（环境工程专业论文）玉米秸秆酶水解及发酵乳酸的研究.pdf

玉米秸秆酶水解及发酵乳酸的研究 摘要 纤维素是植物纤维细胞壁的主要成分，植物纤维是地球上最丰富的町再生资 源，为其寻求高效的利用，一直是众多学者所重视的课题。本文在前人研究的基 础上，根据我国植物纤维资源中农作物秸秆丰富的特点，选用玉米秸秆为原料、 乳酸为目标产物，采用两种工业上使用的酶，对原料酶水解影响因素及其水解动 力学和乳酸发酵等进行了研究。 纤维素的酶水解速度很慢，并受多种因素的影响。采用3 ，5 二硝基水杨酸 ( d n s ) 比色法测定一定时间内、不同水解条件下，秸秆经纤维素酶水解所产生 的还原糖浓度来表示水解速度。 本课题选用两种工业上用作纺织面料抛光用的纤维素酶水解玉米秸秆。使用 这种酶水解植物纤维未曾见报道。研究酶水解影响因素，目的是寻求最适酶水解 条件。研究发现纤维素酶的活力对瞳 的变化敏感，不同的酶最适p h 也有所不 同。实验条件下s u h o n g c e l l i s hl 最适p h = 4 4 ，c e l l u s o f ll 最适p h = 4 - 8 ，同时还 与水解温度有关；纤维素酶对温度变化也很敏感，温度影响酶蛋白的热稳定性、 酶与底物的亲和力和速度常数等。当温度升高，水解速度加快，但纤维素酶随温 度升高易发生热变性而失活，最适温度是两者的综合，最适温度也随水解时问等 因素有所变化，实验条件下水解时间从1 6 h 到2 4 h ，两种酶的最适温度从5 5 。c 到 5 0 。c ；研究还发现，一定浓度的金属离子和非离子型表面活性剂具有活化和稳定 纤维素酶的作用，实验中加入1 - 2 的吐温8 0 类表面活性剂，水解2 4 h ，s u h o n g c e l l i s hl 水解得到还原糖浓度增加2 5 ，c e l l u s o f ll 还原糖浓度增加1 4 ；同时 还研究了酶浓度、底物浓度对酶水解的影响。通过综合考虑各水解影响因素，得 出s u h o n g c e l l i s hl 最适水解条件为p h 4 4 ，温度5 0 。c ，加入2 非离子型表面活 性剂后，水解经稀酸预处理的玉米秸秆( 1 0 0 9 l ) ，水解4 8 h 还原糖浓度达到 4 2 5 m g m l 。 此外，还考察对比了玉米秸秆在纤维素酶及稀酸作用下的水解方法，并从水 解影响因素( 水解时间、温度、底物浓度等) 及水解机理上，比较了两种纤维素 酶与稀硫酸对玉米秸秆水解特性。通过水解糖液分析，以稀酸作为秸秆预处理， 再结合酶水解，对水解还原糖浓度得率町提高3 3 。 然后，根据纤维素酶水解机理，利用合理的假设推导出纤维素酶水解的动力 学方程，所得方程参数少、比较简单。以相对偏差平方和最d , 4 1 1 线性回归求出动 力学方程的参数，得出方程估算值和试验结果比较吻合。证实了模型和假设与实 际情况吻合，可以用此模型来预测试验结果。 最后，以酶水解糖液为原料，研究利用米根霉发酵生产l 乳酸的工艺条件。 试验中对米根霉发酵培养基和发酵条件进行了优化。在最优方案发酵培养基和最 适发酵条件下，米根霉发酵秸秆酶解液全过程中，乳酸累积量7 5 h 可达2 1 8 l ， 糖转化率为5 6 。 本论文的研究工作，对可再生的纤维素资源，利用生物转化方法生产乳酸的 工业化研究具有一定的指导作用，对提高纤维素资源的有效利用、促进资源的综 合利用及可持续发展战略的实施具有重要的意义。 关键词：玉米秸秆，水解，纤维素酶，动力学，发酵，乳酸 e n z y m a t i ch y d r o l y s i s o fc o r ns t r a wa n dl a c t i ca c i d f e r m e n t a t i o n a b s t r a c t c e l l u l o s ei st h em a i ni n g r e d i e n to fc e l lw a l lo f p l m l tf i b r e ，w h i c hi s t h em o s t a b u n d a n tr e n e w a b l er e s o u r c eo nt h ee a r t h ，e s p e c i a l l yt h ec r o ps t r a wi no u rc o u n t r y ， m a n ys c h o l a rh a v eb e e ns t u d y i n gp l a n tf i b r et og e tt h e mu s eh i g h - e f f i c i e n t l y b a s e d o nt h es u f f i c i e n ta n a l y s i so fp r e v i o u ss t u d y , w eu s e dc o r ns t r a wa sr a wm a t e r i a l ( ) i l h y d r o l y s i sf o rl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n i nt h i sw o r k ，t w oi n d u s t r i a la v a i l a b l ec e l l u l a s e s w e r es e l e c t e dt oa s c a t a l y s t s t h e e f f e c to fv a r i o u sf a c t o r st ot h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s 、t h ek i n e t i c sm o d e lo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so f c e l l u l o s ea n dl a c t i ca c i d f i z r m e n t a t i o nw e r es t u d i e dr e s p e c t i v e l y t h er a t eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc e l l u l o s ew a sv e r ys l o wa n dr e s t r i c t e d b y m m a yf a c t o r s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t b r e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc e l l u l o s ew a s s t u d i e da n dt h ec o n c e n t r a t i o no f r e d u c i n gs u g a rw a sm e a s u r e db yd n s t h e r ew a s r i o r e p o r ta b o u t t h et w o c e l l u l a s e s ( s