（食品科学专业论文）去氢甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型载体的开发.pdf

学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密 学位论文作者签名：；余照 加1 年月l v 日 指导教师签名： 杰弓 一1 一 幻、1 年6 月f 嵋 去氢甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型 载体的开发 p r e p a r a t i o no fi m m u n o a f f i n i t yc o l u m n w i t ha n t i b o d i e s a g a i n s tl - d e h y d r o - 1 7 a - m e t h y l t e s t o s t e r o n ea n da t r i a l d e v e l o p m e n t o fn o v e lc h r o m a t o g r a p h i cs u p p o r tm a t r i x 指导老师王云 姓 2 0 1 1 年6 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 去氢甲睾酮( 1 d e h y d r o 1 7 a m c t h y l t e s t o s t c r o n c ，d m t ) 是一种人工合 成的外源蛋白同化激素，能显著促进动物肌肉生长，但其在人体内积累 会给人体健康造成影响。 目前d m t 残留检测主要采用仪器分析的方法，但由于实际样品中残 留物浓度低、组分复杂等因素，在进行仪器分析时常需要对样品进行净 化处理。与其他样品前处理技术相比，免疫亲合色谱( t a c ) 有着特异性 强、操作简便、重复性好等优点，因而被广泛应用于食品中兽药、农药 残留检测。本研究通过将d m t 抗体与琼脂糖或壳聚糖载体偶联制备得到 了三种d m t 免疫亲和柱，并对其性能及样品净化处理中可能的应用前景 进行了评价。主要结果如下： 1 免疫得到的d m t 抗血清用h i t r a pp r o t e i na s c p h a r o s e4 b 亲和层 析柱进行纯化，得到的d m t 多克隆抗体与c n b r - s e p h a r o s e4 b 凝胶进行 偶联，制各得到d m t 多抗免疫亲和柱。柱子性能的评价方法采用间接竞 争e l i s a ( i c e l i s a ) 法和h p l c 法。抗体与凝胶偶联的最佳时间为2 5h ， 抗体最佳初始浓度为0 5m g m l ；该免疫亲和柱的柱容量约为1 7 0n g d m t 0 1g 干胶；最适洗脱条件为5m l8 0 的甲醇水溶液，柱子平均回 收率为9 7 8 7 ，柱子之间的变异系数为6 6 7 ；柱子重复使用3 次，回 收率仍不低于9 0 ，且和丙酸睾酮( 耶) 、群勃龙( t b ) 没有交叉反应， 特异性良好；在实际样品的检测中，空白猪肉和饲料样品中都分别加标 1 2n g g 、4 8n g g ，回收率为7 4 8 7 - 1 0 7 1 5 ，c v 小于9 7 8 ； 2 杂交瘤细胞注入b a i b c 小鼠腹腔，制备出腹水型单抗，用正辛 酸饱和硫酸铵法纯化得到d m t 单克隆抗体，将其与c n b r - s e p h a r o s e4 b 偶联得到免疫亲和柱。抗体与凝胶偶联的最佳时间3 0h ，抗体最佳初始 去氢甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型载体的开发 浓度为o 1 5m g m l ；该免疫亲和柱的柱容量约为2 4 0 0n gd m t 0 1g 干胶； 最适洗脱条件为5m l7 0 的甲醇水溶液，柱子平均回收率为8 8 5 5 ， 柱子之间的变异系数为8 4 5 ；该亲和柱能重复使用3 次，且特异性良 好；在实际样品的检测中，空白猪肉和饲料样品中都分别加标1 2n g g 、 4 8n g g ，回收率为7 1 1 1 - - 1 0 0 7 5 ，c v 小于8 8 3 ； 3 采用反相悬浮交联法制备了交联壳聚糖，将d m t 单克隆抗体与 之偶联制备成免疫亲和吸附剂，填充入柱即得到免疫亲和柱。用红外光 谱对各阶段的反应物进行结构表征，证明壳聚糖己交联且抗体已成功偶 联。抗体与交联壳聚糖最佳的偶联条件为p h8 o 、时间8h 、温度4 0 、 戊二醛终浓度o 6 ；该亲和柱最适洗脱条件为3m l 9 0 的甲醇水溶液， 柱容量约为1 8 0 0n gd m t 0 1g 交联壳聚糖，柱子平均回收率为9 2 2 5 ， 柱子之间的变异系数为7 9 5 ；重复使用次数为2 次；该柱有非特异性 吸附，与丙酸睾酮( t p ) 、群勃龙( t b ) 的交叉反应率分别为2 4 9 0 和 2 8 0 4 ，还需对其结构和交联过程进行修饰和完善；在实际样品的检测 中，空白猪肉和饲料样品中都分别加标1 2n g g 、4 8n g g ，回收率为5 4 4 9 - - 9 0 0 4 ，c v 小于1 3 2 3 。 