（环境工程专业论文）纤维素高效降解混合菌的筛选及其糖化发酵条件研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 本课题在能源危机恶化而秸秆纤维又严重浪费的双重大背景下提出，目的 是通过寻找对秸秆纤维素有高效降解作用的混合菌对秸秆进行降解达到资源化 利用。基于上述目的，首先从分茵着手，以长期被秸秆、植被覆盖的土壤为样 本，经反复富集培养和分离纯化逐步得到1 4 株能在以羧甲基纤维素钠( c m c - n a ) 为唯一碳源的固体培养基上生长的天然菌株；然后经滤纸崩解测试、刚果红纤 维素平板识别，筛选出1 0 株适应性强、纤维素降解效果明显的真菌；通过固态 发酵试验，定量掌握1 0 株菌的生长周期及其产酶情况，从而确定出4 种组合方 式；通过比较这4 组固态发酵中c i v i c 、f p a 酶活大小及其同生性的优劣，最终 得到一组对纤维素降解效果最好的混合菌。经鉴定两株菌分别为毛霉菌( m u c o r s p ) 和曲霉菌( a s p e r g i l l u sm ) 。 为使筛选的混合菌能最大限度的发挥对纤维素的降解作用，分别从种子制 各、培养基优化和培养条件优化三个方面，通过单因素和正交两种试验方式对 其糖化发酵条件进行深入研究。初步确定种子制备过程中，最佳接种方式为茵 丝接种，最佳接种时间为3 d ；培养基的最佳组合为稻草粉：麸皮= 8 ：1 ，( n 地) 2 s 0 4 含量= 2 5 ，固液比= 1 ：1 5 ；最适培养条件分别为：当p h 值自然、接种量2 0 、 接种比2 ：1 、2 8 下培养5 天时，c m c 酶活最大为7 3 2 4 1 u ，当p h 值自然、接 种量3 0 、接种比1 ：1 、2 8 下培养5 d 时，滤纸酶活最大为7 5 3 4 1 3 。与目前报 道的纤维素降解菌相比，酶活有了一定的提高，为实际中纤维素资源的能源化 利用提供一定的理论基础。 关键词：纤维素；混合菌；固态发酵；正交实验 西南交通大学硕士研究生学位论文第页 a b s t r a c t t h i sq u e s t i o nf o rd i s c u s s i o nw a sa d v a n c e db a c k g r o u n db yt u r n i n gw o v eo f e n e r g ys o n r c t ：sc r i s i sa n dt h ew i s t eo fs t r a wc e l l u l o s ew i t ht h ea i mo fs e a r c h i n gf o ra k i n do fm i x e ds t r a i n sw h i c hc a rd e c o m p o s es t r a wc e l l u l o s ee f f i c i e n t l y s ot h et h e s i s w a sb e g a nw i t hi s o l a t i n gs t r a i n sf r o ms o i lc o v e r e dw i t hs t r a wa n dv e g e t a t i o n , a n d t h e nv i ae n r i c h m e n tc u l t u r i n g , s e p a r a t i n ga n dp l l r i f y i n g , 1 4s t r a i n sw e r eg o t t e n w h i c hc a l lg r o wi nt h es o l i dm e d i u mw i t hc m c - n aa sa no n l yc a r b o ns o u r c c o nt h e b a s i so ft h e s es t r a i n s ，1 0s t r a i n so ff u n g iw h i c hh a db e t t e ra d a p t a b i l i t ya n dc a n d e c o m p o s e c e l l u l o s e e f f i c i e n t l y i s s c r e e n e d t h r o u g h t h e e x p e r i m e n t s o f d e c o m p o s i t i o no ff i l t e rp a p e ra n di d e n t i f y i n go fc e l l u l o s e - c o n g or e dm e d i u m b y s o l i df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t a t i o n s ，t h eg r o w t hp e r i o da n dt h eo u t p u to fc e l l u l o s eo f t h e1 0s t r a i n sc o u l db ek n o w nq u a n t i f i c a t i o n a l l ya n d4k i n d so fm i x e ds t r a i n sw e r e c h o s e n b yc o m p a r i n