（生物物理学专业论文）低能离子诱变选育华根霉高产l乳酸菌株的研究.pdf

摘要 为了满足乳酸尤其是对l 乳酸的大量需求，不断地发掘自然微生物资源中的优 良菌株并对其进行诱变育种工作尤为重要。本研究以一株产l 乳酸的野生型华根霉 ( r h i z o p u sc h i n e n s i s ) 为出发菌，对该菌株适宜产酸的条件进行了研究，然后以1 0 k e v 氮离子对出发菌l 乳酸产率进行诱变，以期获得高产的l 乳酸菌株。同时为了比较 出发菌株和突变菌株在分子水平的差异，利用1 0 8 条r a p d 随机引物对出发菌株和 突变菌株进行了r a p d 比较分析。主要研究结果如下： 1 出发菌华根霉适宜产酸的条件为：葡萄糖9 0 、( n h 4 ) 2 s 0 4 2 0 、k h 2 p 0 40 6 、 m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5 、z n s 0 4 7 h 2 0o 0 5 9 0 、c a c 0 35 0 0 p h 值自然，接种 量在5 左右，3 4 ，2 0 0 r p m 的培养条件下，可获得较高的l 乳酸产量( 2 8 s g l ) 。 2 选用能量1 0 k e v 的n + 离子，注入剂量为0 2 6 1 0 1 5 i o n s c m 2 2 8 6 1 0 1 5 i o n s c m 2 对出发菌进行诱变，存活曲线与文献报道的“马鞍型”曲线基本符合。注入诱发 高产l 乳酸突变的适宜剂量为1 3 0 10 1 5i o n s e r a 2 0 筛选获得的突变株r c h i3l 乳酸含量为3 3 7 9 l ，比出发菌株提高1 7 。经多次传代表明该菌株遗传稳定性 较好。 3 利用1 0 8 条随机引物对出发菌株和突变菌株进行了r a p d 比较分析，8 3 条引物 在两池具有扩增产物，其中3 条引物( s 1 9 3 ，$ 2 7 1 ，$ 3 8 2 ) 在两池间表现多态性， 有多态性扩增的引物频率为2 7 8 ，且多态性稳定，重复性较好。 4 选择其中2 条( s 1 9 3 ，$ 2 7 1 ) 差异性片段进行克隆和测序，用b l a s t 程序在n c b i 上进行比对，发现$ 2 7 1 引物所扩增的序列部分与稻瘟病菌假设蛋白( m a g n a p o r t h e g r i s e a h y p o t h e t i c a l p r o t e i n ) 的序列有8 6 的同源性，与烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s a f 2 9 3 ) d n ar e p l i c a t i o n l i c e n s i n g f a c t o r 具有7 9 的同源性。s 1 9 3 引物所扩增的序 列经比对未发现有相似序列。 关键词：华根霉：l 乳酸；离子注入；r a p d 分析 a b s t r a e t i no r d e rt om e e tm a s s i v ed e m a n d so ft h el a c t i ca c i de s p e c i a l l yl - l a c t i ca c i d ，i ti sv e r y i m p o r t a n tt oc o n t i n u o u s l ye x p l o r et h ef m es t r a i n i nt h en a t u r a lm i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e s a n do p t i m i z ei t i nt h i sp a p e r ，t h el - l a c t i ca c i dp r o d u c i n gc o n d i t i o no f r h i z o p u sc h i n e n s i s w a so p t i m i z e d t h e nt h r o u g h1 0 k e vn + i m p l a n t i n gi n t or h i z o p u sc h i n e n s i st oo b t a i n h i g h - y i e l dm u t a n t s i m u l t a n e o u s l yi no r d e rt oc o m p a r ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h eo r i g i n a l s t r a i na n dt h em u t a i ns t r a i ni nt h em o l e c u l a rl e v e l ，1 0 8p r i m e r sw e r ee x a m i n e dt oc l a r i f y t h eg e n e t i cb a c k g r o u n db yu s i n gr