关键词：免疫亲和柱，去氢甲睾酮，壳聚糖，多克隆抗体，单克隆抗体， 酶联免疫分析，高效液相色谱 江苏大学硕士学位论文 a b s l 陌a c t i - d e h y d r o 一1 7 a m e t h y l t e s t o s t e r o n ef o r r ) i s a ne x o g e n o u sa n a b o l i ca n d r o g e n i c s t e r o i d d u et oi t sp o s i t i v ee f f e c to nm u s c l eg r o w t h ，d m th a sb e e nw i d e l yu s e db y v e t e r i n a r i a n so nl i v e s t o c kt oi n c r e a s et h e i ra p p e t i t ea n db o d yw e i g h t h o w e v e r , t h e a d m i n i s c a t i o no fd m ti so f t e na s s o c i a t e dw i t hs e v e r a la d v e r s ee f f e c t so na n i m a l sa n dt h e p e r s o n sw h oh a v et a k e nt h e ma sf o o d f o rs c r e e n i n ga n dc o n f i r m a t i o no fd m t , i n s t r u m e n t a la n a l y s i sm e t h o d sh a v eb e e n r e p o r t e di nt h el i t e r a t u r e d u et ot h el o wl e v e lo f t h et a r g e ta n a l y t ea n dt h ec o m p l e x i t yo f t h er e a ls a m p l em a t r i c e s ，p r e t r e a t m e n tm e p sa r ea l w a y sn e c e s s a r yb e f o r ei n s t r u m e n t a l a n a l y s e s h o w e v e r , m o s to ft h e m e t h o d su s e di ns a m p l ep r e t r e a t m e n ta r ef a rf r o m s a t i s f a c t o r yf o ra n a l y t i c a lp u r p o s ei nt e r m so fh i g hs e n s i t i v i t y , r e p r o d u c i b i l i t y , s m a l l a m o u n t so fe x t r a c t i o ns o l v e n t sa n dt i m e - s a v i n gf a c t o r s i m m u n o a f f m i t yc h r o m a t o g r a p h y o a c ) i sas e p a r a t i o nm e t h o dt h a tt a k e st h ea d v a n t a g eo ft h es p e c i f i ca n dr e v e r s i b l e i n t e r a c t i o nb e t w e e na n t i b o d ya n da n t i g e na n dh a sb e e nc o n s i d e r e do n eo ft h em o s t p o w e r f u lt e c h n i q u e sf o rs i n g l e - s t e pp u r i f i c a t i o na n dc o n c e n t r a t i o no ft a r g e ta n a l y t ef r o m c o m p l e xm a t r i c e s n ea p p l i c a t i o no fi a c f o ra v a r i e t yo fs a m p l e sp r e t r e a t m e n th a v eb e e n r e p o r t e d i nt h i sw o r k , n o v e li m m u n o a f f i n i t yc o l u m n sw e r ep r e p a r e db yc