（食品科学与工程专业论文）食源性病原菌生物被膜检测方法的研究.pdf

中闺农业人学顺j 学位论文 摘要 摘要 本文选_ e ；j 常见的食源性病原菌( 沙门氏菌，金黄色葡萄球菌) 为研究对象，采用合适的定量 i l 定性分析方法对1 - 7d 的生物被膜的形成及其结构特点进行了分析：在棉花擦拭法的基础上， 提出了一种新的用于实验室检测生物被膜的方法超声波平板法；最后初步研究了生物被膜的 快速检测方法。 通过测定1 7d 的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生物被膜中的活菌数，发现沙门氏菌与金黄色 葡萄球菌生物被膜中活菌数变化趋势不一致，前者在1 4d 中，活菌数呈上升趋势，从第2d 开始 活菌数才达到1 0 6c f u c m 2 以上，而后者活菌数无显著变化，第1d 活菌数达到1 0 6c f u c m 2 以上。 同时用银染法利扫描电镜法对生物被膜进行了定性分析。 埘棉花擦拭法和超声波平板法测定1 7d 的沙门氏茁和金黄色葡萄球菌生物被膜中的活菌数， 发现超声波平板法测得的活茁数量均高于棉花擦拭法，用s p s s 软件对结果进行分析，发现对沙 氏苗生物被膜，两种方法问相关值y 为0 9 6 6 ，对金黄色葡萄球菌生物被膜，两种方法间相关 值v 为o 9 4 8 。 对1 7d 形成i 。向沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生物被膜均h j 超声波作用2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 ， 1 4m i n ，与棉花擦拭法进行对照，发现沙门氏菌生物被膜，超声波作t 【 j8r a i n 时，与棉花擦拭法 l 刊的相关性非常显著，相关系数v 值为0 9 0 5 。金黄色葡萄球菌生物被膜，超卢波作用l o m i n 时， 与棉花擦拭法间的相关性非常显著，相关系数y 值为0 9 3 。 对荧光素二乙酸酯( f d a ) 法检测生物被膜进行了研究，试验结果表明在4 9 0 n m 处，生物被 膜溶液的吸光值与菌浓度间有较好得相关性，相关系数r 2 为o 9 5 1 1 。 关键词：食源性病原凿，生物被膜，超声波平板法，荧光素二乙酸酯 中国农业人学碗i j 学位论文 摘星 a b s t r a c t f o o d b o r n ep a t h o g e n i cb a c t e r i a ( s a l m o n e l l aa s11 5 5 2a n ds t a p h ) 7 l o c o c c u sa a r e u s a s1 8 9 ) w e r e c h o s e nf o rs t u d yi nt h i sp a p e r t h ef o r m a t i o na n ds t r u c t u r ef e a t u r e so f1 - 7db i o f i l m sw e r ea n a l y z e d q u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l yb yt h ea p p r o p r i a t em e t h o d s b a s e do nt h ep l a t e s w a b b i n gm e t h o d ，an e w m e t h o dt h a tw a su s e dt od e t e c tb i o f i l mi nl a bw a sp r e s e n t e d i tw a su l t r a s o n i c p l a t em e t h o d a tl a s t ，t h e r a p i dm e t h o d sf o rd e t e c t i n gb i o f i l mw e r es t u d i e dp r i m a r i l y a r e rm e a s u r i n gt h ev i a b l ec o u n t so f1 - 7ds a l m o n e l l as pa n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb i o f i l m s ，i t w a sf o u n dt h a tt h eg r o w t hc u r r e n to ft h e i rv i a b l ec o u n l sw e r ed i f f e r e n t t h ev i a b l ec o u n t so ft h ef o r m e r w e r er a i s i n gd u r i n gt h ef i r s tf o u rd a y sa n da m o u n t e dt o1 0 6c f u c m 2o nt h es e c o n dd a y b u tt h ev i a b l e c o u n t so ft h el a t t e rh a d n tr e m a r k a b l ec h a n g ea n da m o u n t e dt o1 0 6c f u c m zo nt h ef i r s td a y a tt h es a m e t i m e ，s i l v e rs t a i n i n ga n