（生态学专业论文）一年生野大豆若干抗旱耐盐生理指标的研究.pdf

致谢一1 9 本研究工作及论文写作一直是在导师吴千红教授的精心 教导下完成的，并得到了郑师章教授长期悉心的指导，两 位先生渊博的知识、严谨的治学态度和细致的工作作风使 我获益匪浅。 感谢钟扬教授在数据分析上对我的指导。 感谢钱吉老师对我工作的具体指导和任文伟博士对我的 帮助。 感谢其他老师、师兄师姐、同学和朋友的关心、支持与 帮助。 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 一年生野大豆若干抗旱耐盐生理指标的研究 中文摘要 本研究用p e g 一6 0 0 0 ( 聚己二醇一6 0 0 0 ) 在室内模拟干旱条件，对抗旱性不同 的儿个野生大豆品种在1 5 p e g 一6 0 0 0 ( 中度胁迫) ，和3 0 p e g - 6 0 0 0 ( 深度胁迫) 下，测定组织水分变化，超氧自由基、细胞膜过氧化产物m d a 、s o d 、p o d 、c a t 酶活、游离脯氨酸( p r o ) 、可溶性糖( s s ) 等的生理生化指标，对比在中度渗 透压力和高度渗透胁迫压力下的生理变化。在不同的浓度梯度下，这些生理指标 都做出了不同程度的反应，发现组织水分的变化是最明显、最直接的反应，渗透 物质的积累也表现较突出。( 活性氧防御酶受环境影响比较大，对酶活进行综合比 较，结果在迅速p e g 胁迫下，综合酶活下降。对各品种的三种酶活和渗透调节物 质可溶性糖和游离脯氨酸，以及酶活、渗透调节物质和超氧明离子及丙二醛分别 进行聚类分析，结果表明，在野生大豆苗期，深度胁迫下综合酶活在诸多生理活 动中具有相对主导地位。 用n a c i 溶液作为渗透胁迫剂模拟盐碱环境，对1 0 个不同耐盐性野生大豆 品种分别在l o o m m o l l n a c l 和1 5 0 m m o l l n a c l 溶液迅速胁迫的逆境条件下测定组 织含水量，超氧自由基、细胞膜过氧化产物m d a ；s o d 、p o d 、c a t 酶活；游离脯 氨酸、可溶性糖等生理生化指标，对比在中度渗透压力l o o m m o l l n a c l ，和深度 渗透胁迫1 5 0 m m o l l n a c l 压力下的生理变化。在不同的浓度梯度下，s o d 、p o d 酶活的上升较明显、各品种的综合酶活普遍升高，综合渗透物质的积累也表现较 突出，同时发现作为渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖有相互补充的作用。通过聚 类分析也表明，在两种胁迫下，在所测的生理指标中酶活在野生大豆的生理活动 中具有相对重要的作用。 在胁迫条件下，从水分变化得出品种间生活期有较大的差异，大豆是光周 期敏感植物，对温度和日照比较敏感，不同野生大豆品种酶活等一系列生理特性 随着生育期的不同而发生较大的变化。、7 、 关键词：一年! i ；垦骜于草和女潋塾生理特性。 中圈分类号：q1 4 5 文献标识码：a 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文 s t u d i e so ns o m ep h y s i o l o g i c a ic h a r a c t e r i s t i c so fd r o u g h t r e s i s t a n c ea n d s a l t e n d u r a n c ei na n n u a lw i l ds o y b e a n s ( g l y c i n es o j a ) a b s t r a c t e l e v e nv a r i e t i e so ft h ew i l ds o y b e a nw i t hd i f f e r e n tw a t e rd e f i c i t t o l e r a n c e sh a v eb e e nd i s p o s e dr e s p e c t i v e l yi n1 5 p o l e t h y l e n e ( p e g6 0 0 0 ) ( am i l dw a t e rd e f i c i t ) a n d3 0 p e gs o l u t i o nf o r4 8h o u r s s o m ep h y s i o l o c a l i n d e x s i n c l u d i n g t h e e n g e n d e rs p e e d o f s u p e r o x i d er a d i c a l ( 0 2 一) ，t h e a c t i v i t yo fs u p e r o x i d e rd i s m u t a s e ( s o d ) ，p e r o x y d a s e ( p o d ) 。