gt h ee a r b o x y lm e t h y lc e l l u l o s e ( c m c ) a c t i v i t y , t h ef i l t e rp a p 盯 a c t i v i t y ( f p a ) a n dt h em u t u a la d j u s t a b i l i t yo fe v e r yc o m b i n a t i o n t h eb e s to n ew a s f i n a l l yc h o s e na n di d e n t i f i e da sm u i rs p a n da s p e r g i l l u ss p i no r d e rt og a i nt h eb i g g e s ta c t i v i t yo ft h em i x e ds t r a i n s ，s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n i n c l u d i n gt h ep r e p a r a t i o no fg e r m s ，c u l t u r em e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o nw e r e o p t i m i z e du s i n gs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t w h e nm y c c l i u mc u l t u r e dt h r e ed a y sw e r ei n o c u l a t e db y2 0 a t1 ：1i nt h es o l i d m e d i u mt h a ti ss t r a w ：b r a n = 8 ：l ，( n i 五) e s 0 4 = 2 5 ，s o l i d ：l i q u i d = l ：1 5 ，a n dt h e n c u l t i v a t e da tn a t u r a lp h ，a r o u n d2 8 f o r5 d ，7 3 2 4 1 ua st h eh i g h e s tc m c a c t i v i t y c a nb ea c h i e v e d , b u tw h e nt h eg r o s sa n dr a d i oo fi n o c u l a t i o nw e r et u r n e di n t o3 0 a n di ：i r e s p e c t i v e l y , 7 5 3 4 ua st h eh i g h e s tf p a 啪b ea c q u i r e d c o m p a r e dw i t h o t h e rr e p o r t s ，t h ew h o l ee n z y m ea c t i v i t yo ft h ec e l l u l a s es y s t e mh a db e e ni m p r o v e d a n dt h er e s u l tc a nb ea na c a d e m i cb a s e0 fu t i l i z a t i o no fe e l l u l o s e k e yw o r d s ：c e l l u l o s e ；m i x e ds t r a i n s ；s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n ；o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 课题的研究背景及意义 随着世界人口的激增和更多国家的加速工业化，能源消费急剧增加，而作 为主要能源的石油却日益匮乏，这种能源的供需矛盾必然连带影响到经济发展 和社会安定，因此世界各国纷纷展开新的替代能源的研究与开发，其中以燃料 乙醇最为突出。 自2 0 世纪3 0 年代起，巴西就首先开始了乙醇- 汽油混合燃料的大规模使用 【l l ，主要是在汽油中掺入2 2 的乙醇或全部代替汽油。到1 9 9 9 年巴西乙醇产量 达近1 3 0 亿l ，除少量出口外其余全部自用田。 2 0 世纪7 0 年代，爆发世界石油危机后，1 0 乙醇与无铅汽油混合的方法开 始引入美国并迅速在中西部各州占领市场。8 0 年代乙醇与柴油混合在技术上的 可行性得到证明后，美国开始以玉米为原料生产燃料乙醇，并将其应用于混合 燃料。1 9 9 9 年美国乙醇产量达到6 0 亿l ，其中仅运输部门就消耗4 5 4 亿l ，约 占汽油总消耗量的1 1 3 】同年，美国政府提出到2 0 1 0 年生物质能在全美能源 中所占比重要提高3 倍达到2 0 的发展目标【2 l 。 与此同时，欧洲的瑞典和法国亦以小麦等为原料生产燃料乙醇，添加到汽 油和柴油中应用。欧盟也采取了相关措施促进生物燃料使用，计划到2 0 0 5 年生 物燃料作为交通运输燃料至少占市场份额的2 ，到2 0 1 0 年末至少占5 7 5 ， 到2 0 2 0 年生物质乙醇能源在总能源结构中所占比例将提高到8 4 1 。加拿大也 将这种混合燃料列入本国的环境保护计划( e c o l o g o ) 1 5 1 。 