ds c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p em e t h o d sw e r eu s e dt oa n a l y z et h eb i o f i l m si n q u a l i t y t h ev i a b l ec o u n t so f1 - 7ds a l m o n e l l as p a n ds t a p h y l o e o c c u sa u r e u sb i o f i l m sw e r em e a s u r e db y t h ep l a t e s w a b b i n gm e t h o da n dt h eu l t r a s o n i c p l a t em e t h o da n dt h en u m b e rd e t e c t e db yt h e u l t r a s o n i c p l a t em e t h o dw a sh i g h e rt h a nt h ep l a t e - s w a b b i n gm e t h o d a f t e ra n a l y z i n gt h er e s u l t sb yt h e s o f t w a r es p s s ，t h ec o r r e l a t i o nv a l u eo ft h et w om e t h o d sw e r e0 9 6 6t os a l m o n e l l as p b i o f i l ma n d 0 9 4 8 t us t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb i o f i l m 2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 ，1 4m i nu l t r a s o n i ct r e a t m e n tt i m ew e r eu s e dt or e m o v e1 - 7ds a l m o n e l l as p a n d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb i o f i l m s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eu l t r a s o n i c - p l a t em e t h o da n dt h e p l a t e - s w a b b i n gm e t h o dh a dag o o dc o r r e l a t i o n t h ec o r r e l a t i o nv a l u ew a s0 9 0 5t ot h es a l m o n e l l a s p b i o f i l mw h e nu l t r a s o n i ct r e a t e d8 r a i na n d0 9 3t os t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb i o f i l mw h e nu l t r a s o n i c t r e a t e d1 0m i n f l u o r e s e e i nd i a c e t a t em e t h o du s i n gt od e t e c tb i o f i l mw a ss t u d i e d e x p e r i m e n t a lt e s t sh a v es h o w na g o o dc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea b s o r b a n c co ft h es o l u t i o na t4 9 0 n ma n db a c t e r i ac o n c e n t r a t i o n sa n dt h e c o r r e l a t i o nv a l u ew a s0 9 5 1 1 k e yw o r d s ：f o o d b o m ep a t h o g e n i cb a c t e r i a ，b i o f i l m ，u l t r a s o n i c p l a t em e t h o d ，f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e m e t h o d 中国农业火学硕士学位论文缩略词 c f u m t t p b s s e m f d a t s b g l x e p s 缩略词 ( a b b r e v i a t i o n ) c o l o n yf o r m a t i o nu n i t t h i a z o y lb l u e t et r a z o l i u mb r o m i d e p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n s c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o c o p y f i u o m s c e i nd i a