c a t a l a s e ( c a t ) ， t h ec o n d e n s eo fm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) ，f r e ep r o li n e ，a n ds o l u b l es u g a r ( s s ) i nt h el e a fo f s o y b e a na r em e n s u r a t e d t h er e s u l t ss u g g e s t t h a tt h e c o n d e n s eo fw a t e ri nt i s s u ei sd i r e c t l ya n dc l e a r l yt or e s p o n s et ow a t e r d e f i c i t t h eo s m o t i ca d j u s t m e n ts o l u t e sa r ea c c u m u l a t e d t h ea c t i v i t yo f t h ee n z y m ei sa f f e c t e de a s i l yb yt h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r s t h r e ek i n d s o f e n z y m e ，i e s o d ，p o d ，c a t ，a r es p l i c e dg e o m e t r i c a l l y t h e r e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ea c t i v i t yo fe n z y m e sg e n e r a lr e c e d e s t h er e s u l t so f c l u s t e r i n ga n a l y s i ss u g g e s tt h a tt h ee n z y m ei sm o r ei m p o r t a n tt h a no t h e r s i nt h ec o n d i t i o no fs e r i o u sw a t e rd e f i c i ti nw i i ds o y b e a n t e nv a r i e t i e so ft h ew i l ds o y b e a n ，w h i c ht h e ya r ed i f f e r e n td u r a b l e t os a l t a r et r e a t e di nl o o m m o l la n d1 5 0m m o l ln a c ls o l u t i o nf o r4 8 h o u r s t h ea n a l y s i so f0 2 一，s o d ，p o d ，c a t ，肋a ，f r e ep r o l i n e ，a n d s o l u b l e s u g a ri nt h el e a fo fw i i ds o y b e a n s a r ep e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o wt h a t t h ea c t i v i t yo fe n z y m e sa s c e n d sa n do s m o t i ca d j u s t m e n ts o l u t e sa c c u m u l a t e a tt h es a m et i m e ，t h ef r e ep r o l i n ea n ds o l u b l es u g a ra r ec o m p l e m e n t e de a c h o t h e r t h er e s u l t sa b t a i n e df r o mt h ec l u s t e r i n ga n a l y s i si n d i c a t et h a tt h e e n z y m ei st h e m o s ti m p o r t a n ti ns om a n yi n d e x e si nt w oc o n c e n t r a t i o ng r a d s k e y w o r d s ：w i l ds o y b e a n ，w a t e rd e f i c i t a n ds a l ts t r e s s ，p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r is t i c s 2 一 一年生野丈豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 前言 大豆是世界最主要的蛋白质资源和油料作物，在我国的粮食结构中具有举 足轻重的地位。中国是栽培大豆的发源地，占有世界野生大豆资源总量的9 0 以 上。自4 0 年代以来，我国学者对野生大豆进行了广泛的多学科的研究，在野生 大豆的分布与生境、形态发育与生态性状、生理生化特性、对病虫害的抗性、细 胞遗传及杂交育种以及分类进化等方面都取得了重要的成果( 庄炳昌，1 9 9 9 ) 。 自1 9 7 0 年玉米小斑病在美国流行造成巨大损失后，作物遗传脆弱性的问题 引起了世界各国的高度重视。长期以来，大豆的品种改良主要采用优良品种杂交 的方式，使得国内外大豆品种的遗传基础极为狭窄。