从而 迸一步影响土壤的理化性质和土壤肥力畔】。 已有研究证实，转b t 基冈植物的b t 蛋白田间释放后，可使土壤中b t 蛋白浓度高于使用 b t 制剂造成的残留。此外转b t 基因植物释放到土壤中的b t 蛋白，不易被土壤微生物降解， 并保持杀虫活性，这必然加剧了b t 蛋白的积累，因此可想而知，其危害性远比商业化b t 制 剂要大l 的】。导入土壤中的b t 蛋白存活能力主要取决于：b t 蛋白在土壤中残留浓度、昆虫幼 体消耗和钝化的速度、微生物降解的速度等。如果b t 蛋白残留的量超过了消耗、钝化和降解 的量，则在积累到一定浓度后，一方面可能增强靶标害虫抗性的选择和富集，另一方面可能 导致对非靶标生物体的持续危害，如土壤微生物群系，有益昆虫和其它动物，可能会破坏原 有土壤生物间的平衡，引发一系列的反应，尤其是级联效应可进一步扩大这种影响，最终可 能会影响到整个土壤生态系统的安全。 随着转b t 基因植物的大面积种植，其对生态环境的潜在风险正日益成为国内外关注的热 点。目前转b t 基因植物商品化生产的时间还不长，而其对环境安全的影响往往需要在相当长 的时期内才表现出来，此外目前实验中一些不显著的问题，在产业化规模种植较长时问后， 均可能会直接或问接对生态环境造成不利影响。因此，对于转b t 基冈植物b t 蛋白降解技术 的深入研究这对于保护生态环境、保障人类健康、确保生物技术沿着健康的轨道发展具有重 要的意义。 9 两南人学硕十学侍论文 2 2 研究内容 ( 1 ) 物理法降解b t 细菌中提取的b t 蛋白； ( 2 ) 生物法降解b t 细菌中提取的b t 蛋白； ( 3 ) 生物法降解转b t 基因水稻中b t 蛋白。 2 3 预期结果 ( 1 ) 探索高效降解b t 蛋白的方法； ( 2 ) 探索选用降解b t 蛋白方法的最优条件； ( 3 ) 筛选出降解b t 蛋白的酶； ( 4 ) 筛选出降解b t 蛋白的土壤微生物； 通过研究b t 蛋白降解技术，为以今后消除转b t 基冈作物对生态环境造成的潜在危害， 为保障生态环境安全提供基础数据及技术支持。 1 0 第3 章物理冈素降解苏云金芽孢杆菌b t 蛋白 第3 章物理因素降解苏云金芽孢杆菌b t 蛋白 3 1 引言 物理因素如紫外线照射是导致田间b t 杀虫剂失效的主要因素之一，王文军【5 5 1 等研究发 现紫外线对b t 伴胞晶体具有损伤作用，本章以此为依据研究紫外线辐照和6 0 c oy 射线辐照 对b t 蛋白的降解作用。选取紫外线辐照时问、距离、紫外灯功率及6 0 c oy 射线辐照剂量四 个因素，对b t 蛋白的降解作用做进一步探讨，为今后应用打下基础。 3 2 材料与设备 3 2 1 供试菌株 苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( s u b s p ) g a l l e r i a ) 购自中国农业微生物菌 种保藏管理中心，保藏号：1 0 0 2 9 。 3 2 2 实验试剂 试剂名称 巯基乙醇 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠( s d s ) e d t a t f i sb a s e 甘氨酸 二硫苏糖醇( d t t ) t e m e d 考马斯亮蓝r 一2 5 0 溴酚蓝 甘油 蛋白质m a r k e r 无水碳酸钠 过硫酸铵( a p ) 冰乙酸溶液 级别 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化