c e t a t e t r y p c a s es o yb r o t h g l y c o c a l y x e x o p o l y s a e c h a r i d e 菌落形成单位 噻唑兰 磷酸盐缓冲液 扫描电镜 荧光素二乙酸酯 胰酶大豆肉汤 多糖蛋白复合物 胞外多糖 独创性声明 y7 7 4 5 5 1 ； 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在沦文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：畿精 时间： 枷歹年弓月f 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：苓稽 时间：w f - 年月2 f 日 别签名：移吡哆 时间：釉。f 年参月堋 中国农业大学颂士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 国内外食品安全的动态和发展趋势【1 l 随着食品生产规模的扩大和食品贸易国际化，全球不断发生重大食品安全事件，如比利时“二 恶英事件“、英国“疯牛病”、日本大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 食物中毒，以及我国最近暴光的阜阳劣质 奶粉事件等，都使食品安全成为众人关注的焦点，也再次敲响了食品安全问题的警钟。这一切也 清楚地表明，食源性疾病不会随着经济发展和技术水平的提高而减少或消失。无论是在发达国家 还是发展中国家，食品污染和食源性疾病都尚未得到有效的控制，依然严重地危害着人们的健康。 2 0 0 0 年5 月世界卫生大会将食品安全列为w h o 的丁作重点和优先解决的领域，并首次通过 了有关加强食品安全决议。决议重点强调了发展可持续的、综合的食品安全系统以减少整个食物 链的健康危险的必要性。 美国宪法中规定，国家食品安全系统由政府的执法、立法和司法三个部门负责。政府各部门 之间的协调合作，提供了一个全面而有效的食品安全系统。该系统的指导原则是：只有安全和有 益的食品可以上市；以科学为依据制定食品安全法规；政府强制执行；生产商、销售商和进口商 及相关人员应遵守法规，否则将受到惩处。美国食品安全系统依靠强有力的、灵活的、以科学为 依据的国家法律和企业对其生产的食品安全负法律责任，来保证食品安全。1 9 9 7 年美国发布的“总 统关于食品安全的倡议”认为，危险性评估是食品安全管理的重要手段。目前美国已完成了对蛋 及蛋类产品中沙门菌的危险性分析，这是首次进行的从田间到餐桌的定量微生物的危险性评价， 并在法规中规定企业应建立危害性分析关键控制点( h a c c p ) 系统。h a c c p 系统是保障食品从 原料至u 餐桌的安全的一项有效策略，是世界公认韵保证食品安全的最佳方法。应崩h a c c p 系统 可确定极可能发生的危险，制定出有效预防控制危害的计划和措施。 为了进一步确保食品安全，2 0 0 4 年3 月澳大利亚宣布了一项全新的食品改革计划，总投资额 超过2 0 0 0 万澳元。该计划的目标是通过高科技在食品工业中的应用，最大限度地满足人们对食 品在安全、口味、健康、质量等方面的更高要求。加拿大于1 9 9 7 年4 月1 日成立了食品检验局， 承担所有与食品安全性相关的监管责任，从而降低了法律法规重叠交叉，消除了监督体系不一致 性的弊端。 自日本发现了疯牛病后，为了进步加强对食品卫生安全的管理，2 0 0 2 年5 月3 1 日，日本 政府决定成立由科学家和专家组成的独立委员会一“食品安全委员会”，由政府任命担当大臣， 对食品安全性进行评价，同时还提出了全面修订食品卫生法、确保食品安全的“改革宜言”。宣 言强调食晶卫生法的目的要从确保食品卫生改为确保食品安全，必须明确规定国家弄u 地方政府在 食品安全方面应负的责任；所有食品都必须设立安全标准，否则不准食用；农药残留标准适用范 围由以前的3 0 0 多种扩大到所有食品；国家、地方政府和民间法人三位一体，任何一个环节出了 问题都要负法律责任。 中国农业人学硕士学位论文第一章绪论 我国作为一个农业大国，食品在国民经济中占重要位置。多年来，我国政府十分重视食品安 全t 作，建立了一系列的法律法规，采取了多项控制措施，取得了很人进展。2 0 0 1 年将“食品安 全关键技术”列入国家“十五”攻关重大项目，2 0 0 2 年上升为国家1 2 个重人科技项目之一，并 加大了资源投入，促进了食品安全工作的发展。但目前仍存在一些急待解决的不安全因素。迄今， 多数城市和地区尚未推行市场食品准入制度，许多食品未经检验就直接上市。食品加工业还以中 小型企业为主，约2 3 消费者的食品是由这些企业生产的，而这些企业加工设备比较落后，卫生 管理和技术水平较差，难以从整体上实施h a c c p 管理等。总之，我国食品安全检测技术及控制 体系还不够完善、检测和预警体系也处于起步阶段、还没有真正地将危险性分析原则作为决策和 管理的基础、先进的食品安全关键控制技术的使用尚未形成规模，对食品生产新技术进行评价和 控制的技术能力不足、专业人员和经费短缺仍严重制约着食品卫生监管工作的有效开展。因此， 加强研究和科技队伍建设，增加食品安全科技投入是急待解决的问题。 食品安全是一个遍及全球的严重公共卫生问题。尽管科学技术已发展到了相当的水平，但食 品污染和食源性疾病在发达国家和发展中国家仍普遍存在，且发病率持续增高，新的病原体感染 不断出现。食源性疾病的现状警示我们，公共卫生正面临新的挑战。