针对这一现状，许多科技工 作者在拓宽大豆遗传基础方面进行了一系列探索。我国学者较旱便认识到野生大 豆的潜在利用价值，从8 0 年代初在全国野生大豆考察的基础上，对中国野生大 豆进行了较为系统的研究，在理论和实践上均取得较大进展。 过去有关野生大豆的研究虽然很多，但仍然满足不了育种的需要，主要是 研究的范围和群体不够，很可能有许多优异基因型没有被挖掘出来。因此，对野 生大豆进行全面系统研究，以拓宽大豆育种的遗传基础，使资源的优势真正成为 生产优势十分必要与迫切。虽然野生大豆9 0 资源在中国，但从1 9 5 4 起年美国 大豆的产量就超过中国( 东北师范大学生物系，1 9 8 1 ) 。近些年，美国学者利 用中国的野生大豆筛选一些抗性基因，使得美国的大豆大面积种植在西部干旱土 地区，产量大为增长，1 9 9 8 年，美国转基因大豆的种植面积已达全美大豆总面 积的3 0 ( 海客，2 0 0 0 ) 。 逆境给大豆生产带来严重的危害，影响大豆的品质和产量。作物抗旱抗盐 性的研究己成为当今植物生理学研究的热点之一。大豆抗性机理尤其是抗性鉴定 指标的研究对于逆境的预测，对大豆的育种具有指导意义。 近年来，国内外抗逆性机理作了许多工作，但野生大豆的抗性机理研究还 很少，为了指导野生大豆在大豆育种中的应用，急需开展野生大豆的抗性生理研 究。在抗旱抗盐方面，存在着许多有争议的地方，如干旱条件下游离脯氨酸积累 作为抗旱鉴定指标报道，结果不一致，在不同生长期不同组织部位都有比较大的 差异，甚至是相反的结果，在野生大豆抗性鉴定上也存在相似的疑点，在抗旱抗 年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文4 盐性的有必要寻找更具有普遍意义的鉴定指标( 邹琦，1 9 9 4 ) 。 本研究选用陕西干旱地区栽培的不同抗旱性和耐盐性的野生大豆种子( 由 吉林农业科学研究院提供) ，用水培法进行栽培，在野生大豆的苗期用不同浓度 的p e g 和不同浓度梯度n a c l 溶液来作为渗透物质，构成一个中渗和高渗的环境， 在胁迫4 8 小时后，用野生大豆叶片实验，比较活性氧( 0 2 - ：超氧阴离子) 、防 御酶( 超氧化物歧化酶：s o d ，过氧化物酶：p o d ，过氧化氢酶：c a t ) 、有机渗 透调节物质( 游离脯氨酸，可溶性糖) 、细胞受伤害的程度( 丙二醛：m d a ) ， 比较不同品种的野生大豆的有关生理特性，给野生大豆更迸一步的研究和利用提 供科学依据。 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 文献综述 ( 一) 、植物抗旱耐盐性的生理研究进展： l 、抗性的生理研究进展 环境因素始终影响着植物的生长发育。当环境因素的刺激超过一定的阈值 时，就成为胁迫因子。例如水分因子是众多环境因子中的一个极其重要的因子， 对植物的生长的限制作用很大。因此，水分亏缺对植物的影响方面的研究就显得 非常重要，正成为国内外研究的热点。 干旱、高盐往往都是由于引起水分亏缺而导致植物伤害，所以作物抗旱抗盐 的研究在国内外一直受到高度重视。这些研究包括：水分胁迫下光合作用的气孔 和非气孔限制：植物细胞壁弹性和塑性在作物抗性中的意义；渗透物质的调节 作用，游离脯氨酸( f r e ep r o l i n e ) 积累( 李德全等，1 9 9 2 ；任文伟等，2 0 0 0 ；b a k e r e ta 1 ，1 9 9 3 ) 、渗透调节的产生与加强( 李德全等，1 9 9 2 ： m o r g a n ，1 9 8 4 ) ； s o d 酶p o d 酶活性和细胞膜透性及细胞膜组分变化( 庄炳昌等，1 9 9 3 ；任文伟等， 1 9 9 7 ：阎秀峰等，1 9 9 9 ) 。水分胁迫下植物体内源脱落酸( a b s c i s i ca c i d ) a b a 浓度增高( 邱德有等，1 9 9 3 ：汤章城等，1 9 8 3 ：h a r t u n g d a v i e s ，1 9 9 1 ；z h a n g d a v i e s ，1 9 9 0 ) 等。近年来由于生产实践的迫切需要和研究手段的进步，作物抗 旱抗盐性的研究已从抗性的形态特征向生理生化和分子生物学方面不断地深 入，包括：植物细胞信号传递，如逆境信号a b a 的产生和运输及气孔响应和基因 表达的调控( 梁建生等，1 9 9 8 ) ；水杨酸( s a ) 在植物抗病反应中诱导植物积累 病程相关蛋白( p r s ) 的作用和s a 结合蛋白( s a b p ) 的特性和功能等( 蔡新忠， 1 9 9 8 ) ；渗透逆境诱导的特异性蛋白和l e a 蛋白( 1 a t ee m b r y o g e n e s i s a b u n d a n t d r o t e i n s 胚胎发生晚期丰富蛋白) 具有抗氧化性和热稳定性( 李妮亚等，1 9 9 8 ： 傅家瑞等，1 9 9 6 ，1 9 9 9 ) ；泛肽与植物逆境响应( 侯学文等，1 9 9 9 ) 等均取得 了较大的成果。 在水分胁迫与活性氧代谢关系的研究中，1 9 7 9 年8 e w l e y 首先提出植物旱害 与耐旱机制的自由基假说。之后，人们用不同的材料对这一问题进行了多方面的 探讨，取得了一些进展。