o u p l i n g c n b r - s e p h a r o s eo rc r o s s l i n k e dc h i t o s a nw i t ha n t i d m ta n t i b o d i e sa n dt h e i rp o t e n t i a l a p p l i c a t i o ni ns a m p l e sc l e a n u pf o rd m t r e s i d u e sd e t e c t i o nw a se v a l u a t e d t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 1 1 l ed m ta n t i s e r u mw a sp u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo nh i t r a pp r o t e i n a - s e p h a r o s e4 bc o l u m na n dt h e nc o u p l e dw i t hc n b r - s e p h a r o s e4 b f o rc o u p l i n gr e a c t i o n ， t h eo p t i m a lc o u p l i n gt i m ew a s2 5l l t h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fa n t i b o d yw a s0 5m g m l ，1 1 l eo p t i m a le l u t i n gs o l u t i o nw a s5m lo f8 0 m e t h a n o l - w a t e rs o l u t i o n n l ec o l u m n c a p a c i t yw a sa b o u t1 7 0n gd m r 0 1gd r yg e l 皿ea v e r a g er e c o v e r yo f2 0 ，加a n d6 0 n g m ld m t s t a n d a r ds o l u t i o n sf r o mi a cc o l u m n sw a s9 7 8 7 w i t ht h ec o e f f i c i e n to f v a r i a t i o n ( c v ) a m o n gc o l u m n so f6 6 7 a f t e r3t i m e so fr e p e a t e du s e ，t h er e c o v e r ya n d c o l u m nc a p a c i t ys t i l lr e m a i n e d9 2 5 5 a n d7 6 o l r e s p e c t i v e l y n ei a cc o l u m nw a s v e r ys p e c i f i ct od m t 耐t l ln e g l i g i b l ec r o s s - r e a c t i v i 锣t ot e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t eo d a n d t r e n b o l o n ef m ) ，1 1 1 cr e c o v e r yr a t e so fd m tf r o ma n i m a lt i s s u e ，f e e dw e r e f r o m7 4 8 7 t o1 0 7 1 5 、耐t ht h ec vl e s st h a n9 7 8 去氢甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型载体的开发 2 m o n o c l o n ea n t i b o d y ( m c a b ) w a sg e n e r a t e db yh y b r i d o m at e c h n i q u e sa n dp u r i f i e d b yc a p r y l i ca c i d - s a t u r a t e da m m o n i u m s u l f a t ep r e c i p i t a t i o n t h ei a cc o l u m nw a sp r e p a r e d b yc o u p l i n gm c a bw i t l lc n b r - s e p h a r o s e4 b t h ec o u p l i n gt i m eo f3 0ha n di n i t i a l c o n c e n t r a t i o no f0 1 5m g m l t h ec o l u m nc a p a c i t yr e a c h e d2 