由于不利的环境因素和人口 因素，2 1 世纪初期的食品安全形势可能会变得更加严峻。因此，加速健全和完善相关的法律法规， 建立食源性疾病报告制度和监测系统，加速先进的食品安全控制技术的推j 。应用，加大监管力度， 对食品从业人员和消费者进行食品卫生教育，提高食品卫生意识和责任感，采取综合有效策略减 少食品中的危险因素，控制食源性疾病发生。 生物被膜与食品安全间的关系：据最近召开的“中国食物安全与营养健康论坛”会上的信息， 致病性微生物引起的食源性疾病才是食品安全的最人隐患。而据有关专家估计，其中约6 5 人类 细菌性感染是由生物被膜( b i o f i l m ) g f 起的口】，因此在食品t 业中形成的生物被膜才是引起食源性 疾病的罪魁祸首。h a c c p 是目前众多食品企业为确保产品质量安全而实施的一种体系，它是一 种科学、有效、合理的食品安全管理体系，它从生产一直到消费来确保食品安全。以h a c c p 为 基础的食品安全体系，是以h a c c p 的七个原理为基础的。微生物指标在验证整个体系中起着非 常重要的作用，它能决定h a c c p 体系的有效性。微生物以生物被膜形式存在，在食品加工过程 中长期被忽视了在h a c c p 体系实施过程中对生物被膜进行评估更是罕见，直到最近几年在乳品 和肉制品加上上才出现相关的报道。s h a r m am 和a n a n ds k 等人对灭菌乳生产线上的每个操 作单元进行了生物被膜检测证明了在乳品加工中，一些腐败菌和病原菌能形成生物被膜，从而 导致最终产品的腐败和引起一些疾病的传播【3 】。生物被膜的评估在食品加工企业中应该作为一个 必要生物危害指标，它将对h a c c p 和i s o ：9 0 0 0 认证产生重要影响，也是h a c c p 发展的重要方 向。s h a r m am 和a n a n ds i c 通过研究并推荐在食品加工上每个操作单元和产品每通过一个设 备时都应检测其生物被膜指标的含量。同时指出为了控制生物被膜的存在，应该选用有效的清洁 方案，此外。也应充分考虑加工设备的设计，使它有利于方案实施p j 。 1 1 2 食源性致病菌的危害 1 1 2 1 沙门氏菌的危害”1 2 中国农业大学碗士学位论文第一章绪论 沙门氏茵( s a l m o n e l l a ) r + 泛分布于自然界，是对人类和动物健康有极大危害的一类致病菌。 由它引起的疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。沙门氏菌是引起 人类食物中毒的主要致病菌。据世界卫生组织报道，1 9 8 5 年以来，在世界范围内由沙门氏菌引起 的已确诊的患病人数显著增加，在一些欧洲国家已增加5 倍。在我国内陆地区，由沙门氏菌引起 的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，有7 0 一8 0 是由沙门氏菌引起的， 而在引起沙门氏菌中毒的食品中，约9 0 是肉、蛋、奶等畜产品。肉、蛋、奶等畜产品中含有多 种丰富的营养成分，非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌( 1 0 5 1 0 6 个g ) 的萏产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。由此可见，沙 、j 氏 菌的污染已对食品安全构成了严重威胁。 1 1 2 2 金黄色葡萄球菌的危害瑚 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因 而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染 占第一二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄 球菌肠毒索引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的3 3 ，加拿大则更多，占4 5 ，我国每年发 生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点； 季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油 煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率8 3 ，所以人畜 化脓性感染部位常成为污染源。一般来说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品： 食品加人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工 过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶 牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。 肠毒素形成条件： 存放温度：在3 7 内，温度越高产毒时间越短； 存放地点：通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类：含蛋白质丰富，水分多，同时对含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 医学领域和食品工业领域对生物被膜的研究概况 人类第一次借助显微镜观察的是人牙菌斑生物被膜。但多年来经典细菌学主要是研究浮游生 长的细菌，而忽视了对生物被膜的研究。