大量的研究表明，植物遭受逆境或在衰老的过程中，细 胞内活性氧产生和消除的平衡会遭到破坏，积累起来的活性氧就会对植物细胞造 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 成危害。许多文献报道干旱胁迫下活性氧增加，不抗的品种比抗旱的品种产生的 活性氧的速度快( d h i n d s a m a t o w e ，1 9 8 1 ；邹琦，1 9 9 4 ) 。水分胁迫对植物 细胞膜脂过氧化有促进作用，表现在水分胁迫下组织过氧化产物丙二醛( m d a ) 含量的增加。植物在遭受逆境过程中，体内有活性氧清除系统，分为非酶促和酶 促两类，前者主要有维生素e 、维生素c 、类胡萝h 素及一些含巯基的低分子化 合物( 如谷胱甘肽、半胱氨酸) 等，后者主要包括s o d 、p o d 、c a t 、g r 等。植物 体内活性氧的酶促清除系统的活性在水分胁迫下的变化依胁迫处理方式、强度及 材料等不同而异。一般来说，在水分胁迫下抗旱品种或种具有较高的s o d 、c a t 活性，具有较低的膜脂过氧化水平，关于p o d 活性与抗性的关系尚存在争论。p o d 酶一方面可清除h 2 0 z ，另一方面它参与组织衰老过程中叶绿素的降解( k a r ， 1 9 8 7 ) ，并引起不饱和脂肪酸的过氧化( n i i n o m i ，1 9 8 7 ) ，为衰老组织中不断 积累的活性氧来源之一( t h o m p s o n ，1 9 8 7 ) 。在小麦、水稻等植物上的研究似乎 表明水分胁迫下抗旱品种一般具有较高的p o d 活性，但在大豆上的研究所得到的 结果则相反。宋淑英( 1 9 8 7 ) 、邹琦( 1 9 9 4 ) 等在大田条件下的实验证明，干旱 条件下p o d 活性与膜透性呈显著正相关，不抗旱品种较抗旱品种在干旱的条件下 具有较高的p o d 活性，郭葛光等( 1 9 8 9 ) 曾报道在玉米老叶、中p o d 活性与品种抗 旱性无确切关系。近几年，有学者从不同种源羊草进行了酶活的生理生态研究， 得出生境对酶活性具有重要的影响( 任文伟等，1 9 9 7 ) ，从细胞生理水平到种群 的水平上横向扩展深入研究。 现在研究者已注意到逆境压力( 旱、涝、u v 、重金属污染、病虫害等) ， 活性氧所造成的氧化胁迫是一种普遍现象，所以许多研究者从自由基机理探讨 抗性机理。张木清、余松烈等( 1 9 9 6 ) 以甘蔗为材料从抗氧化代谢的角度在渗 透胁迫下作为生长调节物质的多胺的调节机制；柯德森、王爱国( 1 9 9 7 ) ，研 究乙烯与活性氧的关系；蒋明义( 1 9 9 7 ) 等研究渗透胁迫下自由基的产生和影 响：s m i r n o f f c u m b e s ( 1 9 8 9 ) 证实体外脯氨酸具有清除活性氧的作用，研究 工作者对渗透物质的作用有了新的认识。蒋明义等( 1 9 9 7 ) 已发现水稻中体外渗 透物质脯氨酸具有对+ o h 、1 0 z 有明显的专一清除作用。 在渗透有机物质调节上，目前的普遍都认为在渗透胁迫压力下，脯氨酸和 可溶性糖作为有机渗透物质在积累。但是，脯氨酸的研究的争论并没有停止过， 在不同的植物上表现不同，s i n g h ( 1 9 7 2 ) 认为干旱条件下抗旱性强的大麦品种 年生野大豆抗早耐盐的若干生理指标的研究 复旦太学硕士毕业论文7 较抗旱性弱的品种积累更多的脯氨酸，脯氨酸的积累与抗性成正相关，而h a n s o n ( 1 9 7 7 ) 等同样用两种不同抗旱性大麦为实验材料进行测定发现，在干旱胁迫时 水分含量下降得快的品种其积累脯氨酸的速度也快，即对干旱敏感的品种水势下 降得快，累积脯氨酸也快，从而提出品种间累积脯氨酸的差异取决于胁迫下水分 状况的变化，曹仪植等则提出，不抗旱的小麦品种较抗旱的小麦品种积累游离脯 氨酸更快，邹琦等( 1 9 9 4 ) 用7 个抗旱性不同的小麦品种试验，结果是干旱条件 下抗旱品种和不抗旱品种间脯氨酸的积累没有规律性，同时他们认为脯氨酸的消 涨不仅和植物的品种有关而且还和植物的生育期、植物的不同部位以及胁迫方式 有关。最近几年，在不同品种，不同处理上研究的结果，普遍上认为抗的品种较 不抗的品种积累脯氨酸的能力强。任文伟等( 2 0 0 0 ) 对不同地理种群羊草在聚乙 二醇胁迫下脯氨酸含量进行比较研究，得出抗旱性强的羊草游离脯氨酸积累时间 长，而且得出羊草的抗旱性与脯氨酸的积累特性与其生境有着密切的联系。 总结得出植物应激水分胁迫方式主要有：( 1 ) 外部形态、解剖结构及生长速率 的调整；( 2 ) 气孔运动调节：( 3 ) 渗透调节：( 4 ) c 0 2 体内再循环与碳同化途径的改变： ( 5 ) 植物激素调节：( 6 ) 植物对水分胁迫信息的感知和传递等。 归纳前人的工作，水分胁迫压力下，植物抗性和耐性的策略主要有： ( d 增加渗透物质如甘露糖醇、果聚糖、脯氨酸和甜菜碱的含量，以增强 细胞渗透调节的能力： ( 2 ) 增强有关酶类的超表达以提高叶绿体清除自由基的能力； ( 3 ) 控制k + 转运系统h k t ，及水孔蛋白的活性； ( 4 ) 增强根细胞、叶肉细胞等质膜和液泡上n a + h + 反向运转的能力，以减 少对外界n a + 的被动吸收。转基因植物研究运用中主要的方向是提高 渗透物质和清除氧自由基的酶活。在这方面研究已经取得了较大的进 展。 