日本是世界第3 大石油进口大国，该国的乙醇协会，在借鉴美国技术基础上提 出了系统的开发方案，希望快速发展燃料乙醇，减少对石油进口的依赖，同时 减少c c h 的排放吲。 进入2 1 世纪后，用玉米生产燃料乙醇已受到我国政府和相关产学研部门的 高度重视。在河南省、吉林省和黑龙江省等地己开始建立推广车用乙醇汽油的 试点。到1 9 9 9 年，全球乙醇产量已达3 3 0 亿l ，其中有5 8 用作汽车燃料( 2 j 。 虽然现在利用粮食来生产燃料乙醇的技术已经成熟，而且这也是燃料乙醇 生产的主要手段。但随着人口的剧增，粮食的短缺，该生产必然会受到土地、 原料等方面的限制，从而进一步提高了乙醇的成本，使得该行业难于创收，反 而成为国家的补贴对象；另一方面如果通过加大粮食的生产来解决原料的问题 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 那么会相应地减少其他种类植物的种植，从而影响到生物的多样性。 为解决这些问题，使乙醇燃料生产可持续的进行下去，必须从寻找更加丰 富而廉价的原料上着手。据资料表明【6 】，植物每年通过光合作用能产生高达 1 5 5 x 1 0 x o t 纤维素类物质，其中纤维素、半纤维素的总量为8 5 x 1 0 1 、。而每年用 于工业过程或燃烧的纤维素仅占2 左右，有很大一部分未被利用。还有一些废 弃物，包括农业废弃物，如麦草、玉米秸秆、玉米芯、大豆渣、甘蔗渣等； 工业废弃物，如制浆和造纸厂的纤维渣、锯末等；林业废弃物；城市废 弃物，如废纸、包装纸等，不断堆积会破坏环境，烧掉又会污染空气。若将它 们加以利用，不仅能降低乙醇成本，有效利用资源，还能减轻环境污染，可谓 一举多得。因此现在需要有更多有关利用植物纤维和废弃物纤维生产燃料乙醇 的技术研究，包括原料预处理的方法、适宜菌种的分离筛选、发酵条件的优化 和工艺路线的摸索等等，从而推动燃料乙醇生产的技术革命，促进燃料经济的 可持续发展。 本课题即由此出发，分离筛选高效降解稻草的混合菌种并对其发酵条件进 行优化研究，有着重要的现实意义。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 秸秆利用技术 目前，民间秸秆实际利用率不高，主要利用途径也仅限于直接还田、直接 燃烧、经加工处理作牲畜饲料、用于造纸、编织和建材行业的原材料等简单方 式。事实上随着科技的进步，秸秆还可以有更经济、更环保的利用方式。 1 、秸秆制炭技术 利用作物秸秆生产炭品的工艺流程是1 7 】：先将秸秆晒干或烘干，然后粉碎 并造粒，再把颗粒放置在制炭设备中，同时隔绝空气或只供给少量空气，并对 其进行加热，使秸秆热解转化成固体木炭，秸秆制炭实际是个热解过程。秸秆 碳具有体积小，运输方便，品味较高，利用率高，使用方便，干净卫生，含硫 量低，灰分小，燃烧时无有害气体，不污染环境，工艺简单等诸多优点。 2 、秸秆食用菌培养技术 在我国各地利用秸秆为原料，栽培平菇、毛木耳、草菇和香菇等食用菌类， 丰富了人类的食物资源，满足人们对食品多样化的需求，均衡人类的食物营养。 3 、秸秆气化技术 主要包括热解汽化技术和厌氧消化技术嗍。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 热解气化技术是将秸秆进行可控缺氧燃烧，生成含有一氧化碳、甲烷和氢 气等的可燃气体。通过热解气化，把秸秆中的大部分能量转移到气体中，生产 的气体燃料更容易燃烧和方便使用。作为气化原料，秸秆有以下突出优点： 炭的活性高：在8 0 0 1 2 、2 m p a 以及有水蒸气存在的条件下，秸秆中的炭气化反 应迅速，经7 分钟后，有8 0 的炭可被气化，在相同的条件下，煤炭只有5 被气化；挥发性高：在较低的温度( 3 5 0 1 2 左右) 下，秸秆能迅速释放大约8 0 的挥发组分，而煤却要在较高的温度( 6 0 0 1 2 ) 下才能释放出挥发份，且释放 量较低( 3 0 4 0 ) ；秸秆的含硫量低：可大大降低气体脱硫净化的费用； 灰份少：秸秆的灰份含量较低，其它产生的灰份少，可大大简化灰渣处理费 用。 厌氧消化反应是有机物在厌氧的条件下被微生物分解、转化成甲烷和二氧 化碳等，并合成自身细胞物质的生物学过程【9 】。其反应主要经过两个阶段，即 酸性发酵阶段和碱性发酵阶段。首先可降解的固体颗粒被水解成可溶性分子， 产酸菌利用这些溶解的微粒作为能量和生长基质进行发酵，产生有机酸、醇类、 硫化物和能量，并形成细胞物质。然后由甲烷菌( 专性厌氧菌) 将以上中产物 继续分解成简单的化合物，如c h 4 、c 0 2 、n i - 1 3 等。 4 、秸秆制乙醇技术 秸秆制取乙醇的工艺为1 1 0 ，1 1 】：洗涤、水解、蒸煮软化、糖化发酵、蒸馏取 酒等工序。乙醇的转化需要两个步骤：秸秆中纤维素水解成还原糖，还原糖发 酵成乙醇。第一步是关键，如果木质纤维素不能被预先降解成简单的可发酵糖 类，则无法实现乙醇的后续发酵。添加高效的木质纤维素酶是提高木质纤维素 水解效率的常用手段。 总的来讲，我国作物秸秆利用还处在起步阶段。大量的秸秆被焚烧或遗弃 在农田的现象在我国广大农村普遍存在，上述诸多作物秸秆利用的新技术未能 在国内得到广泛应用。造成这种现象的主要原因是对作物秸秆的高效综合利用 研究滞后。作物秸秆综合开发利用的产业没有形成，秸秆利用的经济效益低下 所致。