4 0 0n gd m t 0 1gd r yg e l t h ee f f i c i e n c yo fe l u t i o nw a sb e s tu s i n g5m l7 0 m e t h a n o l - w a t e rs o l u t i o n t h ea v e r a g e r e c o v e r yw a s8 8 5 5 w i t l lt h ec va m o n gc o l u m n so f8 4 5 a f t e r3t i m e so fr e p e a t e d u s e ，t h er e c o v e r ya n dc o l u m nc a p a c i t ys t i l lr e m a i n e d8 1 0 5 a n d9 3 3 7 r e s p e c t i v e l y t h ei a cc o l u m ns h o w e dh i 曲s p e c i f i ct od m tw i n ln e g l i g i b l ec r o s s - r e a c t i v i t yt ob o t ht p a n dt b t h er e c o v e r yr a t e si na n i m a lt i s s u e ，f e e dw e r ef r o m7 1 1 1 t o1 0 0 7 5 w i t l lt h e c v l e s s t h a n 8 8 3 3 an o v e lc h i t o s a n s u p p o r t e di a cc o l u m nw a sd e v e l o p e db yc o u p l i n gm c a b 谢m e p i c h l o r o h y d r i n b yc r o s s l i n k e dc h i t o s a n t h ef o u r i e rt r a n s f o r mi rs p e c t r o s c o p yw a su s e d t oc h a r a c t e r i z et h ea n t i b o d i e sc o u p l i n g t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rc o u p l i n gm c a bw i t h c r o s s - l i n k i n gc h i t o s a nw e r ef o u n da sf o l l o w s ：p ho f8 0 ，r e a c t i o nt i m eo f8h ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r eo f4 0 a n dg l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no f0 6 t h ec o l u m nc a p a c i t yw a s a b o u t1 8 0 0n gd m t p e r0 1gc r o s s l i n k i n gc h i t o s a n t h ee f f i c i e n c yo fe l u t i o nw a sb e s t u s i n g3m l9 0 m e t h a n o l - w a t e rs o l u t i o n t h ea v e r a g er e c o v e r yo f2 0 ，1 0 0a n d2 0 0 n g m ld m ts t a n d a r ds o l u t i o n sf r o mi a cc o l u m n sw a s9 2 2 5 w i mt h ec va m o n g c o l u m n so f7 9 5 a l t h o u g ht h ep r e p a r e di a cc o l u m ns h o w e dh i 曲s p e c i f i ct od m t , a m o d e r a t ec r o s s r e a c t i v i t i e sw e r eo b s e r v e db e t w e e ni a cc o l u m n sw i t ht p ( 2 4 9 0 ) a n d i a cc o l u m n sw i t ht b ( 2 8 0 4 ) a f t e r2t i m e so fr e p e a t e du s e ，t h er e c o v e r ya n dc o l u m n c a p a c i t yw e r e8 0 4 5 a n d8 4 6 1 r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r