a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) a n a l y s i s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h eo p t i m a lp r o d u c t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n s i s t e do ff o l l o w i n g ：c 6 h 1 2 0 6 9 0 o 、n q h 4 ) 2 s 0 42 o 、k h 2 p 0 4o 6 0 、m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5 o 、z n s 0 4 7 h 2 00 0 5 0 、 c a c 0 35 0 0 o 、5 v o l u m eo fs e e d s ，3 4 ，2 0 0 r p m t h ef i n a lc o n c e n ：t r a t i o no f l - l a c t i ca c i dr e a c h e dt o2 8 ，8 9 l 2 u s e1 0 k e v0 , 2 6 x 1 0 1 5i o n s c m 2 2 8 6 1 0 1 5i o n s c m 2d o s e s n + d e a l i n gw i t h 也e 也e o r i g i n a ls t r a i nr h i z o p u sc h i n e n s i s t h es t r a i ns h o w s s a d d l et y p e d o s es u r i v i a tc u r v e t h cb e s ti o ni m p l a t a t i o nd o s ei s1 3 0 1 0 1 5 i o n s c m 2 a f t e rs e v e r a ls c r e e n s ah i g h - y i e l d m u t a n ts t r a i nr c h 1 3w a so b t a i n e d i t sl a c t i ca c i dw a si n c r e a s e db y1 7 t h a nt h a to f o r i g i n a l t h eg e n e t i co f h i g h y i e l dm u t a n ts t r a i ni ss t a b l e 3 u s i n g1 0 8a m p l i f i e dp r i m e r st oe x a m i n a t et h eg e n e t i cb a c k g r o u n db e t w e e n t h e o r i g i n a ls t r a i na n dt h em u t a i ns t r a i n ，8 3p r i m e r sh a v ea m p l i f i e dp r o d u c t i o n si nt w o p o o l s 3p o l y m o r p h i cp r i m e r sw e r es c r e e n e df r o m 1 0 8p r i m e r sb e t w e e nt h et w o n e a r - i s o g e n i cl i n e s t h ef r e q u e n c yo f p o l y m o r p h i cp r i m e r si s2 7 8 4 2d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e df r a g m e n t sw e r ee x t r a c t e da n ds e q u e n c e d t h er e s u l to f a l i g n m e n ti nn c b is h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo fs 2 7 1p r i m e ra m p l i f i e dh a d8 6 h o m o l o g yw i t l lm a g n a p o r t h eg r i s e ah y p o t h e t i c a lp r o t e i n ，h a d7 9 h o m o l o g yw i t h a s p e r g i l l u s f u m i g a t u sa f 2 9 3d n ar e p l i c a t i o nl i c e n s i n gf a c t o r t h es e q u e n c eo fs 1 9 3 p r i m e ra m p l i f i e dh a dn o th o m o l o g ys e q u e n c e k e yw o r d s ：r h i z o p