鉴于以上四项技术产物中，乙醇的使用最为方便，用途最为广泛，更是 现今研究者心目中替代石油能源的首选，具有更高的经济价值和现实意义，因 此本文将就此技术进行深入的实验研究。 1 2 2 秸秆发酵制乙醇的工艺 秸秆发酵制乙醇的工艺主要有以下五种： 1 、直接发酵法 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 本方法的特点是基于同一微生物糖化发酵纤维素生产乙醇，不需要经过酸 解或酶解前处理过程。直接发酵法中常用的微生物是热纤维梭菌，它能分解纤 维素并使产生纤维二糖、葡萄糖、果糖等发酵，水解发酵的最适温度为5 6 6 4 ，最适p h 值为6 4 7 4 。吕福英等1 1 2 】分离出能直接发酵纤维素生产乙醇的高 纯富集物，利用其能直接将木质纤维素材料发酵成乙醇。 该工艺方法设备简单，成本低廉；但乙醇产率不高，产生有机酸等副产物。 利用混合菌直接发酵，可部分解决这些问题。例如热纤梭菌能分解纤维素，但 乙醇产率较低( 5 0 ) ，热硫化氢梭菌不能利用纤维素，但乙醇产率相当高，进 行混合发酵，产率可达7 0 ，提高乙醇乙酸比值1 0 倍以上【1 3 1 2 、间接发酵法 间接发酵法即糖化、发酵二段发酵法，该法是目前研究最多的一种方法， 首先利用纤维素酶水解纤维素，酶解后的糖液作为发酵碳源，利用酵母或细菌 发酵生产乙醇。 在间接发酵( s h f ) 工艺中，糖化发酵独立进行，每个过程都可以在最佳 条件下完成，但水解产物的积累会抑制纤维素酶的活性。这种方法相对直接法 乙醇产率较高，但纤维素原料需要事先经过一定的预处理。 此外乙醇产物的形成还受以下因素限制：末端产物抑制，低细胞浓度以及 基质抑制。为克服乙醇产物的抑制，必须不断的从发酵罐中移出，采取的方法 有：减压发酵法、快速发酵法、阿尔法拉伐公司的b i o t i l e 法。筛选在高糖浓度 下存活并能利用高糖的微生物突变株，以及使菌体分阶段逐步适应高基质浓度， 可以克服基质抑制1 1 4 1 。 3 、同步糖化发酵法 由于纤维素水解和乙醇发酵所需的酶系通常来自不同的微生物，最适反应 条件各不相同。所以，最初的水解和发酵过程一般是分开进行的。在水解系统 中，为了克服可溶性糖的反馈抑制作用，要么增加纤维素酶的用量，要么扩大 容积降低反应液中可溶性糖的浓度。这都要增加酶解过程的生产成本。为了克 服反馈抑制作用，g a u s s 等【1 5 】提出了在同一个反应罐中进行纤维素糖化和乙醇 发酵的同步糖化发酵( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n , s s f ) i l ”9 1 这样纤维素酶对纤维素的酶水解和发酵糖化过程在同一装置内连续进行， 水解产物葡萄糖由菌体的不断发酵而被利用，消除了葡萄糖因基质浓度对纤维 素酶的反馈抑制作用。在工艺上采用一步发酵法，简化了设备，节约了总生产 时间，提高了生产效率，但也存在一些抑制因素，如木糖的抑制作用、糖化和 发酵温度不协调等。 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 4 、非等温同步糖化发酵法 在纤维素酶糖化过程中，纤维素酶的最适温度为5 0 左右，而酵母发酵的 控制温度是3 1 3 8 。z h a n g w e n w u 等【刎提出了利用非等温同时糖化发酵 法( n o n i s o t h e r m a ls i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n , n s s f ) 生产乙 醇的工艺流程。利用n s s f 法很好地解决了纤维素酶糖化与酵母发酵两个过程 中温度不协调的矛盾。通过热交换器的热量传递，使纤维素酶糖化阶段与酵母发 酵阶段能够保持各自的最适反应温度，同时能最大限度地减少反应体系的能量损 失。采用n s s f 法乙醇发酵生产工艺，可以节约纤维素酶3 0 4 0 ，同时乙醇的 产量和产率均显著提高【2 l j 。 5 、固定化发酵法 固定化技术是生物工程技术的一个重要方面，包括固定酶法和固定细胞法， 即通过化学或物理方法将酶或整个细胞固定在载体上，使其便于回收及反复利 用。因此固定化技术可以变革传统的生产工艺，将其应用于乙醇发酵过程具有 发酵器酶或细胞浓度高、可重复使用、稳定性强、生产周期短、降低成本、最 终发酵液酒精浓度高等优点。 美国、日本在2 0 世纪7 0 年代初开始进行纤维素酶固定化的研究，国内只 是近几年才开始这方面的研究 z z l 。m 弱鼢”l 【i 【矧以肠溶衣聚合物为载体固定化纤 维素酶，可保留酶活力6 0 以上，回收率可达1 0 0 ，并且对微晶纤维素的水解 率明显高于游离酶。陈盛等【刎以壳聚糖为载体固定化纤维素酶，结果发现固定 化纤维素酶的最适p h 向酸性方向移动( p i - 1 3 3 5 7 ) ，最适温度升高到6 0 ， 酶活力回收率为7 5 。利用固定化纤维素酶技术，对促进纤维素糖化发酵实现 工业化生产有十分重要的意义。 固定细胞法研究最多的是酵母和运动发酵单孢菌的固定化常用的载体有 海藻酸钠、卡拉胶、多孔玻璃等。研究结果表明，固定化运动发酵单孢菌比酵 母更具优越性。将微生物固定在汽液界面上进行发酵的研究报道，微生物活性 比固定在固体介质上高。 固定化细胞的新动向是混合固定细胞发酵，如酵母与纤维二糖酶一起固定 化，将纤维二糖基质转化成乙醇，此法引人注目，被看作是纤维素生产乙醇的 重要阶段。