2 抗旱抗盐性鉴定进展： 目前进行抗旱性鉴定的方法很多，有田间直接鉴定法、干旱棚法、人工气 候室法、盆栽法、室内模拟干旱条件法。这些方面各有优缺点，适用于不同的时 期，不同目的的抗旱性鉴定与研究。 田间直间鉴定法：就是把种子直接播种在大田利用自然水不足或控制浇水 等方法，造成干旱胁迫，在整个生育期内测定一些与抗旱有关的形态或生理生化 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文8 指标，最后测产量，计算抗旱系数、抗旱指数等。这种方法投资小，简单易行， 无需特殊设备，又有产量的结果做保证，容易被人接受，但受环境因素影晌严重， 年间变化大，重复性不好。 盆栽鉴定法：就是把种子播于盆内，人工控制浇水，可以根据实验目的， 在任何生育期内进行不同程度的干旱胁迫处理，但工作量大，不能进行大批量进 行，且与大田实际情况存在一定的差异。 人工气候室与干旱棚鉴定效果好，但投资大，设备复杂，只能用于对少量 材料的深入研究。 室内模拟干旱条件法就是在实验室内人工模拟干旱条件，具体做法可以用 p e g 、甘露醇或发芽垫蒸干等办法，造成干旱胁迫，方法简单，重复性好，适于 大批量进行，但只能做萌发期、苗期鉴定，后期的鉴定比较困难。 抗旱鉴定的指标可分为两大类，一是形态指标，如抗旱指数、抗旱系数、 株高、生长速度、根系、分蘖、叶片形态等；二是生理生化指标，如相对含水量、 自由水、束缚水、叶水势、渗透势、叶保水力、叶水亏、呼吸、光合、气孔扩散 阻力、蒸腾、叶绿素含量、可溶性物质、s o d 酶、生物碱、渗透调节等。许多研 究者都以干旱条件下的产量的实际表现作为最终的抗旱指标。 综上所述，目前进行抗旱鉴定的方法和指标很多，但方法与指标的多样性 也造成了鉴定工作的混乱，因此，还有待于建立抗旱鉴定的标准化程序，但这个 定性和定量的工作还是需要付出很大的努力。 在抗性生理指标的研究中的常规技术路线( 如图1 ) ，本实验主要采取这样 的方法而进行。 ( 二) 、野生大豆的研究现状 、 我国是野生大豆的发源地，中国的野生大豆资源占世界总数的9 0 左右。 我国野生大豆的研究历史较长，早在4 0 年代，我国学者丁振麟等就进行了野 生大豆与栽培大豆的种间杂交，研究了许多重要的形态及农艺性状的遗传规 律：王金陵等对野生大豆和栽培大豆的若干性状从演化角度进行比较研究。野 生大豆的研究引起广泛关注是7 0 年代末期的全国野生大豆考察之后，对野生大 豆进行农艺学、形态学性状的观察，并对部分材料进行品质性状分析，这一 阶段的研究比较分散，缺乏系统性。对野生大豆进行全面系统的研究始于8 0 年代初，1 9 8 2 年开始，吉林大豆研究所徐豹等首先对中国不同纬度、不同进 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文 化类型大豆的光温生态型、蛋白质含量、抗性进行了较全面的分析。复旦大 学生态研究室进行“东北大豆种质资源拓宽研究”1 9 8 9 自然科学基金重大项 目，；“野生大豆基础生物学的研究”( 1 9 9 2 自然科学基金重点项目) ；“野 生大豆种群生态研究”( 博士点基金) ；“野生大豆分子生态学研究”( 自然 科学基金) ，对野生大豆在基础生物学和应用研究上都取得了比较大的成果。中 国科学院植物研究所在野生大豆的群体遗传学方面做了长期的研究，取得了较大 的进展。 随着物种资源数量过速增长，给资源的保存和管理带来较大的困难，为 了有效地利用植物遗传资源，f r a n k e l ( 1 9 8 4 ) 首次提出“核心种质”的概念。 所谓的“核心种质”：其核心内容是指反映某一植物种群的遗传多样性的小样本 群体，该群体的构建为育种家提供了一个可以选择几乎所有遗传变异的可操作 群体，而这对于整个样本群体而言，几乎是不可能的。“核心种质”的构建 不仅对于植物资源的保存与研究具有重要的意义，而且对于种质资源的利用以 及育种也具有重要的意义。国家自然科学基金1 9 9 7 年支助的“野生大豆优异种 质的评价和利用”重点项目( 本研究为其子课题) ，主要内容是构建能够反映 我国野生大豆遗传多样性的基础群体，采用田间自然鉴定和人工接种鉴定相结合 的方法，对其“核心种质”进行主要病虫害、逆境的抗性评价和抗性机理研究。 该研究具有重要的实际意义。 年生野大豆抗旱耐盐的若千生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文1 0 技术路线 图i 常规技术路线 1 0 _ 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文11 材料方法 ( 一) 、供试材料 l 、1 1 个抗旱性不同的野生大豆品种由吉林农科院大豆所提供 7 个抗旱品种( 大田鉴定结果) ： r 1 ( 9 8 y 一2 8 ，z y d o l 0 0 0 ) ：r 2 ( 9 8 y 一3 7 ，z y d 0 1 1 3 2 ) ： r 3 ( 9 8 y 4 3 ，z y d 0 1 1 5 3 ) ；r 4 ( 9 8 y 一1 8 0 ，z y d 0 1 9 1 3 ) ； r 5 ( 9 8 y 1 8 2 ，z y d 0 1 9 3 6 ) ； r 6 ( 9 8 y 一2 2 7 ，z y d 0 2 3 9 4 ) ； r 7 ( 9 8 y 一1 9 0 ，z y d 0 2 0 0 2 ) ： 1 9 9 8 年在陕西西安某地1 9 9 8 年年降雨量为2 7 8 9 m m 的条件下栽培后能够成 活的为抗旱品种。 