u sc h i n e n s i s ；l l a c t i ca c i d ；i o ni m p l a n t a t i o n ；m u t a t i o n ；b r e e d i n g ； r a p d ( r a n d o ma m p l i f i c a t i o np o l y m o l p h i cd n a ) ； i i 插图和附表清单 表1 乳酸对映体理化性质的区别 表2p c r 反应体系 图1 发酵液与l 碍l 酸标准品的纸层析 图2 不同碳源对l 一乳酸产量的影响 表3 不同浓度的葡萄糖对华根霉产l 一乳酸的影响 图3 不同氮源对l 碍l 酸产量的影响 表4 不同浓度的硫酸铵对华根霉产l 哥l 酸的影响 表5 不同浓度的碳酸钙对华根霉产l 哥l 酸的影响 图4 接种量对l 哥l 酸产量的影响 图5n + 离子注入华根霉的存活曲线 图6n + 离子注入华根霉的突变率 表6 高产突变株遗传稳定性实验 图7 微量c t a b 法制备的出发株和突变株基因组d n a 表7 随机引物筛选结果统计表 图8 引物$ 1 9 3 在出发株和突变株中扩增的r a p d 图谱 图9 引物$ 2 7 l 在出发株和突变株中扩增的r a p d 图谱 图l o 引物$ 3 8 2 在出发株和突变株中扩增的r a p d 图谱 图1 1 重组子的验证电泳图 v 1 1 5 1 9 2 0 2 0 2 1 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 2 4 2 4 2 5 2 6 ，2 7 2 7 2 8 独创一i 生声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： ! 虱丛二墒 时间：0 6 年6 月谚日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：! 塾尘摘 a , f 司：0 6 年6 月瞎曰 第一导师签名：够 时间： 移詹易窍t 扣 文献综述 1 乳酸的结构和性质 乳酸( l a c t i ca c i d ) 的学名为q 一羟基丙酸( 2 一h y d r o x y p r o p a a o i ca c i d ) ，分子式为 c 2 h 6 0 3 ，分子量9 0 0 8 。乳酸是一种天然存在的有机酸，广泛存在予人体、动物、植 物和微生物中。因为分子中有一个不对称的碳原子，具有旋光性。乳酸具有d 型和 l 型两种构型。l 一乳酸为右旋的，d - 乳酸是左旋的；当l ( + ) 乳酸和d ( 一) 乳酸等比例 混合时，即成为消旋的d l 乳酸。乳酸对映体的理化性质见表1i l l 。 袭1 乳酸对映体理化性质的区别 t a b ie lt h ed i f f e r e n c eo h y s i c a ic h a r a c t e ro fi a c t i ca c i de n a n t l o m e r 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，熔点1 6 8 ，沸点1 2 2 c ( 2 k 2 a ) ，相对密度 1 2 4 9 12 1 ，乳酸与水可以完全互溶，不易结晶析出。6 0 以上浓度的乳酸溶液有很强的 吸湿性。在6 7 1 3 3 p a ( o 5 l m m h g ) 的真空条件下反复分馏，可以得到纯品的乳酸结 晶。 乳酸通常是乳酸( c 3 h 6 0 3 ) 和乳酰乳酸( c 6 h m 0 5 ) 的混和物，为无色透明或浅黄色糖 浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸味。与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙 酮混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯1 2 】。乳酸可分为工业级、食品级和 药典级。工业级乳酸是含量5 0 9 0 的乳酸溶液，具吸湿性，煮沸浓缩时，乳酸缩 合为乳酰乳酸和2 一乳酰羟基丙酸，加热稀释又转化为乳酸。食品级的乳酸含量为8 0 以上，药典级的乳酸含量为8 5 9 0 。 由于乳酸含有个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。如氧化反应、还 原反应、缩合反应和酯化反应等【3 】。l - $ l 酸分子具有自动酯化的能力，乳酸越浓这种 趋势越强。充分脱水能聚合成聚l 乳酸，聚合l 乳酸水解后总酸为1 2 5 ，因此，在 表示乳酸浓度时，往往用游离酸和总酸来表示。 2 l 乳酸的用途 乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，它的用途极其广泛。乳酸及其盐类和衍生 物可用于食品、酿造、香料、医药、皮革、卷烟、化工和印染等工业。其产品主要表 现形式为酸味剂、调味剂、防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解材料和手性药物等 4 - 6 1 。