yr a t e si na n i m a lt i s s u e ，f c e d w e r ef r o m5 4 4 9 t 09 0 0 4 ，a n dt h ec vw a sl e s st h a n1 3 2 3 k e yw o r d s ：i m m u n o a f f m i t yc o l u m n , 1 - d e h y d r o - 1 7 a - m e t h y l t e s t o s t e r o n e ，c h i t o s a n ， p o l y c l o n a la n t i b o d y , m o n o c l o n a la n t i b o d y , e l i s a , i - i p l c i v 江苏大学硕士学位论文 目录 第章绪论。一。一。1 1 1 兽药残留现状及去氢甲睾酮概述1 1 2d m t 的检测方法及其国内外研究进展2 1 - 3 免疫亲和层析2 1 3 1 原理2 1 3 2 产生背景及应用现状3 1 3 3 特点4 1 3 4 载体的选择5 1 4 壳聚糖6 1 4 1 壳聚糖的结构性质6 1 4 2 壳聚糖的生理功能6 1 4 3 壳聚糖的应用7 1 5 立题的依据与意义9 1 6 论文的主要研究内容9 第二章d m t 多克隆抗体认c 柱的研制一。一一。一。一1 0 2 1 引言1 0 2 2 试剂与仪器1 0 2 2 1 式剂1 0 2 2 2 溶液的配制1 0 2 2 3 主要仪器设备1 1 2 2 4 试验动物。1 2 2 3 试验方法1 2 2 3 1 抗血清的纯化1 2 2 3 2 纯化后多抗的蛋白含量测定。1 2 2 3 3 纯化后多抗的效价和抗体工作浓度的确定1 2 2 3 4 纯化后多抗的纯度测定。1 3 2 3 5d m t 多抗l c 柱的制各1 3 2 3 6d m t 多抗i a c 柱评价方法的建立1 4 2 3 7d m t 多抗i a c 柱制备、使用条件的优化1 4 2 3 8d m t 多抗i a c 柱的性能评价1 6 2 3 9d m t 多抗i a c 柱的实际应用1 7 2 4 结果与分析1 8 2 4 1 纯化后多抗的蛋白含量。1 8 2 4 2 纯化后多抗的效价和抗体工作浓度1 8 2 4 3 纯化后多抗的纯度。1 9 2 4 4i c e l i s a 法的建立。1 9 2 4 5i c e l i s a 标准曲线。2 0 v 去氢甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型载体的开发 2 4 6h p l c 标准曲线2 0 2 4 7 最佳多抗浓度和偶联时间2 1 2 4 8 最佳偶联p h 2 2 2 4 9 最佳偶联温度。2 2 2 4 1 0 最适抗体偶联量2 3 2 4 1 1 最大偶联量及偶联物的红外光谱扫描2 3 2 4 1 2 最佳上样溶液种类2 4 2 4 1 3 最佳洗脱液种类2 5 2 4 1 4 最佳洗脱液体积2 6 2 4 1 5i a c 柱的柱容量2 6 2 4 1 6i a c 柱之间的重复性2 6 2 4 1 7i a c 柱的重复使用性2 7 2 4 1 8i a c 柱的特异性2 8 2 4 1 9i a c 柱选择性提取实际样品中的d m t 2 8 2 5 本章小结。2 9 第三章d m t 单克隆抗体i a c 柱的研制一。一一。一3 0 3 1 弓l 言：；0 3 2 试剂与仪器3 0 3 2 1 主要试剂3 0 3 2 2 溶液的配制3 0 3 2 3 主要仪器设备3 1 3 2 4 试验动物。3 1 3 3 试验方法3 1 3 3 1 腹水型d m t 单抗的制备。3 1 3 3 2 腹水型d m t 单抗的纯化3 1 3 3 3 纯化后单抗的蛋白含量测定。3 2 3 3 4 纯化后单抗的效价和抗体工作浓度的确定3 2 3 3 5 纯化后单抗的纯度测定3 2 3 3 6d m t 单抗i a c 柱的制备3 2 3 3 7d m t 单抗i a c 柱评价方法的建立3 2 3 3 8d m t 单抗i a c 柱的制备、使用条件优化。3 2 3 3 9d m t 单抗i a c 柱的性能评价3 3 3 3 1 0d m t 单抗i a c 柱的实际应用。3 3 3 4 结果与分析3 3 3 4 1 纯化后单抗的蛋白含量。3 3 3 4 2 纯化后单抗的效价和抗体工作浓度3 3 3 4 3 纯化后单抗的纯度3 3 3 4 4i c e l i s a 法的建立3 4 3 4 5i c e l i s a 标准曲线3 4 3 4 6h p l c 标准曲线3 5 3 4 7 最佳单抗浓度和偶联时间3 5 v i 江苏大学硕士学位论文 3 4 8 最适抗体偶联量3 6 3 4 9 最大偶联量及偶联物的红外光谱扫描3 6 3 4 1 0 最佳洗脱液种类3 8 3 4 1 1 最佳洗脱液体积3 8 3 4 1 2i a c 柱的柱容量。