4 个不抗旱品种： u 1 ( 9 8 y 1 1 9 ，z y d 0 0 5 5 0 9 ) ：u 2 ( 9 8 y 一2 0 6 ，z y 9 0 2 4 0 1 ) ； u 3 ( 9 8 y 一2 2 3 ，z y d 0 2 4 1 8 ) ；u 4 ( 9 8 y 一2 3 l ，z y d 0 2 1 2 6 ) ； 9 8 年田间直间鉴定的结果：r 1 、r 2 、r 3 、r 4 、r 5 、r 6 、r 7 为抗旱的品种， 其中r 1 、r 2 为抗三级。 9 9 年田间鉴定的结果：r 5 为抗旱一级，r 4 为抗旱二级，r 6 为抗旱三级， r 7 为抗旱四级。 2 、l o 个不同耐盐性野生大豆品种 耐盐品种： r 1 ( 5 0 0 2 4 2 ) ： r 3 ( 5 0 1 0 9 一1 ) ； r 5 ( 5 0 3 0 0 9 7 ) ： 不耐盐的品种： u l ( 5 0 0 7 2 2 ) ； u 3 ( 5 0 1 0 0 3 8 ) ： u 5 ( 5 0 4 l l 一3 ) ： r 2 ( 5 0 1 0 0 3 2 ) r 4 ( 5 0 3 0 4 2 4 ) u 2 ( 5 0 0 8 5 - 2 ) u 4 ( 5 0 3 0 5 3 7 ) 1 0 个均为9 6 年的种子。( 这种大田直接鉴定方法得出的结果，因为重复性 比较差，所以在后面的讨论中并没有完全依据田间鉴定的结果来进行抗性品种和 1 1 - 年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 不抗性品种间的绝对的对比。) 3 、植物的培养与处理 材料培养： 用m s 培养液水培法进行培育，阳光充足的条件下培养2 3 周。 材料处理： 等长出2 片复叶时，不同抗旱性的野生大豆苗的根部分别用1 5 和3 0 9 6 的p e g 一6 0 0 0 溶液( 渗透势约分别为一0 3 9 0m p a 和- 2 0 0 0 m p a ) 胁迫 4 8 小时 根据b u r l y ne m i c h e l1 9 7 3 ，以 f s 营养液培养为对照，然后把 m s 营养液、1 5 p e g 和3 0 p e g 胁迫后的野生大豆真叶以上的叶子和茎进行 实验。不同耐盐性的野生大豆苗的根部分别用1 0 0 m o l l 和1 5 0 m m o l ln a c l 胁迫4 8 小时，以m s 营养液培养为对照，然后用野生大豆真叶以上的叶子 和茎进行实验。所有的品种的胁迫开始处理都在同一天上午进行。实验材 料来自相同处理下的不同植株，实验操作进行三次。 材料的储备： 把胁迫后得到的所需实验材料放在液n z 保存。 ( 二) 、实验方法： l 、p o d 的测定：按刘祖棋等( 1 9 9 4 ) 愈创木酚显色法。 2 、s o d 的测定：按刘祖棋( 1 9 9 4 ) 等n b t 光化还原法。 3 、a 的测定：按刘祖棋( 1 9 9 4 ) 、赵世杰( 1 9 9 4 ) 等双波长硫代巴比妥酸法。 4 、c a t 的测定：按x h 波钦诺克( 1 9 8 1 ) 碘量法。 5 、0 ：一的测定：按王爱国等( 1 9 9 0 ) 羟胺氧化法。该方法灵敏度高，重复性好( 杨 保收，1 9 9 9 ) 。略做改动，在提取液中加入羟胺溶液，产生亚硝酸根后， 加入0 i m o l l 盐酸0 i m l ，使反应体系在p h2 2 5 之间，加入对氨基苯磺 酸进行重氮化的反应，然后再加入卜萘胺进行偶氮染料的显色反应( 何增 耀，1 9 9 0 ) 。 6 、蛋白质的测定：按张德安等( 1 9 9 1 ) 考马斯亮蓝法测定蛋白质。 7 、可溶性糖：按上海植物生理学会编( 1 9 8 5 ) 蒽酮比色法。 8 、游离脯氨酸测定：按朱广廉等( 1 9 9 0 ) 、欧仕仪等( 1 9 8 8 ) 茚三酮法。 9 、植物组织含水量的测定：按上海植物生理学会恒重法( 1 9 8 5 ) 。 ( 二) 、数据处理： 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 本实验从种子发芽到苗期实验的过程都在相同的季节相同的时间进行，因 为野生大豆的品种来源不同，可能来源于不同的地理区域，品种间的生长 发育期完全不一致，难以控制在完全相同的生活时期，为了进一步增加数 据的可比性，在数据处理时运用相对值来比较，即在胁迫条件下得出的值 相对于对照的比值。因此数据没有量纲。 对应指标间进行相关分析，求出相互间的相关系数，比较指标间的相互联 系；同时又用p h y l i p 软件( f e l s e s t e i n ，1 9 9 7 ) 来对相关系数进行聚类分 析，得出各指标间的相互关系。 基于生命活动的复杂性，同时酶活和游离脯氨酸有许多争论，这些指标的 生理功能相近，为了考虑它们的综合结果，借鉴物理学和数学的矢量加和 方法，试采用几何叠加法： 图2 几何叠加示意图 d 2 = a 2 + b 2 + c 2 ，a 、b 、c 、d 分别为长、宽、高和对角线。 