目前国内外生产的乳酸基本上是d l 乳酸，乳酸的应用大部分集中在食品和医药 行业上。由于人体和动物体内只含有l 碍l 酸脱氢酶，因而只能利用自身产生的或摄入 的l 乳酸，l 一乳酸是哺乳动物体内正常代谢产物，在体内分解为氨基酸和二羧酸化合 物，几乎无毒。若过量食用d 一或d l 乳酸，会导致血液中富含d 乳酸，尿中会出现高 酸度( h y p e r a c i d i t y ) 现象，引起代谢紊乱，因此世界卫生组织( w h o ) 限制人体每天摄入 d 哥l 酸量在1 0 0 m g k g 以下，d 一型、d l 型乳酸不应加入到三个月以下婴儿的食品中， 提倡使用l - 乳酸作为食品添加剂和内服药，取代目前使用的d l 乳酸【l j 5 ”。 乳酸，特别是l 哥l 酸，对人、畜无害，而且具有很强的杀菌作用，其杀菌能力几 倍于柠檬酸、酒石酸、琥珀酸，可直接作为手术室、病房、实验室、车间等场所的消 毒剂。l 乳酸、l 乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等物质进行复合，配制成输液，可治疗酸 中毒及高钾血症；l 乳酸铁、l 乳酸钠、l 碍l 酸钙是补充金属元素的良好载体；l 乳 酸钙还可以增强抗氧化性，防止水果和蔬菜的褪色等。在医药中，l 碍l 酸钙可保持骨 骼密度和强度，减少毛细血管的通透性，保持正常的神经肌肉的兴奋性，加强大脑皮 层抑制过程。 l 一乳酸在化学工业可作为清洁剂。l 哥l 酸的乙基乳酸酯( 乳酸乙酯) 作为“绿色溶 剂”可以取代氯化烃溶剂，在电子学、航空和航天以及半导体工业中作为精细金属清 洁剂t 8 1 。l 一乳酸经过聚合可生成直链或环状的聚乳酸，聚乳酸是无毒的高分子化合物， 具有生物相容性，在人体内可被分解成l - 乳酸，被人体代谢，不引起生物变态反应， 在医学中可作为缓释胶囊剂，克服现用药物药效低、瞬时浓度高等弊病；以生物降解 纤维，用于手术缝合线、筋腔、骨骼损伤的修复材料、生物植片、胶囊壁材等：在农 业中，聚乳酸在自然条件下缓慢分解，能制成可降解塑料以代替非降解塑料，用来解 决白色污染问题【6 】。另外2 1 0 个l 一乳酸分子的聚合体是良好的植物生长调节剂f 9 i 。 3 l - 乳酸的生产方法 由于乳酸特别是l 一乳酸在各种领域的应用不断被深入开发，如何获得大批量、低 成本的乳酸已经成为制约和影响乳酸产业发展的关键因素。目前我们已知生产乳酸的 方法有发酵法，化学合成法和酶法。 3 1 化学合成法 由化学合成法生产乳酸可通过多种途径，最常见的是乳腈法。该法是乙醛与氢氰 酸经碱性催化作用生成粗乳腈，这是一个液相反应，在常压下进行。粗乳腈通过蒸馏 回收纯化并用浓盐酸或硫酸水解为粗乳酸和其他氨基酸副产物。粗乳酸的精制是先用 甲醇酯化乳酸得到乳酸甲酯，蒸馏后再进行水解生成乳酸与甲醇，甲醇可再循环利用。 3 2 酶法 日本东京大学的本崎等人 1 0 l 研究了用酶法催化合成乳酸，别从恶臭假单孢菌和假 单孢菌的细胞中提取纯化了l 一2 卤代酸脱卤酶和d 卜2 卤代酸脱卤酶，用于底物 d l 一2 一氯丙酸，得卜乳酸或d 一乳酸。l - 2 一卤代酸脱卤酶催化l 一2 卤代酸脱卤：d l 一2 一 卤代酸脱卤酶既可催化l 一2 一卤代酸脱卤，可催化d - 2 - 卤代酸脱卤，在催化时可发生 构型转变。 3 3 发酵法 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等为原料，接种微生物经发酵而生产乳酸。按 发酵过程中产物生成情况，可以将乳酸发酵分为以下四个类型，它们各自具有不同的 发酵机理。 3 3 i 同型乳酸发酵 微生物通过e m p 代谢途径进行同型乳酸发酵，乳酸是代谢的惟一产物。1 t o o l 葡 萄糖可以生成2 t o o l 乳酸，理论转换率为1 0 0 。但由于发酵过程中微生物有其他生 理活动存在，实际转化率一般在8 0 以上者，即视为同型乳酸发酵，总反应式为： c 6 h 1 2 0 6 + 2 a d p + 2 p i + 2 c h 3 c h c o o h + 2 a t p 3 3 2 异型乳酸发酵 微生物经由b i f i d u s 途径和p k 途径生成等摩尔数的乳酸、c 0 2 和乙醇。葡萄糖的 转化率只有5 0 ，总反应式为： c 6 h 1 2 0 6 + a d p + p i c h 3 c h c o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2 + a t p 3 3 3 双歧发酵 在该途径中，2 m o l 葡萄糖产生3 t o o l 乙酸和2 m o l 乳酸，乳酸的转化率为5 0 。 总反应式为： 2 c 6 h 1 2 0 6 + 2 c h 3 c h c o o h + 3 c h 3 c o o h 3 3 ，4 混合酸发酵 同型乳酸发酵在特殊情况下，如葡萄糖浓度受到限制、p h 升高或温度降低而发生 的一种乳酸发酵机制，葡萄糖经e m p 途径生成丙酮酸，但丙酮酸的代谢途径发生了 改变，除生成乳酸外，还生成了甲酸等副产物。 