夏黎明等1 2 5 】采用海藻酸钠包埋进一步增殖培养，将休哈塔假丝酵母 的细胞密集固定在凝胶珠表层，大大减小了传递阻力，为该菌的“半好气“发 酵创造了有利条件。固定化增殖酵母能利用己糖和戊糖及8 0 e , l 的混合糖( 己 糖和戊糖各占一半) ，经1 2 h 发酵，糖的利用率为9 0 5 以上( 而相同条件下的 游离细胞发酵需要4 8 h ) 。邓旭等【硐提出了利用固定化啤酒酵母和固定化毕赤酵 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 母串联发酵混合糖制取酒精这一种具有工业前景的新工艺，它实现了发酵过程 的连续化操作，又消除了葡萄糖效应对木糖发酵的影响，保证了木糖发酵与葡 萄糖发酵在串联流程中的同步性，从而大大缩短了混合糖发酵的周期，保证了 整体发酵速率。同时，邓旭等口7 】还对固定化啤酒酵母和固定化毕赤酵母在两个 串联的固定床内连续发酵由葡萄糖和木糖组成的混合糖制取酒精的过程，建立 了连续发酵的非结构动力学模型，并成功地引入了一个综合考虑颗粒相内外传 质的总有效因子简化模型的计算。 鉴于间接发酵法是目前研究最多、最为可靠的方法，较直接发酵法产率较 高，与其他方法相比，设备简单，技术要求不高，成本低廉，更具产业化优势， 因此本试验选择采用此种发酵工艺。 1 2 3 预处理方法 天然状态下的作物秸秆由纤维素、半纤维素、木质素及部分蛋白质、氨基 酸j 树脂、单宁等组成。因为纤维素的高结晶度、高聚合度以及木质素与半纤 维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶 不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性，导致了秸 秆的难降解性。所以，要彻底降解纤维素，提高秸秆的利用率，必须首先对其 进行预处理。主要方法有物理方法、化学方法和生物方法。 1 、物理方法 ( 1 ) 机械法：包括切碎、粉碎、磨碎、高温球磨等。其目的是降低其结晶性， 增加接触面积，加大酶解速度或通过破坏细胞壁结构使之易于消化。经切碎处 理后的原料大小通常为1 0 3 0 n m ，而经粉碎、碾磨之后的原料颗粒大小一般为 0 2 2 衄。但粉碎法能耗大，占糖化过程总能耗的5 0 6 0 ，且不适用于各 种材料的处理i z s 。 ( 2 ) 高温分解法：当原料在3 0 0 c 以上的高温条件下处理时，纤维素快速分 解成气态产物和残余烧焦物。较低温度下分解速度较慢，生成较少挥发物。高 温分解法预处理的残余物进行温和的酸水解( 0 5 m o l l h 2 s 0 4 ，9 7 ，2 5 h ) 可 使8 0 8 5 的纤维素转化成还原糖，产生超过5 0 的葡萄糖。分解过程可以 通过加氧来强化。当氯化锌或碳酸钠作为催化剂时，可以在低温下获得纯纤维 烈冽。 ( 3 ) 高压爆破法：是研究得较为深入的一种方法。将木质纤维原料先用高温 高压饱和气体处理适当时间，然后连同水蒸汽一起从反应器中急速放出而爆破 粉碎。该过程主要是使o 和b 烯丙醚键断裂，使纤维素物质结合层受到破坏， 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 提高酶作用的敏感性，在2 0 0 c 的高温下，半纤维素发生自水解作用而可溶化， 木质素也发生部分降解，交得易被有机溶剂或稀碱抽提，加上突然减压爆破的 机构分离作用，破坏了植物纤维的细胞结构，使纤维素酶解率明显提高。常用 的有氨冷冻爆破法p o 、蒸汽爆破法1 3 1 1 、c 0 2 爆破法【3 2 1 。蒸汽爆破法预处理的优 点是：比机械磨碎法能耗低、无环保或回收费用。在相同的木片长度减少量下， 机械法比蒸汽爆破法消耗的能量高7 0 。 高能辐射法：需要高能射线流发生装置，设备成本高，能耗大，但这种 方法也有以下优点：处理后的粉末纤维素类物质没有胀润性，而且体积小可以 提高基质浓度，得到较高浓度的糖化液；将物料粉碎成极小的颗粒，一方面使 其表面积大大增加，另一方面破坏了其结晶性，使其在以后的糖化阶段更易于 反应【3 3 】。 ( 5 ) 微波超声波法：微波处理法能使纤维的分子间氢键发生变化。超声波处 理能使木浆纤维的形态发生变化，纤维细胞壁出现裂纹，细胞壁发生位移和变 形，有更多的次生壁中层暴露出来。表明用微波或超声波对纤维素进行预处理， 能提高纤维的可及性和反应活性i 郸”。 2 、化学方法 ( 1 ) 氧化法：臭氧可以用来分解木质纤维素原料中的木质素和半纤维素【3 5 j 。 此法的优点是可有效去除木质素，不产生对进一步反应起抑制作用的物质，反 应在常温常压下进行。缺点是需要臭氧量比较大，整个过程成本较高。在过氧 化氢存在的情况下木素可被过氧化物酶催化降解。采用过氧化氢预处理甘蔗渣 可以增强其对酶水解的敏感度。在2 过氧化氢、3 0 条件下预处理8 h ，后续 糖化作用中( 4 5 条件下经过纤维素酶水解2 4 h ) 大约5 0 的木素和大部分半 纤维素溶解，纤维素转化成葡萄糖的转化率为9 5 3 2 1 ( 2 ) 酸水解法：高浓度强酸( 如硫酸、盐酸) 可用来处理纤维素原料。这些 酸可有效水解纤维素，但酸具有腐蚀性，对人体有害，需要在耐腐蚀的反应器 内进行反应。另外，反应完成之后还要回收酸以降低成本稀酸水解纤维素的 技术已比较完善。用稀硫酸可以达到较高的反应速率，明显地提高纤维素的水 解率。在高温下，纤维素水解适合采用稀酸预处理。