4 、表征分析方法：用于表征分析的7 个性状，其中数量性状均取最大观测值， 选取试验的抗旱品种1 1 和耐盐品种1 0 个作为分类运算单位，对应的数据 矩阵见附录6 、7 。 原始数据矩阵经过级差标准化处理后( 见附录8 、9 ) ，采用平均欧氏距离 系数和u p g i a a 法进行聚类分析( 钟扬等，1 9 9 0 ) 。 年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文1 4 上上 医磊习 i一 图3 表征分析法过程图 1 4 一 上圈 一年生野大豆抗早耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 结果与分析 ( 一) 、在p e g 渗透胁迫下抗旱与不抗旱的品种的几种生理指标对比 1 在p e g 胁迫下不同野生大豆品种的水分的变化 1 1 野生大豆苗根系在1 5 p e g 中度胁迫4 8 小时后，水分丧失不明显，每个品 种的d w f w 的值为对照的值的卜2 倍。在3 0 p e g 深度胁迫4 8 小时后，水分 含量有较明显的变化，i h f w 的值为对照的卜3 倍。 1 2 其中两个梯度间水分变化很小的种是u 3 、u 4 、r 2 、r 6 。 l _ 3 对r 6 在1 5 p e g 和3 0 p e g 的胁迫下叶f f 为对照的1 8 l 倍和1 9 倍，两个 梯度间水分变化差异小。 水分变化最大的是r 3 ，从中度胁迫到深度胁迫 d w f w 为对照的1 0 7 到3 9 0 。( 图4 ) 图4 渗透胁迫f 野生大旦的脚h 的相对变化 ( 注：1 ：指1 5 p e g ：2 ：指3 0 p e g ) 1 4 从野生大豆水分的变化分析：在中度胁迫的条件下，品种间的差异体现不 明显，在深度胁迫条件下，每个品种对水分的持有能力就有了很大的变 化，品种间的差异很显然的体现出来。 u 3 、u 4 、r 2 、r 6 是在两个梯度间水分变化很小的品种，在大田栽培的 情况下，显示较早就进入花期和荚期。尤其是u 3 、r 2 ，从表形上看茎粗矮、 无卷茎、叶子老、分枝少并与栽培大豆更接近( 见附录1 ) 。中国野生大 豆生物学研究( 庄炳昌，1 9 9 9 ) 一书指出，野生大豆是一种短日照植物， 对光照十分敏感，不同纬度区野生大豆各生育期阶段的差别很大，特别是 年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文1 6 出苗期至花期更为明显。徐豹( 1 9 8 3 ) 曾进行过野生大豆光温生态类型的 划分，不同纬度来源的野生大豆同地栽培，它们会处在不同的生育期。大 豆自北方向南引种后，由于南方日照短，温度高，而甚弱的短日照很快得 到满足，因而开花成熟早。推断出u 3 、r 2 可能是分布偏北的品种，因此， 细胞水分含量不同。 2 超氧自由基与m d a 的变化 m d ( p e g ) 35 0 0 0 亢 30 0 0 0 一 八 25 0 0 0 八尸 2 0 0 0 0 | | 只 i 5 0 0 0 n 、矿| o - 2 1 0 0 0 0 一专斛￥ o5 0 0 0 y 00 0 0 0 i j lu 2u 3u 4 r lr 2r 3r 4r 5r 6r 7 图5 渗透胁迫下野生大豆的0 2 一、m d a 的相对变化 2 1 在1 5 p e g 胁迫下，5 0 品种的超氧自由基，6 0 品种的m d a 高于对照。 2 2 在3 0 p e g 胁迫下，4 0 品种的超氧自由基，8 0 品种的m d a 高于对照。 2 3 在两个胁迫下，随着渗透胁迫的加深，5 0 品种0 z 一产生速度增大；8 0 品种 m d a 增大。( 图5 ) 2 4u 2 、r 1 、r 3 、r 7 在0 。一的产生速度、m d a 的积累都是较小，这与水分含量上 的结果相吻合，随着胁迫强度的加大，水分丧失明显，0 z 一的产生速度加快， 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文 膜脂过氧化程度加深。 2 5 u 3 、r 2 、r 5 的变化在两种胁迫下，0 z 一的产生速度、m d a 的积累都是最大。 可能由于u 3 、r 2 生育期较晚，组织比较老，应激能力弱，产生的自由基多， 对细胞膜的过氧化作用也强，不同梯度的胁迫下，自由基产生速度和膜脂 氧化程度也没有太大变化，这与水分变化相符。对于r 5 ，从外型上来分析， 叶子茂盛，而且叶片比较薄、比较大，在胁迫时，是最早在叶缘上作出干、 卷反应的品种，对渗透压力相对比较敏感。从这一点上，就与田间鉴定的 结果难一致。 3 渗透胁迫下s o d 、c a t 、p o d 酶活性变化 3 1s o d 、c a t 、p o d 相对变化都在o 5 一1 5 倍间变化。在深度胁迫p o d 的相对值 均1 0 。在u 系列中随着渗透胁迫强度加大，c a t 都在下降，为对照的 0 5 - 0 9 倍。( 图6 ) 3 4 中度胁迫下，5 0 品种s o d 、3 9 品种c a t 、2 9 品种p o d 酶活高于对照。 3 5 深度胁迫下，2 9 7 0 品种s o d 、2 9 品种c a t 、9 品种p o d 酶活高于对照。 