传统意义上的乳酸发酵类型是针对乳酸细菌而言的，是在厌氧或兼性厌氧条件下 合成乳酸的。雨根霉作为好氧菌，其乳酸发酵具有独特的代谢途径。它是经e m p 途 径生成两酮酸，然后一部分丙酮酸进入t c a 循环，而另一部分丙酮酸在乳酸脱氢酶、 丙酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分别生成乳酸、乙醇、苹果酸和富马酸。依据 形成产物情况，该发酵也属于混合酸发酵类型。 3 4 乳酸生产方法的比较 化学合成法的缺点是产品为外消旋乳酸，即d l 乳酸。另外，由于合成法所用原 料是乙醛和剧毒物氢氰酸，生产成本较高。酶法生产乳酸虽然可以得到单一旋光性的 乳酸，但工艺比较复杂，其在工业上的应用还有待于进一步研究。微生物发酵法生产 乳酸，可通过菌种选育或代谢调控而获得具有立体单的d ，乳酸和l 乳酸，或两种 异构体以一定比例混合的消旋体，以满足生产乳酸的需要。微生物发酵法生产乳酸因 其原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高和安全性好等优点而成为生产乳酸的 重要方法。 4 。国内外发酵法生产l 一乳酸的研究现状 自然界中可发酵生产乳酸的微生物很多，但产酸能力强、可应用到工业上的主要 有霉菌中的根霉属及细菌中的乳酸菌类等【l ”。 4 1 细菌发酵法生产l 一乳酸的研究现状 乳酸菌中常用于生产l 乳酸的主要有以下四个属中的四十余种，即乳杆菌属 ( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌属e u c o n o s t o c ) ，球菌属 ( p e d i o c o c c u s ) 。其大多数为革兰氏阳性菌( g + 1 ，无孢予，不运动，兼性厌氧。由于乳 酸菌自身合成b 族维生素和氨基酸的能力有限，使其营养要求很高，在合成培养基上 难以生长。大多数l 乳酸产生菌属于乳杆菌或链球菌属。乳酸脱氢酶( l d h ) 具有立 体特异性，乳酸菌细胞内乳酸脱氢酶的同分异构形式决定了产物乳酸的同分异构现 象。 z h a n g 等【1 2 】研究了食淀粉乳杆菌n r r l b 4 5 4 2 直接从淀粉发酵生产l 乳酸的条件， 淀粉的起始浓度为1 2 0 l ，从液化淀粉出发，可在2 0 h 生产出浓度为9 6 2 9 l 的乳酸。 k a r i n h o f v e n d a h 1 3 1 等人采用乳酸乳球菌发酵1 0 6 h 产l - 酸l o o g & ；用德氏乳杆菌发酵 l o o h 产l 一乳酸9 5 9 l 。路福平等【1 4 】发表了芽孢乳酸菌凝结芽孢杆菌t q 3 3 的筛选及产酸 条件研究结果，其最适生长温度4 5 5 0 ，厌氧条件下发酵葡萄糖为l 乳酸，7 2 h 产酸量最高达至1 j 6 7 8 9 l ，其中l 哥l 酸占9 6 以上。d a n n e r 等i l5 j 采用嗜热脂肪芽孢杆菌 菌株f a 6 和i f a 9 ，以葡萄糖为碳源，分批培养发酵生产l 乳酸，转化率分别为8 4 o 和9 8 7 。p a y o t 等【16 筛选到能在5 2 。c 生长的一株凝结芽孢杆菌t b 0 4 ，能在培养基不 灭菌的条件下发酵生产乳酸，经条件优化，乳酸的最终浓度为5 5 e , m ，转化率为9 2 。 h u j a n e n 等 】对干酪乳杆菌n r r i ，b 4 4 l 产l 哥l 酸进行优化，在1 6 0 9 l 葡萄糖时，最高 乳酸浓度达虱j 1 8 6 e e l 。他们采用廉价的大麦芽提取物加少量酵母膏( 4 9 l ) 取代单独 使用酵母膏( 2 2 p d l ) ，大大地节省了生产成本。刘勇军【18 j 等人将出发菌株采用离子注 入诱变并经耐高糖商酸的选育和驯化后，得到一株目的菌株l b l 1 ，其最终l 乳酸产 量达到7 0 9 l 。徐子钧【1 9 】利用紫外线、亚硝基肌、d e s 等理化因子对从自然界筛选到 的乳酸菌进行复合诱变，再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一 株高产l - i f , 酸的正向突变株m 7 ，平均发酵产量9 0 9 l l ，比原菌株产量提高3 0 ，对 4 糖的转化率为8 8 9 。乐晓沽等【2 0 】利用紫外线诱变方法，对出发菌株干酪乳杆菌 y b q l 1 进行诱变处理，筛选得到一株正向突变株y b q h 2 1 4 ，其l 乳酸产量达到 9 3 9 几，对糖转化率达至1 7 7 5 ，比出发菌株产酸提高4 8 5 。郑艳【2 i 】等人以初筛得到 的一株干酪乳杆菌鼠李糖亚种突变抹r 2 为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酯复合诱变 处理，筛选出一株产乳酸较高的突变株z y ，l 乳酸含量达9 3 9 。以正交试验为基础对 发酵培养基进行优化，l 乳酸产量达4 7 8 5 9 l ，对糖的转化率达9 6 - 3 。 