稀酸水解法降低了反应条 件，且可以提高木聚糖转化成木糖的转化率。在许多纤维素原料中，木聚糖在 碳水化合物中占1 3 还要多，所以提高木聚糖的转化率对于提高整个过程的经 济性来说显得非常必要。稀酸预处理有2 种基本类型：高温( 大于1 6 0 ) ，连 续反应，低固体负荷( 5 1 0 ) ；低温( 小于1 6 0 ) ，间歇反应，高固体负 荷( 1 0 4 0 ) 闭。稀酸法的费用要比许多物理化学预处理方法高。另外， 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 预处理完成之后要中和剩余的酸以便进行下面的酶水解或发酵过程。 ( 3 ) 碱水解法：许多碱也可用于对木质纤维素原料的预处理。用热或冷碱液 ( n a o h 或液氨) ，浸泡秸秆或喷洒于秸秆表面，以打开纤维素、半纤维素和木 质素之间的酯键，增加须知原料的多孔性，溶解纤维素、半纤维素和一部分木 质素及硅酸盐，使纤维素膨胀，从而提高消化率。清华大学化工系将纤维原料 经n a o h 处理后发酵，蛋白质含量由2 2 提高到1 8 8 【3 7 1 。蔗渣经n a o h 处理 后糖化率可达6 0 【弼。氨处理法使用的是1 0 左右的氨溶液，主要去除的是纤 维素原料中的木质素【3 9 l 。美国普度大学的可再生资源工程实验室曾用氨水处理 纤维原料【帅】，浙江大学生物化工研究所也利用过该法进行糖化乳酸发酵研列3 9 】。 ( 4 ) 有机溶剂法：在有机溶剂法中，有机溶剂或水性有机溶剂和无机酸催化 剂混合物可用来断裂木素和半纤维素内在的化学键。使用的有机溶剂包括甲醇、 乙醇、丙酮、乙烯基乙二醇、三甘醇及四氢化糠基乙醇。有机酸比如草酸、乙 酰水杨酸和水杨酸可作为有机溶剂法的催化剂。在高温条件下无需添加催化剂 即可获得满意的脱木素度。使用的溶剂经过排放、蒸发、浓缩和回收处理，既 可降低成本又避免了阻碍微生物生长、酶法水解和发酵的化合物生成1 3 2 j 。 3 、生物方法 生物方法就是利用具有强木质纤维素降解能力的微生物对秸秆先进行固态 发酵，把作物秸秆中的木质纤维素预先降解成易于厌氧菌消化的简单物质，以 缩短随后的厌氧发酵时间、提高于物质消化率和产气率。其技术关键就是寻求 强木质素降解能力的菌种，并确定其适宜的发酵条件。 生物预处理法常用于降解木质素的微生物有白腐菌、褐腐菌、软腐菌等真 菌。褐腐菌主要攻击纤维素，白腐菌和软腐菌攻击纤维素和木素。生物预处理 法中最有效的白腐菌是担子菌类【3 2 】。瑞典等北欧国家【3 2 】则利用担子菌突变株进 行脱木素处理，取得了显著的效果。这种方法的优点是作用条件温和，能耗低， 无污染。其不足之处是周期过长、水解得率很低以及白腐菌在生长过程中会利 用掉部分纤维素和半纤维素。此外还可用专一的木质酶处理原料，分解木质素和 提高木质素消化率。此种方法虽在试验中取得了一定的成功，但仅还停留在实验 阶段。 由于本实验重点在纤维素降解混合菌种的筛选和糖化发酵条件的优化，对 前期的预处理方法未作比较，直接采用了成本最低的机械粉碎法进行预处理。 1 2 4 纤维素降解菌的选育 纤维素微生物的研究始于1 9 1 2 年，到现在大致经历了3 个高峰发展时期【4 1 】： 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 2 0 世纪5 0 年代以前主要是研究防止微生物对天然纤维的破坏作用；2 0 世纪6 0 年代到7 0 年代针对世界人口的剧增，主要研究利用纤维素资源生产单细胞蛋白； 2 0 世纪7 0 年代以后，随着能源危机和环境污染，研究的重点又逐步转移到开辟 新能源和防止环境污染上来。近二、三十年来，在纤维素酶菌株的选育、纤维 素酶组分及降解机制、纤维素酶合成的调节和控制以及纤维素酶应用等诸多分 枝课题都取得了很大的进展然而，由于目前现有的纤维素酶的酶解效率普遍 偏低，远不及淀粉酶和蛋白酶，从而影响了纤维素酶的大量生产和广泛应用 因此，进一步寻找和开发出高产纤维素酶菌株，并不断改善和优化培养条件， 这是纤维素资源能否高效利用的关键。 自然界中纤维素酶的来源相当广泛：原生动物、节肢动物、软体动物和昆 虫等能产生纤维素酶；在高等植物中也有纤维素酶，其作用是使细胞壁松弛， 与种子发芽、细胞生长有关；在微生物方面，真菌、放线菌及细菌等在一定条 件下均可产生纤维素酶，经初步统计1 4 2 】，已发现的具有降解纤维素能力的微生 物有近2 0 0 种，其中研究较多的有真菌中的木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属 和漆斑霉属等，细菌中的纤维杆菌和纤维粘菌属等，放线菌研究得较少，分解 纤维素能力较高的放线菌有黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌等。 一般而言，从自然界直接选育得到的原始菌株的酶活不高，酶组分不全， 因此通常有宏观、微观两个解决思路： 宏观思路就是利用菌种之间共生的特性，将不同菌种进行混合培养进行发 酵，以弥补单菌酶组分不全、活性不高的弱点。宋颖琦等 4 3 1 筛选出3 种分解纤 维素能力较强的木霉、青霉和曲霉，将3 种菌株以不同的组合形式在羧甲基纤 维素钠为唯一碳源的产酶培养基中进行产酶特性的研究，结果发现单个菌种的 降解能力是有限的，如果把分别具有较强的木质素降解能力、较强的纤维素降 解能力的各单项优势菌种同时或分别接种到同一种秸秆上进行多菌种混合培 养，则有可能更进一步的提高木质纤维素的降解率和产气率。 