3 9 3 4 1 3i a c 柱之间的重复性3 9 3 4 1 4i a c 柱的重复使用性4 0 3 4 1 5i a c 柱的特异性4 0 3 4 1 6i a c 柱选择性提取实际样品中的d m t 4 1 3 5 本章小结4 1 第四章以壳聚糖为载体的d m t 单抗i a c 柱的研制一。一。一4 3 4 1 弓i 言4 ：； 4 2 试剂与仪器4 3 4 2 1 主要试剂4 3 4 2 2 主要仪器设备。4 3 4 2 3 溶液的配制4 3 4 3 试验方法4 4 4 3 1 壳聚糖的交联4 4 4 3 2 交联壳聚糖的电镜分析4 4 4 3 3 免疫亲和吸附剂的制备4 5 4 3 4 红外扫描鉴定4 6 4 3 5 壳聚糖为载体的i a c 柱的使用条件优化4 6 4 3 6 壳聚糖为载体的i a c 柱的性能评价4 6 4 3 7 以壳聚糖为载体的d m t 单抗i a c 柱的实际应用4 7 4 4 结果与分析4 7 4 4 1 交联壳聚糖的电镜分析4 7 4 4 2 偶联p h 的选择4 7 4 4 3 偶联时间的选择4 8 4 4 4 偶联温度的选择4 8 4 4 5 戊二醛浓度的选择4 9 4 4 6d m t 单抗的最大偶联量4 9 4 4 7 红外扫描鉴定5 0 4 4 8 最佳洗脱液种类5 1 4 4 9 最佳洗脱液体积5 1 4 4 1 0i a c 柱的柱容量5 2 4 4 1 1i a c 柱之间的重复性5 2 4 4 1 2i a c 柱的重复使用性5 3 4 4 1 3i a c 柱的特异性。5 3 4 4 1 4i a c 柱选择性提取实际样品中的d m t 。5 4 4 5 本章小结5 4 第五章主要结论与展望。一一。一一。一。一。一一5 5 v 甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型载体的开发 v 5 6 5 7 5 8 5 9 论文。；l ， 一一兰茎垄堂塑主堂堡垒查 一 缩略词 b s ab 0 v ms e r u m a l b u m i n 牛血清白蛋白 c t s c h i t o s 觚 壳聚糖 c n b r - s e p h a r o 4 b c n b r - s c p h a r o s c4 b 溴化氰活化的琼脂糖凝胶 d m t 1 - d c h y d r o 1 7 a - m c t h y l t c s t o s t c r o n c 去氢甲睾酮 e l i s ae n z y m c 1 i n k e di m m u n o a s s a y 酶联免疫分析 g c g a sc h r o m a t o g r a p h y 气相色谱 g c m sg a sc h r o m a t o g r a p h i cm a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱串联质谱 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 h r ph o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 i a ci m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 免疫亲和色谱 i c e u s a i n d i r e c t - c o m p e t i t i v ee l i s a 间接竞争酶联免疫 i g o i m m u n o g l o b u l i ng 免疫球蛋白g i r i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y红外光谱 l c m s m s l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mq u a d r u p o l e 液相色谱串联质谱 m a s ss p e c t r o m e t r y o v a0 v 加咖l i n 卵清蛋白 p b s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 磷酸盐缓冲液 t b仃e 咖l o 群勃龙 t p t e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t e 丙酸睾酮酯 i x 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 兽药残留现状及去氢甲睾酮概述 随着人们膳食结构的不断完善，动物源性食品在居民饮食中占很大比例，消费者对 动物食品质量的要求与畜牧产品质量两者之间的矛盾也日益突出。兽药的使用虽然给养 殖业带来了飞速的发展，同时也不可避免地带来了严重的兽药残留问题。兽药用同化激 素尤其是通过人工合成的外源激素，以蛋白质同化作用为主，加快动物体内营养物质的 沉积，降低体脂率，并能增强动物食欲、抑制发情、提高饲料的转化率等【埘。