3 6 在两个胁迫间对比，随着胁迫程度加深，5 9 品种s o d 降低；1 9 几乎保持不 变：6 9 品种c a t 在降低；8 1 品种p o d 酶活在降低。 3 7u 3 、r 2 两个较早进入下个生育期的品种，它们的s o d 酶活性比其它几个品 种高，在两种渗透胁迫梯度间几乎没有差异，这与水分和o f 的变化一致。 因为s o d 酶是受0 ：一直接诱导的，0 t 一升高，必然导致s o d 酶活的升高，此 时，s o d 酶活的升高还是不足以抵制o ：一的积累。对于r 5 ，中度胁追下， s o d 酶比较高，也是与高的0 ：一有一致性，但是，在深度渗透胁迫下，s o d 酶活已经下降，可能对于r 5 来说，体内水分匮缺造成的伤害作用已经比较 严重。 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 图6 渗透胁迫下野生大豆s o d 、c a t 、p o d 的相对变化 3 7 基于几个酶的作用相近，都是具有清除氧自由基的作用，所以把三个酶进 行综合的考虑，几何叠加结果对比，9 0 品种的酶活都在下降，在深度胁 迫下酶活下降程度比中度胁迫下大( 图7 ) 。对比0 z 的结果，发现相关性 很好，o ：。变化中，u 3 、r 2 、r 5 是产生速度较快，在s o d 酶活变化中，u 3 、 r 2 、r 5 也是较大，与此相反的是，在u 2 、u 4 、r 4 、r 6 的o z 的产生速度慢， 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究复旦大学硕士毕业论文 它们在酶活的表现中也是较低。这表明，酶活较大程度上是受如+ 或者是活 性氧直接或间接支配的。 c o m b ( e n ) p e g j u u u u 2 5 0 0 0 入 2 0 0 0 0 。a ，厉声弋、么q 一l l 5 。 o 影u l o 2 篡： 一 日 n n ou u u u u lu 2 u 3u 4 r 】r 2r 3r 4r 5r 6 4 蛋白质的变化 图7p e g 渗透胁迫下综合酶活 p r o t e i n ( p e g ) 薹 队 鼍k ，j n 吣矿_ 一1 朦蚕 盯 v 入、 - - - ( 3 - - 2 挑 【u o 0 0 0 )u li 2u 3u 4r 1r 2r 3r 4r 5r 6r 7 图8 渗透胁迫下蛋白质的相对变化 4 1 在1 5 p e g 渗透胁迫下，8 0 品种的蛋白质在下降，都比对照低；3 0 p e g 渗透胁迫下，9 0 品种的蛋白质低于对照。 4 2 在两种渗透压力下，随着渗透胁迫的加强，8 0 品种的蛋白质在下降( 图8 ) 。 4 3 对比蛋白和综合酶活，发现酶活高的，蛋白较低，如r 3 、r 5 ：酶活低的，蛋 白较高，如u 2 、u 4 、r 6 、r 7 ；随着胁迫程度的加大，两者普遍都在下降。这 同以往的研究结果一致，一般认为，在逆境条件下，蛋白表达下降，却有 逆境蛋白表达增加的现象( 李妮亚1 9 9 8 ，黄上志1 9 9 9 ) 。 5 脯氨酸、可溶性糖的积累 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 s s ( p e g ) ou u u u 70 0 0 0 h 60 0 0 0 ， 5 0 0 0 0 f k 40 0 0 0 一 勺o - 2 3 0 0 0 0 q 基月入 20 0 0 0 。- - d j 1 0 0 0 0 、 斛、v 7 uu u u u l u iu 2u 3u 4r 1r 2r 3r 4r 5r 6r 7 表9 渗透胁迫下野生大豆脯氨酸与可溶性糖的相对变化 5 1 在1 5 p e g 渗透胁迫下，8 0 品种的脯氨酸高于对照，5 0 品种的可溶性糖高 于对照。在3 0 p e g 渗透胁迫下，9 9 品种的脯氨酸在积累，8 0 品种的可溶 性糖高于对照。在中度胁迫下可能脯氨酸先于可溶性糖的积累。 5 2 在两种胁迫梯度下，随着渗透胁迫程度加大，7 0 品种的脯氨酸，9 9 品种 的可溶性糖在积累。推测脯氨酸在深度胁迫下先于可溶性糖停止积累。如 u 3 和r 7 ，脯氨酸在深度胁迫下低于中度胁迫，可溶性糖却相反。 j 3r 6 的脯氨酸最低，为对照的t 2 ，r 6 的可溶性糖却是相当高，为对照的2 4 倍。在脯氨酸较低的情形下，可溶性糖的积累就特别突出对于u 2 ，在深度胁 迫下，脯氨酸含量较高，而可溶性糖含量就较低( 图9 ) 。 j 4u 3 、r 2 是可溶性糖和脯氨酸的含量都是积累较多的品种。可能由于它们都 是进入较晚的生育期，所以，在物质的积累上很明显。这是一种生育期较 晚的表现。因为，物质的合成转化在叶片上是最活跃的，叶片上合成的物 质再往下运输。在比较老的组织中，组织中水分比较少，在运输上可能速 一年生野大豆抗旱耐盐的若干生理指标的研究 复旦大学硕士毕业论文 2 l 度比较慢，造成了进入较晚生育期的品种有较多的渗透物质积累。 5 6 脯氨酸和可溶性糖都具有渗透调节能力，而且有相互补充的趋势，进行几何 叠加，结果发现渗透物质积累更加明显，为对照的1 - 1 0 倍。( 图1 0 ) 图1 0渗透胁迫f 综合渗透调节物质 6 聚类结果分析 对比在中度胁追和深度胁迫条件下，各个聚类分析结果有一定的差 异，在深度胁