4 2 根霉发酵法生产l 一乳酸的研究现状 根霉属中产l 一乳酸的菌种很多，有米根霉俾o r y z a e ) 、黑根霉饵n i g r i c a n s ) 、华根 霉俾c h i n e n s i s ) 、行走根霉限s t o l o n i r e 力和小麦曲根霉( 尼r i t i c i ) 。像其它丝状真菌一样， 根霉表现出复杂的生长形态，主要有菌丝、菌球和大块聚集物。其生长形态主要受到 以下一些因素的影响：菌种生长的特性，营养供应状况，培养基的p h 值，搅拌，通气， 接种量和基质浓度等。目前在根霉发酵生产l 一乳酸研究中，通过控制菌体形态使之聚 集成为一定大小的球体进行乳酸发酵，因其操作简便、费用低而成为研究的热点。 根霉属中的米根霉是生产l 乳酸的理想菌种。国内外对于米根霉的选育工作作了 大量的报道。y u 等【2 2 j 对米根霉直接发酵农产品生产l 哥l 酸进行了研究，以碳酸钙为 中和剂，每千克粗淀粉原料可生成3 5 0 9 以上的l 哥l 酸，并申请了美国专利。曹本昌等 5 】选育了一株产l 哥l 酸的根霉j s m i r 7 3 ，在5 0 0 l 发酵罐进行扩大实验，当葡萄糖浓度 为1 0 时产酸7 0 9 l ；3 时产酸1 0 1 9 ，l 以上，其中l 哥l 酸的纯度最高达9 9 。蒋明珠 等【2 3 】从5 6 株根霉中筛选出1 0 株产l - 乳酸较高的菌株，其中根霉r 一4 7 产l 一乳酸最高，产 酸稳定，在摇瓶培养条件下，初始葡萄糖浓度为1 5 、3 5 、4 8 h 产l 碍l 酸达1 1 8 4 l ， 对糖的转化率达7 8 9 。福州大学杨虹等【2 4 】利用淀粉酸性培养基富集培养，并结合高 锰酸钾溴化钾平板检出的方法从土壤中筛选出产乳酸为8 1 9 几的根霉r 2 菌株，以其 为出发菌株经紫外线诱变，从琥珀酸平板上获得r 2 9 1 ，以葡萄糖为碳源的情况下产 酸1 0 3 9 l ，对糖转化率为6 8 9 。1 9 9 4 年s u n t o m s u k l 2 5 1 通过紫外诱变或n t g 诱变处理， 得到了三株高产l ( + ) 乳酸的米根霉i n l 、3 n 4 署i 4 n 6 ，基于淀粉的转化率分别为6 2 、 5 0 、和5 2 ，比原始出发菌株提高了近一倍，为直接利用淀粉发酵生产乳酸奠定了 基础。1 9 9 4 年天津工业微生物研究所的杨子培等人【2 6 1 使用米根霉t l 5 2 7 9 菌株以玉米 淀粉深层发酵生产l 哥l 酸，在3 m 3 发酵罐中，当玉米淀粉投料浓度为1 3 0 9 l 时，7 罐 平均产酸9 4 i g ，l ，对糖转化率为7 9 5 5 ，发酵液经分离、提取和精制，o 乳酸纯度 达9 8 以上，该研究具有较高的工业应用价值。1 9 9 9 年河北省科学院生物研究所董超 等人2 7 1 使用米根霉3 0 7 3 发酵生产l 乳酸，当培养基中初始葡萄糖浓度为1 0 时，发酵 9 6 h ，l 乳酸产量为7 4 8 9 a c ，对糖转化率为7 8 7 。2 0 0 0 年上海工业微生物研究所虞 东胜等人【2 8 1 从7 8 株米根霉中筛选出1 3 株产l 乳酸较高的菌株，其中米根霉r s 9 2 8 产l 乳酸最高，产酸稳定，以葡萄糖为发酵碳源，在6 0 t 发酵罐中，当总糖平均浓度为1 7 4 9 l 时，发酵6 1 h 产l 乳酸1 4 0 9 l ，对糖转化率为8 0 4 ，l 乳酸纯度为9 7 9 ，此项研究 成果具有较高的工业价值，已在上海投入工业生产。2 0 0 1 年马美荣等人 2 9 1 使用米根霉 c 3 9 5 以玉米淀粉为碳源发酵生产l ( + ) 乳酸，当玉米淀粉投料浓度为1 2 0 9 l 时，在3 5 下发酵7 2 h ，l 乳酸产量为9 3 8 8 9 l ，对糖重量转化率为8 6 0 7 。中科院等离子研究 所古绍彬等 30 】以葡萄糖为碳源对p w 3 5 2 菌株特性进行了研究，并在此基础上采用离子 束诱交方法，对米根霉p w 3 5 2 进行改良，获得高产l 乳酸菌株1 l e 3 3 0 3 ，产酸能力达 1 3 1 l 1 3 6 9 l ，最高可达1 4 0 9 r c ，糖转化率为8 6 9 0 。 4 3 细菌和根霉发酵法生产l 一乳酸的比较 利用乳酸菌发酵生产乳酸虽然具有糖的转化率高，能耗要求低等优点。但对营养 要求严格，乳酸菌属于化能异养型微生物，他们缺乏对许多有机化合物的合成能力， 必须由外界提供多种营养物质和生长因子，如各种氨基酸、维生素、核酸碱基等，才 能很好的生长发育。同时乳酸菌发酵生产乳酸需要严格的无菌操作，若在发酵过程中 混入了杂菌将会大大降低产量，也很难得到高光学纯度的乳酸。根霉生产乳酸虽然具 有理论转化率低，能耗高等一些不足，但却具有营养要求简单、发酵周期短、色素生 成少、杂质含量低、易于提取分离和产品纯度高等特点。因此对根霉进行菌种改良和 发酵工艺的改进，将会使根霉生产l 一乳酸的能力大大提高。 5 t - - - 孚l 酸生产菌的选育 优良的微生物生产菌种是提高产率和经济效益的重要保证。因此，应该进行野生 型乳酸产生菌株的筛选开发工作，发掘自然微生物资源中的优良菌株并且对其进行诱 变育种工作。 5 1 低能离子注入诱变 离子束生物工程学是一门兴超于我国的交叉科学。最初离子束被应用于半导体行 业、材料科学和微电子口”。