微观思路就是对菌种进行遗传改造。过去以常规诱变为主，近年来基因重 组技术、基因定位突变技术和细胞融合技术在纤维素酶菌株的构建上取得了可 喜的进展。中科院上海植物所等单位【4 4 1 采用多种诱变剂复合处理拟康氏木酶野 生型菌株，过得了e a 3 8 6 7 和n 2 7 8 ，是目前国内纤维素酶活力较高的两菌株； 曲音波等【4 5 】采用紫外线处理斜卧青酶来选育抗降解物阻截的突变菌株，也获得 较好结果。美国c c t u s 公司用基因工程技术构建产纤维素酶的工程酵母菌获得 成功i 蛔，该工程将里氏木酶的产酶基因移入酵母细胞中，通过这种工程酵母可 有纤维素直接发酵获得乙醇和甘油。还有报道【4 7 l ，纤维单胞菌的纤维素基因也 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 可以被克隆到大肠杆菌中，这种大肠杆菌可以产c m c 酶，但产量较低。日本学 者【勰】利用原生质体融合技术研究t r e s s i 的遗传，所选择的两个亲本菌株为里氏 木霉q m 9 4 1 4 和q m 9 4 1 6 ，其融合率为0 9 4 x1 0 r 4 ，得到的融合子期稳定的错 甲级纤维素酶活性比亲本高一倍，后来工作进一步扩大到不同种木霉之间进行 细胞融合研究。但就整体来看，由于对纤维素酶基因结构和作用机理缺乏深入 了解，利用这些技术提高酶活的稳定性较差，因此该领域方向尚需大量细致工 作。 1 2 5 酶法糖化秸秆纤维的原理 1 、纤维素酶的组分 纤维素分解酶是一种多组分的复合酶系，是能将纤维素降解转化成葡萄耱 的一组酶的总称，目前普遍认为【4 9 1 ，完全降解纤维素至少需要三种功能不同， 但又具有互补作用的活性酶组分：( 1 ) 内切型1 3 葡聚糖酶( e n d o 1 ，4 - 且 - d g l u c a n a s e ，e c ，3 2 1 4 ，简称e g ) ，或称c i v i c 酶或c x 酶。所有纤维素分解 菌均能产生此酶。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解1 3 1 , 4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；( 2 ) 外切型1 3 葡聚糖酶( e x o - 1 ，4 - 1 3 d g l u c a n a s e ，e c ，3 2 1 9 1 ，简称c b h ) ，或称 微晶纤维素酶或c l 酶。此酶广泛存在于丝状真菌，可降解晶体纤维素。这类酶 作用于纤维素分子末端，水解1 3 1 , 4 糖苷键，每次切下一个短链的非还原性末 端纤维二糖残基：( 3 ) 1 3 葡萄糖苷酶( 1 3 g l u e a n a s e ，e c ，3 2 1 2 1 ，简称b g ) ， 或称纤维素二糖酶。此酶广泛存在于微生物中，可将纤维二糖三糖水解成葡萄 糖分子虽然它对纤维素无作用，但它可以消除上述两种酶催化反应的终产物 对反应的抑制作用，从而加快反应速度。对纤维素酶组分的进。步研究表明上 述三大类酶又可分为一些亚组分。 2 、纤维索酶降解机理 关于纤维素酶降解机理通常有的四种理论 5 0 l ： o ) c , - c x 假说 1 9 5 0 年r e e s e 等人就对纤维素酶的作用方式提出了一个著名的c 1 - c x 假 说：c l 酶首先作用于结晶纤维素，使形成结晶结构的纤维素链开裂，长链分子 的末端部分游离，使其转化为非结晶形式，从而使纤维素链易于水解；c x 酶随机 水解非结晶纤维素，可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的1 3 1 ，4 - 寡聚物；1 3 葡萄糖 苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖。这个c 1 、c x 分阶段水解的设想可以 表述为： 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 1 页 c l 一一 q p 一葡萄糖苷酶 结晶纤维素无定形纤维素+ 可溶性产物一i 可溶性产物 ( 2 ) 办同理论 协同理论认为纤维素降解的过程是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和且一葡 萄糖苷酶协同作用的结果所谓的内切外切协同一般认为是一种酶反应的顺序 机理：内切葡聚糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，切断纤维素分子链，形成更 多新的纤维素游离末端，为外切纤维素酶水解纤维素创造条件，然后外切纤维 素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，p 葡萄糖苷酶水解纤维二糖形 成葡萄糖。内切葡聚糖酶的水解作用增加了外切葡聚糖酶的水解作用点，因而， 起着外切葡聚糖酶酶水解纤维素的活化作用。这种活化作用和纤维素结构的性 能是符合的，因为结晶纤维素的分子量很大，端基在纤维总量中的比例很小， 天然的结晶纤维素对外切的葡聚耱酶来说很少可作用的位置。根据缨状原纤结 构理论，纤维素中结晶结构是不完整的，结晶区之间存在纤维素分子的穿插， 因而，在内切葡聚糖酶的作用下，就可以在纤维的结晶结构表面形成外切葡聚 糖酶可作用的端基，从而使纤维素的结晶结构水解。