随着对细菌致病机制的深入了解，发现生物被膜对抗生 素和宿主免疫防御机制的抗性很强，跌而导致严重的临床问题，尤其是慢性和难治的感染性疾病， 因此，开始重视对生物被膜的研究。2 0 世纪3 0 年代中期g i b b o n s 和v a nh o u t e 等对牙菌斑生物 被膜和龋病的关系做了大量研究，为深入了解生物被膜在健康和疾病中的作用奠定了基础 6 1 。现 在已知，细菌可在人体组织如牙齿、牙龈、皮肤、肺、尿道及其他器官的表面形成生物被膜，引 起诸如牙周病、龋齿、慢性支气管炎、败血病、血栓性静脉炎、难治性肺部感染和心内膜炎等疾 3 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 病。在血液、组织液和淋巴液等体液中一般不形成生物被膜。但由于这些体液含有适合细菌生长 的有机营养成分，因此，当体液中含有细菌时，这些细菌可在人体内人工医疗装置( 如隐型眼镜、 人工关节和心脏人工瓣膜) 等无生命物体的表面形成生物被膜。 由于生物披膜的存在，常常造成疾病的迁延不愈和急性发作，给临床带来很大的困难。生物 被膜是引起临床常见感染的病原体( 见表i - i ) 。生物被膜易于固着在异物和坏死组织表面，由于 现代技术的发展，植入和介入性操作逐渐增多，医源性生物被膜感染占据了很大的比例。根据生 物被膜的耐药机制，寻求合适的治疗方法杀灭细菌，这始终是国内外学者努力的方向。生物被膜 相关感染疾病的治疗非常棘手，目前主要通过抑制生物被膜的形成和对已形成稳态的生物被膜用 能通过生物被膜的杀菌剂两方面来进行防治。 临床可考虑可能抑制生物被膜耐药的因素，结合传统的抗菌素联合治疗。如b 内酰胺类抗菌 素联合应用b 内酰胺酶抑制剂或多药外流泵抑制剂，内置导管的患者感染迁延不愈应考虑生物被 膜感染，使用利富平联合米诺环素治疗特别有效：大环i 酯类药物罗红霉素通过抑制铜绿假单胞 菌多糖蛋白复合物合成，从而增强氟罗沙星对生物被膜的渗透，对氟罗沙星杀灭生物被膜中的铜 绿假单胞菌有增效作用；此外，电磁场和超声波辅助治疗可起到更好的疗效。 表卜1 由生物被膜引起的感染 t a b l e1 - 1i n f e c t i o nb yb i o f i l mc e l l s 体内细菌感染 龋齿 中耳炎 肌肉骨骼感染 胆道感染 骨髓炎 细菌性前列腺炎 先天性瓣膜性心内膜炎 囊性纤维化肺炎 成酸性o + 球菌( 如链球菌) 不典型流感嗜血杆菌 g + 球菌( 如葡萄球菌) 肠道菌群( 如大肠感觉) 各种细菌感染，常为混合性 大肠杆菌和g 草绿色链球菌 铜绿假单胞菌 医源性感染 i c u 肺炎 开颅后感染 动静脉瘘 接触式镜片 导屎管性膀胱炎 腹膜透析性腹膜炎 支气管内套管 机械性心脏瓣膜 矫形器械表 中央静脉导管 o + 细菌 表皮葡萄球菌和金黄色葡萄 表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌g 球菌 大肠杆菌和其他细菌 各种细菌和真菌 各种细菌和真菌 表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌 皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 4 中国农业丈学须士学位论文 第一章绪论 国内对生物被膜的研究主要是在医学领域，曾有对大环内酯药物、藻酸盐裂解酶、克拉霉素 等对铜绿假单胞菌生物被膜的影响以及与慢性疾病之间关系的研究。然而在食品： 业中关于生物 被膜的研究仍未见报道。 在食品j 业中，生物被膜的研究主要集中在国外，国内报道极少。近十多年来出现报道较多， 主要集中在乳及乳制品、肉制品等工业上。生物被膜不仅能引起食品腐败，还能腐蚀加t 设备。 食品加工环境中大部分食源性病原菌和腐败菌能在不同材料( 不锈钢、塑料、玻璃、混凝土等) 的接触表面上形成生物被膜。目前研究报道较多的主要有四类菌属：李氏特菌属( l i s t e r i as p p ) ； 假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p p ) ；芽孢杆菌( b a c i l m ss p p ) ；沙门氏菌( s a l m o n e l l as p p ) 。此外， 一些新的病原菌不断出现，如大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ( e s c h e r i c h i ac o l i0 1 5 7 ：h 7 ) 等。单细胞李氏特 菌( l i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s ) 是一种非常顽同的病原菌，在寒冷潮湿的环境中能生长繁殖，易以 生物被膜方式存在。它主要存在禽类屠宰厂及其制品的加t 厂中，如原料传输带上、滚筒中，还 有产品包装膜上。假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p p ) 是食品加工中常见的腐败菌。在水果、蔬菜 加工环境的排水沟和地板、肉制品表面、低酸乳制品中都能形成生物被膜1 7 1 。 除了在食品领域和医学领域中对生物被膜的研究，在很多其他工业领域，生物被膜问题也已 经引起了前所未有的关注，尤其是在废水处理。生物被膜在管道内形成引起流速下降，随着生物 污垢的形成增加，热传导率下降，产品被污染，由丁生物被膜产酸会腐蚀管道。 