去氢甲睾 酮( 1 一d e h y d r o 1 7 a - m e t h y l t e s t o s t e r o n e ，d m t ) ，又名大力补，美雄酮，是一种人工合成的 甾类雄性蛋白同化激素，具有外源激素的一切特征，其结构式见图1 1 。自2 0 世纪5 0 年 代中期问世以来，作为生长促进剂广泛应用在畜牧养殖生产中以达到大幅提高养殖经济 效益的目的。但是，消费者长期摄人含有此类激素类药物的动物源性食品会导致内分泌 紊乱和性早熟，影响儿童的正常生长发育；对人体肝脏也有一定的损害，可致水、钠、 钾、钙、磷等潴留，引起水肿和血钠过高；同时会增加致癌、致畸的风险 4 , 5 1 。早在1 9 8 8 年1 月1 日欧盟就发出了禁止使用促生长同化激素，我国农业部也在1 9 8 8 年6 月3 0 日 发布的兽药管理条例实施细则中规定“不得添加激素类药品 嘲。并于9 0 年代起禁 止将甾类同化激素用于促生长目的，开始相关的监测工作阴。我国农业部2 0 0 2 年2 3 5 号 公告网中进一步明确规定了包括激素、抗生素、磺胺类等在内的动物性兽药最高残留限 量。 图1 1 d m r 分子结构 f i g1 1s a - u c t u r eo fd m t 去氢甲睾酮抗体免疫亲和柱的研制及新型载体的开发 1 2d m t 的检测方法及其国内外研究进展 目前，d m t 等外源性激素的检测方法主要有h p l c 、g c m s 、l c m s m s 等。其中 h p l c 分析较准确，操作相对来说比较简便，毕红钢等 9 1 用h p l c 确定了人尿中6 种甾 体激素的分离条件及内标定量方法。检测限达到1n g 以下，n g 范围内浓度与峰高比呈现 良好线性关系，r 2 0 9 9 6 。但h p l c 的缺点是有“柱外效应 ，流动相流型对峰宽影响大， 且检测器灵敏度不及g c 。g c m s 是此类激素最常用的分析方法，它集中了毛细管电泳 的高分辨率及质谱的结构鉴定两大优点。杨悦武等1 1 0 l 利用g c m s 法测定了尿中的d m t ， 最低检测限为2 0n g m l ，线性范围在0 0 2 - - 0 3 0o g m l ，样品回收率大于8 5 ，c v 小 于7 。b r e s s o nm 等【1 1 】利用g c m s 对头发中的d m t 进行了检测，检测限在5 0p g m g ， 线性范围在0 5 0 0p g m g 之间( r 2 = 0 9 9 9 7 ) 。g c m s 虽然灵敏度比较高，但样品的净化 处理过程比较复杂，需进行硅烷化等柱前衍生化反应。l c m s m s 是近年来新兴的检测 技术，更适合检测亲水性强、挥发性低的物质，并可以简化样品的前处理。v a np o u c k ec 【1 2 1 等建立l c m s m s 检测康力龙、群勃龙、勃地酮、醋酸氯睾酮等，其最低检测限低于0 1 n g 皿。严慧【1 3 】等用l c m s m s 测定头发中1 0 种蛋白同化激素，检出限为1 2 0n g g ， r s d 为1 7 2 1 3 7 7 ，r 2 为0 9 9 5 8 - - 0 9 9 9 9 。 以上用于检测同化激素的仪器分析方法虽然结果较准确，但由于实际样品组分复杂、 待测物含量较低，因而通常需要对样品进行净化处理。样品前处理的好坏直接决定了检 测分析结果的准确性与可靠性。 1 3 免疫亲和层析 1 3 1 原理 免疫亲和色谱( i m m u n o a f 丘n i t yc h r o m a t o g r a p h y , i a c ) 也叫免疫亲和层析，是以抗原 和抗体之间的特异性以及可逆结合为原理对目标物质进行分离的，它能区分非常相近的 组分，并且只需一步就能从大量的复杂样品溶液中分离出极少量的目标抗原，因此是目 前最具选择性和最有效的纯化方法之一1 1 4 1 。其基本操作原理【1 5 l 如图1 2 ：将纯化抗体与 惰性固体基质偶联制成免疫亲和吸附剂，将该免疫亲和吸附剂进行装柱得到对该抗原具 有特异性吸附的i a c 柱；当含有目标物质的待测物流经柱子时，固定化抗体选择性地结 合目标物质，其他不被识别的干扰物则流出i a c 柱；用合适的洗脱液将抗原抗体复合物 分离，则目标物质被洗脱并得到纯化。在合适的条件下，应用免疫亲和层析法通常只需 2 江苏大学硕士学位论文 一次就可以达到1 0 0 0 1 0 0 0 0 倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体( 比如高纯度的 单抗) ，并且掌握好洗脱条件，也可以达到1 0 0 0 0 倍以上的纯化效果【1 6 1 。 心粼纛 腿烈s a m p l e k毒 匿索嚣田 嘲体基质 x w 嚣蝴峭 辫氨 善l 等 蠢。 | 薮 毒l 滋 竺竺! ! 泓i l l 謦 la 蝴舢删黝壤獗x 砰黝一l 图1 2 免疫亲和层析工作原理 ( 1 ) 待测物过柱；( 2 ) 杂质的淋洗； ( 3 ) 目标物质的洗脱 f i g1 2p r i n c i p l eo