1 9 8 6 年中国科学院等离子体物理所余增亮发现n r 离子注 入水稻种子诱发变异【3 2 】证实了质量( 粒子) 沉积效应的存在，开辟了低能粒子与生物 体相互作用这一新的研究方向。经过多年努力，该技术在植物、动物和微生物品种改 良上取得了良好繁荣效果，为生物的遗传改良开辟了一条新的途径【3 ”，引起了国内外 学者的关注1 3 4 , 3 5 1 。 5 2 低能离子注入对生物诱变的基本原理 低能离子通常指能量低于m e v 级的荷能粒子。离子注入生物材料后，一部分离子能 量转换成靶原子的能量，引起表面二次离子发射，即所谓离子溅射。另一方面，由于 电荷交换，或者入射离子能量转移给靶原子电子，引起入射离子径迹上靶原子电离， 这种瞬时的电荷积累在库仑力作用下，将生物分子或碎片抛射出来，这就是所谓的“电 子溅射”，离子束的溅射好比把手术刀，对生物体进行表面层层剥离，后来的离子 6 就可以穿行较长的距离，落在预定的位置上p “。 低能离子与生物物质相互作用大致可分为能量沉积，动能传递，质量沉积和电荷 交换等四个原初反应过程【3 7 _ 4 0 1 ，低能离子注入生物体引发的生物学效应是多方面的， 表现出一些不同于辐射生物学的特征。传统辐射的剂量一一存活率曲线是指数递减的 肩型曲线，而低能离子的剂量一一存活率呈先降后升再降的“马鞍”型曲线【4 l 】，这就 解释了低能离子注入具有生理损伤小，突变率高的原因。 5 3 离子注入的应用 在低能离子生物学应用方面，离子注入农作物改良开展得最早也最为广泛，几乎 涉及所有大宗的粮食作物和经济作物，现已育成1 1 个品种，其中应用最早的水稻已育 成7 个新品种。其它农作物如番茄、小麦、玉米、大豆、烟草、茶树、甘薯和谷子的 品种改良也取得了不同程度的进展1 4 2 _ 4 8 1 。 离子注入技术应用于动物品种改良最早的工作是在家蚕上开展的。应用氮离子注 入蚕卵和蚕蛹，不仅观察到一些特殊的生物效应，而且从后代中选育出一批优良的基 因型材料，经选育有全茧量和茧层量增大，纤度增粗的趋势【4 9 】。 离子注入技术在微生物上应用起步虽晚，但成果显著，中国科学院等离子体物理 研究所先后对利复霉素、花生四烯酸、v c 、柠檬酸生产菌种进行改良。经诱变筛选， 利复霉素发酵水平提高4 0 ，2 0 吨罐化学效价达6 3 0 0 单位 5 0 1 ；花生四烯酸生产菌是经 离子束辐照发酵水平提高较多的另一品种，其产酸量最终提高至细胞干重的4 5 5 1 1 。 对2 一酮基一l 古龙酸( r e 前体) 生产菌进行的改良，是运用离子注入技术改良微生物 取得较好经济效益的又一项目，其糖酸克分子转化率由最初的7 5 提高至1 j 9 4 ，为当 时国际最好水平p 2 1 。 离子束注入技术在克服远缘杂交的困难方面取得了一定的成果。在生物工程方 面，离子束被成功地用于介导外源基因的转移，从而开辟了一种新的基因转移方法。 在此基础上发展起来的离子束介导遗传转化技术已在水稻、小麦、棉花等多种植物上 取得成功”。 6 r a p d 技术及应用 6 ，1r a p d 技术及特点1 5 7 j 随机扩增的多态性d n a ( r a p dr a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 是1 9 9 0 年由美国杜邦公司的科学家w i l l i a m s 5 8 】和加利福尼亚生物研究所的科学家w e l s h 领导 的两个小组几乎同时发展起来的利用随机引物寻找多态性d n a 片段的d n a 分子标 谴技术。该技术以低聚核苷酸( 通常1 0 b p ) 作为引物，以供试材料d n a 为模板，进 行p c r 扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用e b 染色，在紫外灯下可观察 到多条d n a 谱带，这些扩增产物d n a 片段的多态性，可以反映出基因组相应区域 的多态性。 r a p d 具有以下优越性：( 1 ) r a p d 技术利用随机引物对d n a 基因组进行遗传 信息检观。这和r n t ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片段长度多 态性) 5 9 , 6 0 1s s r s ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 简单重复序列) 6 1 1 、a f l p ( a m p l i f i e d f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增性片段长度多态性) 【6 2 】等分子标记技术相比，减 少了引物的设计过程、便于迅速展开检测工作。( 2 ) r a p d 技术模板d n a 的用量极 少，而且实验过程不需要进行s o u t h e r n 杂交等繁琐过程，因而实验简单易行；( 3 ) 大 量的随机引物可检测出整个基因组的多态性信息。虽然随机引物的种类可有4 1 0 之 多，但目前已被设计并用于科研的有5 2 0 条( a 。z 组，每组2 0 条) 。仅这5 2 0 条引物 就足以覆盖整个基因组，以标记基因组上的多态性区域。