生物被膜研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科，其真止作为 一个独立学科发展起来始于2 0 世纪7 0 年末。9 0 年代后，随着相关学科的发展及对生物被膜在医 学上重要性的认识生物被膜研究得到迅速发展。1 9 9 0 年，蒙大拿州立大学建立了世界上第一个 生物膜t 程中心。近几年，美国国立生研究所( n i h ) 也为此投入大量研究资金。目前，国内 外越来越多的学者从事生物被膜研究，以期了解生物被膜形成的分子机制、生理生化特点及其调 控机理等，其目的为控制生物被膜的相关感染。 1 2 2 生物授膜的概念及其形成 生物被膜( b i o f i l m ) ，国内也有学者译为细菌生物膜，是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖 基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。除了水和细菌 外，生物被膜还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。 因此，生物披膜中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、d n a 、r n a 、肽聚糖、脂和磷脂 等物质。多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无机物等。广义的生 物被膜还包括真菌、原生动物及多种生物复合形成的生物膜 8 , 9 1 。 生物被膜的概念及形成生物被膜是细菌为适应自然环境、有利于生存而特有的生命现象。任 何细菌条件成熟时都可以形成细菌生物被膜。细菌生物被膜的形成可用一个发育环的形式进行描 述。( 1 ) 游走细菌接受环境中的营养信号，通过鞭毛或其他附着结构识别并牢固地附着于固体表 面。( 2 ) 细菌在附着的固体表面生长、分裂和繁殖，并不断有其他游走细菌继续附着，最终导致 附着位点的细菌生长空间极度拥挤，有毒的代谢产物堆积，细菌得不到充足的营养。( 3 ) 细菌在 竞争压力下启动细胞间信号系统产生细胞间信号，并在信号系统调节下，一边分泌胞外多糖， 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 一边在固体表面轻轻移动，最终形成多细胞蘑菇样和枉状亚单位，多个亚单位形成成熟的细菌生 物被膜。( 4 ) 从细菌生物被膜脱离的游走细菌可以再次粘附生长分裂，分化形成细菌生物被膜， 形成细菌一细菌生物被膜一游走细菌一细菌生物被膜的循环往复f 1 0 1 。 图1 1 生物被膜形成过程示意圈 f i g1 - 1t h es k e t c hm a po fb i o f i l mf o r m a t i o n 生物被膜的存在具有普遍性。在自然界、某些工业生产环境( 如食品工业和废水处理) 以及人 和动物的体内外，绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面，以生物被膜方式存在，而 不是以浮游( p l a n k t o n i c ) 方式存在。生物被膜的形成是细菌为适应自然环境而采取的一种生存策 略，当营养物质缺乏时，微生物易粘附于含有机物质的加工设备表面，形成生物被膜1 1 “。生物被 膜中的细菌无论其形态结构、生理、生化特性还是对抗菌药物的敏感性都与普通浮游生长的细菌 有显著的不同。生物被膜中的细菌被厚厚的多聚糖包绕，不易获得养分和氧气，代谢比较低，细 菌处于休眠状态，不进行频繁的细胞分裂，往往体积较小，对抗生素亦不敏感。 1 2 3 生物被膜检测方法的研究 在食品加工业中，已经有各种各样的方法用于检测和监控粘附在食品接触表面的生物被膜。 传统方法有平板擦拭法( p l a t i n go f s w a b b i n g ) 、接触平板法( c o n t a c tp l a t e s ) 、量计法( d i p s t i c k t e c h n i q u e ) 【1 2 j 。一般来说这些方法比较经济也容易得到应用。在平板擦拭法中，需要利用海绵 等类似物质来擦拭粘附在接触表面的生物被膜。利用这些方法的优点是可以根据需要选择培养 基。一些特殊的细菌，酵母菌和霉菌可以分离和鉴定出来。但他们也存在很大的不足，一是微生 物必须借助外力从接触表面脱落下来，二是劳动强度大耗时多。 在传统检测生物被膜的基础上，一些快速的检测方法得到了发展。a t p 生物体发光法( a t p b i o l u m i n e s c e n c ) et e s t ) 是一种间接、快速生物化学检测方法，它也是将生物被膜从接触表面擦拭 下来，检测总的a t p 的含量。因为总的a t p 含量与食品残留物含量和通过擦拭收集到的生物被 膜的含量是相关的。原理是微生物细胞中和食晶残留物里的a t p 能与虫荧光素一荧光索酶 ( 1 u c i f e r i n - - l u c i f e r a s e ) 反应，放出光，光的强度与a t p 含量成比例。这种方法不足之处是灵敏 度不商，不能检测微生物含量比较低的样品，它要求通过擦拭收集到的细菌含量需高于1 0 ，酵 6 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 母菌需多丁= 1 0 个【l “。在实际应用中，目前还未找到一种能定量检测生物被膜的方法，因为用棉 拭子或海绵擦拭，无法保证生物被膜完全从接触表面脱离。生物被膜转移量只能达到9 0 以上。 