纤维素酶的协同作用不仅 可以发生在内外切酶之间，还可以存在于外切酶之间。 ( 3 ) 原初反应假说 c o u g h l a n 提出了结晶纤维素降解的多步骤学说，认为原初反应即无序化反 应使纤维素的结晶状态发生改变，更便于随后的纤维素酶的水解。由于天然纤 维素是种水不溶性底物，因此纤维素酶与大多数能转化可溶性底物的酶不同， 它必须在接触和催化发生之前扩散到纤维素微纤维表面才能起催化作用。在研 究纤维素降解的原初反应机理时发现，由于纤维素酶分子太大以致于不能进入 纤维素内，所以认为其降解可能有小分子非酶试剂参与。 ( 4 ) 碎片理论 早在6 0 年代，短纤维形成现象就已被发现。该理论认为天然纤维素首先在 一种非水解性质的解链因子或解氢键酶作用下，纤维素链内或链内的氢键打开， 从而形成短纤维，然后再在其它纤维素酶的作用下进行水解。 纤维素酶将天然纤维素转化成葡萄糖过程中的细节至今仍不清楚，普遍认 为是纤维素酶各组分协同作用的结果。但各组分如何作用，尤其是结晶纤维素 降解成无定形纤维素的过程中，是由非酶因子作用还是由其它酶因子作用仍然 是研究热点。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 2 页 1 3 课题来源及主要研究内容 1 3 1 课题来源 本课题以四川省应用基础项目秸秆乙醇发酵高效菌株的筛选及其新型工 艺的研究为选题来源，综合考虑试验条件的可行性而确定。 1 3 2 研究内容 1 、根据生态模拟法原则，采集长期被稻草覆盖的土壤样品。通过一系列方 法从中分离筛选出纤维素降解效果明显的降解菌株。 2 、对分离出的菌株进行定量产酶测定，掌握不同菌种的生长特性，根据微 生物之间的互惠同生现象，将菌种进行组合，分别进行酶活测定，综合考虑产 酶时间和酶活大小两个因素，最终得到一组优良的混菌组合。 3 、对筛选出的混和菌分别进行分类鉴定，研究其适宜的生长条件，为发酵 过程条件研究提供理论依据。 4 、通过单因素试验和正交试验对该混合菌的发酵条件进行研究，内容包括 培养基主要成分( 碳氮源种类、碳氮源比例以及固液配比) 和培养条件( 接种 时间、接种量、接种比例、p h 值、发酵时间、发酵温度) ，从而确定该混合菌 的最佳产酶条件，为秸秆酶法发酵生产乙醇的研究提供试验基础 具体试验路线见图1 - 1 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 3 页 图1 - 1 本论文研究技术路线图 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页 2 1 引言 第2 章纤维素降解菌的分离筛选 纤维素物质是世界上最为丰富的可再生资源，通过微生物降解作用使其转 变为有效能源是该类物质合理利用的有效途径。然而在实际的工业生产中存在 的菌种活性不高、能源转化率低、成本居高不下等问题，因此从特定的生态环 境中以特定的方法分离筛选出产酶高、生长快、适应力强、对培养和产酶条件 要求都不高的自然菌株是十分重要的。在此基础上，利用菌种之间存在互惠同 生效应，将不同菌种进行混合培养，筛选出最佳的混菌组合，以弥补自然单菌 酶组分不全、活性不高的弱点，为工业生产提供实验基础。 2 2 试验菌株 菌株分离自农村中稻草秸秆堆积的腐殖土壤样品。 2 3 实验材料 2 3 1 稻草粉 采自农村的稻草经自然风干后粉碎过l m m 筛，麸皮也粉碎过l m m 筛。 2 3 2 实验用培养基 1 、富集培养基： k 2 h p 0 40 2 ，( n h 4 ) 2 s 0 40 1 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 3 ，c a c l 20 0 3 ， f e s 0 4 7 h 2 0 5 x 1 0 r 4 ，m n s 0 41 6 x 1 旷，z a s 0 41 7 x 1 0 ，c o c l 2 2 x 1 旷， 滤纸条2 ，p h 5 5 ，1 2 1 灭菌3 0 m i n 。 2 、分离平板培养基羧甲基纤维素培养基( c m c 培养基) ： c i v i c - n a1 5 9 ，n h 4 n o , l g ，酵母膏1 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，k h 2 p 0 4l g ， h 2 01 0 0 0 m l ，琼脂2 ，p h 自然，1 2 1 灭菌3 0 m i n 。 3 、菌种保藏培养基马铃薯葡萄糖斜面培养基( p o a 琼脂) ： 马铃薯2 0 0 9 去皮切块，煮沸半小时后用纱布过滤，滤液再加葡萄糖2 0 9 和 琼脂2 0 9 ，溶化后加水至1 0 0 0 m l ，p h 自然，1 2 1 c 灭菌3 0 r a i n ，制成斜面冷藏 备用。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 5 页 4 、滤纸条鉴定培养基： 唧4 ) 2 s 0 40 1 0 ，k h 2 p 0 40 1 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，k 2 i i p 0 40 2 ， 酵母青0 0 1 ，滤纸条( 1 x