( 4 ) 随机引物是人工定序合 成的，可以批量生产，降低试验成本。另外，r a p d 技术可快速寻找到与目的基因相 连锁的d n a 标记，以定位目的基因：在物种分子生物学信息不明的情况下r a p d 技术可以进行该物种基因组指纹图谱的构建等。这些优势与特点落实在分于标记技术 上，即体现出实验方法的简单、实验手段的快捷，是其它分子标记技术所不可比拟的。 但r a p d 技术也有其自身难以回避的缺点。因其引物短，在扩用过程中不能完全配 对，使得r a p d 产物对p c r 反应条件非常灵敏，稳定性、重复性差，可比性不强。 但只要通过适当途径修正弥补其缺陷，其在分予标记技术领域占有重要地位。 6 2r a p d 技术的应用 r a p d 技术，作为一种全新的标记手段，广泛地应用于粮食作物、经济作物及微 生物的基因定位、亲缘关系的鉴定及分子育种等方面。1 9 9 3 年h a l e ys d 等【6 3 】通过与 普通扁豆抗锈病基因连锁的r a p d 标记定位了该基因；1 9 9 7 年y a n g ，h y 等【6 4 】把与苹 果抗结痂紧密连锁的r a p d 标记定位了抗结痂基因v f ：m a n n i n e m ，o m 等( 6 鄙通过与 大麦t 0 0 1 1 0 c u s 紧密连锁的r a p d 标记确认了该基因；c h e n gk t 等忙6 j 用r a p d 标记 对于茎黄连进行了性状上早期鉴定研究。r a p d 标记在系谱分析及分类方面显示其独 特的优越性【6 7 1 。w o l f f k 等 6 8 j 9 1 用r a p d 方法对菊花进行了系统分析，建立了套快 速遗传多样性鉴定实验体系。d o ss a n t o 对蔬菜的r a p d 标记 7 0 的聚类分析将各品种 遗传关系弄清。在种质资源遗传亲缘关系1 7 17 2 1 r 研究方面，r a p d 标记可以为亲本选配 提供依据，并有效地预测杂种优势，同时一些原始品种或野生品种以及一些异源品种 中存在的某些优良性状对作物品种的改良有着巨大的潜力，因此确定不同品种间的亲 缘关系及其在进化上的地位【7 3 - 7 5 1 。并有选择的利用它们来改良作物具有重要意义 7 6 】。 而r a p d 技术从d n a 分子水平反映了基因组的多态性，因而更能准确揭示个体间的 差异和物种的相关性。一般可以根据各品种指纹图谱的差异程度，判断品种间亲缘关 系 7 7 , 7 8 1 的远近，通过测量品种之间的遗传距离 7 9 _ 8 1 】，进行系谱分析和分类【8 2 - 8 4 1 研究。 r a p d 技术可以利用一系列引物对整个基因组d n a 进行多态性检测分析，能在一次 反应中检测基因组的多个位点，因而它可快速检测出两组d n a 样品问的多态性差异， 得到与差异区域连锁的d n a 标记，因此，利用r a p d 可定位某一特定d n a 区域的 特定基因，也可为r f l p 连锁图上的某一区域增加新的d n a 标记。通过分析与目标 基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在，这种“标记间接选择”方法不受其 他基因效应和环境因素的影响，结果较可靠，同时可在早期进行选择，从而大大缩短 育种周期，提高选择效率。 9 引言 乳酸是一种天然的有机酸，是食品工业的重要酸味剂和防腐剂，也是医药、化工、 皮革、香料等工业的重要原料。由于人体内只含有l 一乳酸脱氢酶，只能利用l 乳酸， 所以l 乳酸被公认为安全食品添加剂。l 一乳酸通过聚合反应生成的聚l 乳酸( p l a ) 是一种能被生物降解的高分子材料，可用作各种包装材料、手术缝合线等，这被认为 是解决目前世界范围内日趋严重的“白色污染”最有效的方法之一。世界上乳酸的需 求量递增很快。我国的乳酸工业起步较晚，产品以外消旋的d l 一乳酸为主，而商光学 纯度的l - 乳酸产量很低，由于合成p l a 需要的l 哥l 酸光学纯度至少应该达到9 2 以 上，因此目前筛选l 一乳酸量高的菌株，对乳酸产业进一步发展具有重要意义。 微生物发酵法生产乳酸具有原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高和安全 性好等优点，该法通过菌种选育或代谢调控而获得单一的l 一乳酸，可以满足生产l 一 乳酸的需要，。是生产乳酸的重要方法。而优良的微生物生产菌种是提高产率和经济效 益的重要保证。因此，进行野生型乳酸产生菌株的筛选工作，发掘自然微生物资源中 的优良菌株，对已有菌株进行诱变育种工作十分重要。 低能离子注入技术是2 0 世纪8 0 年代兴起的一种材料表面处理技术，由中国科学 院等离子物理研究所的余增亮首创性的将该技术应用于农作物改良和微生物的诱变 育种，开辟了育种技术的新途径。低能离子注入生物体同时存在着能量沉积、动量传 递、质量沉积和电荷交换的过程，与传统的诱变方法相比，离子注入具有效率高、定 向性好、损伤轻和突变谱广等优良特点。 r a p d 技术可以利用一系列引物对整个基因组d n a 进行多态性检测分析，能在 一次反应中检测基因组的多个位点，如果被检测基因组在这些区域发生d n a 片段的