但由于a t p 生物体发光法( a t pb i o l u m i n e s c e n c et e s t ) 它检测出来的是食品残留物和微生物a t p 含量，因此它不仅能判断出接触表面微生物生长范围，还可以判断一些卫生清洁剂和清洁程序是 否有效，这些信息对食品加工企业来说也是非常有利的。a t p 生物体发光法( a t pb i o l u m i n e s c e n c e t e s t ) 在实际应用中前景广阔，已逐渐作为食品生产和流通过程中的微生物快速监测和清洁度监 测的一种方法，尤其在h a c c p 中的应用已日益受到重视。 微孔板检测方法( m i c r o t i t e r p l a t es c r e e n i n gt e s t ) 是目前实验室比较广泛应用检测生物被膜 的方法，相对平板计数法来说，它能大幅度缩小研究者的t 作量。生物被膜先在微孔内形成，然 后对它染色，染色通常选用结晶紫( c r y s t a lv i o l e t ) ，因为它能比较准确反映生物被膜的含量，染 色一段时间后用乙醇脱色，风干后，用微孔板读数器( m i e r o t i t e rp l a t er e a d e r ) 测o d 值【1 ”】。这 种方法能较准确反映生物被膜的含最，对实验室生物被膜研究工作是非常有利的。 1 3 研究目的 本课题所进行的研究是国家质量检验检疫总局科研项目生物被膜引起食品生物危害的研 究的一部分。项目编号2 0 0 3 1 k 0 5 2 主要涉及基础的方法论研究。 生物被膜易在食品接触表面和加t 环境、设备中存在，如在厂房的地板和天花板，输送管道 拐弯处，输送带等地方形成。它往往会给企业带来巨大的经济损失，更严重的是影响到食品的安 全性，一臣在食品接触表面或加工环境形成了生物被膜，食品就极有可能被污染，给消费者的健 康带来危害。甚至威胁到生命安全，这种损失是无法估算的。在食品加丁领域，食源性病原茁生 物被膜的形成是潜在的污染源，可能引发食品污染或者食源性疾病的传播。实验证明，即使经过 符合良好操作规范( g o o d m a n u f a c t u r i n g p r a c t i c e s ，g m p ) 的清洗和卫生操作后，微生物仍然能在设 备表面残余【l 。生物被膜中的细菌对各种化学药品( 包括各种消毒剂) 、加热、光照和干燥都存 在耐药性，因此利用适当的清洁剂和消毒剂防止生物被膜形成显得非常重要。除了清洗之外，加 工设备材料也会影响生物被膜的形成。在清洗过程中，病原菌的散播会产生空气悬浮粒，然后附 着在加工设备材料表面，尤其易在一些不易清洗的地方形成生物被膜，如裂纹、拐角处、垫圈、 管道材料连接处等。生物被膜的存在会产生加工后的污染，缩短产品的货价期如果食品中存在 病原菌，食用这些污染的产品就可能会产生极大的安全隐患【17 1 。 生物被膜的研究在方法上不同于浮游菌。首先，菌体细胞在两相的界面上形成，一相是营养 相对丰富的培养基，另一相是无营养的无机表面，必然会形成营养和氧气、代谢废物的空间梯度 分布，相应的菌体细胞会有很大不同。靠近培养基一侧，性质更接近游离细胞，有较好的生存条 件，进行一分为二的分裂繁殖；面在无机表面一侧，营养物质贫乏，代谢废物浓度高，菌体细胞 在恶劣的生存条件下，会主动或被动地降低代谢的强度，甚至转入休眠状态。还有研究表明，在 生物被膜的底层还存在输送营养物质和废物的通道，被膜的生态结构更加复杂。这种不规则的 差异很大的个体分布，对研究方法提出了挑战，怎样在不破坏生物被膜原有形态结构的基础上， 对微观存在的细胞及细胞间的联系进行分析，单靠传统的方法是不合适的。其次，对于生物危害 7 中周农业大学硕 ：学位论文第一章绪论 而言，活细胞是前提条件，可是在生物被膜中至少存在3 种以上状态的细胞：生长分裂旺盛的活 细胞、处于休眠状态的细胞和生存竞争失败的死细胞。衡量危害程度的定量指标是活菌数，而且 在食品加t 过程中，虽具危害性的是休眠细胞，这种细胞对抗生素、杀菌剂、热、低水活度等不 利条件有较强的抗性，当杀菌过程结束后，重新回到富营养的环境中，又会恢复生长和分裂，是 污染食品的罪魁祸首【1 8 j 。将这种细胞暴露出来，形成菌悬液，便于计数，即生物被膜的剥离。剥 离生物被膜行之有效的方法至今没有达成共识。再次，在透光良好的固体表面如玻璃等，可以 使用光学显微镜直接观察生物被膜，以获得直观的观察结果，可是，对于不锈钢、塑料等固体表 面形成的生物被膜，由于透光性不好，又不能切片( 破坏原有的形态结构) ，另外由于生物被膜的 形态，又要求三维空间的观察，所以就必须采取一些如扫描电子显微镜等的方法来观察，成本高， 制样繁琐。伴随而来的未知影响也较多。 在实验室现有条件下，建立并验证一种包括培养、定性和定量分析生物被膜的方法是本课题 的主要目的。方法的准确、低误差和标准化，是实验结果可信的保证，也是进一步分析生物被膜 结构、生理、危害以及杀菌效果等研究方向的基础。良好方法的建立有着重要的意义。 1 4 研究的内容和方法 1 4 1 主要研究内容： 1 ) 采用定性和定量的方法鉴定了1 7d 形成的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生物被膜； 2 ) 在棉花擦拭法的基础上，建立了一套新的用于实验室检测生物被膜的研究方法，即超声波平 板法： 3 )为找到一种快速检测生物被膜的方法，根据本实验室条件及方法的可靠性，主要对荧光素二 乙酸酯法进行了初步的研究。 1 4 2 主要研究方法： 1 )采用传统的营养琼脂平板计数法对生物被膜中的活菌计数； 2 )采用扫描电镜观察了生物被膜的微观形态结构： 3 ) 采用银染法对生物被膜形成和超声波作用不同时间去除生物被膜的情况进行定性分析。 8 2 1 引言 第二章采用定性和定量方法鉴定生物被膜 生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕 其中而形成的大量细菌聚集膜样物。细菌存在方式主要有两种，浮游( p l a n k t o n i c ) 形式和粘附在 一些接触表面上形成生物被膜。近来研究表明，在自然环境和人工生态环境中，生物被膜是微生 物的主要存在方式【1 9 】。 生物被膜的形成是一个动态过程，包括细菌起始粘附、生物被膜形成和成熟三个阶段，生物 被膜细菌在备阶段具有不同的生理生化特性。细菌在接触表面的粘附是细菌形成生物被膜的第一 步。这种粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白( a d h e s i n ) 识别接触表面受体( r e c e p t o r ) 的 结果。因此具有选择性和特异性口。细菌粘附到表面后，即调整其基因表达，在生长繁殖的同时 分泌大量胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) ，e p s 的产生对生物被膜结构的发展十分重要，e p s 可粘结单个细菌而形成细菌团块，即微菌群( m i c r o c o l o n y ) ，大量微菌群使生物被膜加厚，形成 团状。 生物被膜的鉴定方法可以从定性和定量两个方面去考虑，定量主要是通过对生物被膜中的活 菌计数，如实验室采用传统的棉花擦拭法；生物被膜定性鉴定方法有很多种，主要应用扫描电镜 和激光共聚焦显微镜1 2 1 1 ，但无论是扫描电镜还是激光共聚焦价格都比较昂贵，费时，设备价格昂 贵，目前实验室广泛使用的定性方法主要是银染法，先对形成的生物被膜用硝酸盐染色，再崩实 验窒普通的光学显微镜观察，此方法简单，比较可靠。 2 2 实验材料和主要试剂、设备 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 载体：不锈钢片( 3 0 4 ) 1 0 3 0l f f i 玻璃片( 实验室普通型载玻片) 1 0 2 6 2 2 。1 2 菌株：s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ( a s1 8 9 ) ，s a l m o n e l l as p ，( a s1 1 5 5 2 ) ，购白中国科学 院微生物研究所国家菌种保藏中心。 2 2 1 3 培养基：胰酶大豆肉汤( t r y p t o n es o yb r o t h ，简称t s b ) ( 北京奥博星生物技术责任有限 公司) 营养琼脂( 北京奥博星生物技术责任有限公司) 。 2 2 2 试剂： 9 药品厂家 锇酸 硫代硫酸钠 醋酸异戊酯 戊二醛 丙酮 无水乙醇 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 美国f i s h e r 公司 国产，分析纯 国产，分析纯 国产，分析纯 国产，分析纯 胃产，分析纯 国产，分析纯 国产分析纯 2 2 。3 仪器和设备 2 _ 3 实验方法 2 3 1 生物被膜的制备 】) 不锈钢片、玻璃片的清洗，用丙酮浸泡除去表面油腊，然后放在5m 0 1 月盐酸溶液中浸泡 1 5m i n ，用洗涤剂清洗。再用蒸馏水冲洗干净。最后把它们放入1 8a n 1 8 0 试管中，加入1 0 m 10 2 t s b 培养基，高压灭菌；2 ) 蘸悬液制各，将菌种活化后，接种在无菌t s b 溶液的三角瓶 中在3 7 c 培养过夜：3 ) 在试管中加入0 1m l 过夜菌悬液，用摇床连续培养隔天换液。 2 3 2 采用棉花擦拭法和超声波平板法对生物被膜活菌计数 样品处理；取培养1 7d 的生物被膜，用无菌磷酸缓冲溶液( p b s ，p h 7 4 ) 多次冲洗； 棉花擦拭法；将处理完的不锈钢片，放入无菌培养皿中，用无菌棉球擦拭，再将棉球转入装 有1 0m lp b s 溶液的试管中，用漩涡混合器振荡后，梯度稀释，从试管中取1m l 菌悬液，进行平 板计数： 1 0 中国农业大学颈：匕学位论文 第二章采用定性和定量方法鉴定生物被膜的形成 超声波平板法：将冲洗好的不锈钢片或玻璃片转入装有1 0m lp b s 溶液试管中；再把试管放 入超声波中，按不同超声波作用时间( 0 ，2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 ， 1 2 ，1 4m i n ) 振荡。梯度稀释后， 从试管中取1m l 菌悬液，进行平板计数。超声波振荡频率为4 0k h z ，在室温条件下工作。 2 3 3 银染法观察生物被膜观察生物被膜【2 2 , 2 3 在玻璃片上培养1 7d 的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生物被膜。 经灭菌p b s 溶液多次充分漂洗，去掉浮游菌，2 5 戊二醛p b s 溶液中固定1h ，蒸馏水清 洗1r a i n ，饱和c a c l 2 溶液结合1 5r a i n ，蒸馏水清洗1m i n ，5 a g n 0 3 溶液反应1 5m i n ，1 对苯 二酚溶液显色2m i n ，蒸馏水漂洗1m i n ，5 n a 2 s 2 0 3 溶液固定2m i n ，蒸馏水漂洗1m i