u h o n gc e l l i s hl a n dc e l t u s o f tl 。) ，w h i c hw e r eu s e di n w e a v ei n d u s t r yf o rp o l i s h i n g ，h y d r o l y z i n gp l a nf i b r e b ys e l e c t i n gt h et w oc e l l u l a s e s t oh y d r o l y z i n gc o r ns t r a w , i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h ea c t i v i t yo fc e l l u l a s ew a ss e n s i t i v e t ot h ev a r i e t yp ha n dt h em o s ts u i t a b l ep hi sd i f f e r e n tf r o md i f f e r e n tc e l l u l a s ea n d r e l a t e dt o t e m p e r a t u r e t h e m o s ts u i t a b l e p hf o rs u h o n g c e l l i s hli s4 4a n d c e l l u s o f ili s4 8 t h et e m p e r a t u r ef o re n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a st h ei n t e g r a t i o no ft h e r a t eo f e n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dt h eh e a td e n a t u r a l i z a t i o no f c e l l u l a s e a st e m p e r a t u r e r i s i n g ，t h ef o r m e rw a sa c c e l e r a t e d ，a n dh o w e v e rt h el a t t e rw a sa c c e l e r a t e dt o o t l i e m o s ts u i t a b l et e m p e r a t u r ea l s ov a r i e dw i t ho t h e rf a c t o r ss u c ha st i m e u n d e rt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ，i ft h eh y d r o l y s t i ct i m ew a sp r o l o n g e df r o m 16 ht o2 4 h ，i t c h a n g e d f r o m5 5 t o5 0 f o rt h et w oc e l l u l a s e s i ta l s of o u n dt h a tc e r t a i n c o n c e n t r a t i o no fn o f l i o n i cs u r f a c t a n t ( t w e e n ) a n dm e t a li o n i ci nt h e h y d t o l y s i ss y s t e m s t a b i l i z e dc e l l u l a s ea n da c c e l e r a t e d e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，u n d e r t h c o p t i m i z e d c o n d i t i o nf o r s u h o n g c e l l i s hlh y d r o l y z i n go fc o r n s t r a w , t h ec o n c e n t r a t i o no f r e d u c i n gs u g a r r e a c h4 2 5m g m lj n4 8h h y d r o l y s i so f c e l l u l o s eu n d e re n z y m ea n da c i dh y d r o l y z i n gw a sa l s os t u d i e d t h e h y d r o l y s i sp r o p e r t i e s o fs u h o n gc e l l i s hla n dc e l l u s o f llc o m p a r e dw i t hd i l u t c s u l f u r i ca c i df r o mt h em a i n a f f e c t i n gt h c t o ro f h y d r o l y s i s ( t i m e 、t e m p e r a t u r e 、s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o ne t c ) a n dm e c h a n i s m t h ey i e l do fh y d r o l y z i n gc o l ns t r a wi n c r e a s e db y 3 3 i f c o m b i n i n ge n z y m eh y d r o l y z i n ga n da c i da sp r e t r e a t m e n t a c c o r d i n gt o t h em e c h a n i s mo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc e l l u l o s e t h ek i n e t i c e q u a t i o n o fe n z y m a t i c h y d r o l y s i s h a db e e nd e d u c e dw i t hr a t i o n a l h y p o t h e s e s ： p a r a m e t e r so ft h ek i n e t i ce q u a t i o nw e r ef i g u r e do u tb yn o n l i n e a rr e g r e s s i o nw i t ht h e s u m m a t i o no ft h es q u a r eo fr e l a t i v ed e v i a t i o nm i n i m i z e d ，t h ec a l c u l a t e dv a l u ew , a s c o i n c i d e dw i t he x p e r i m e n t a lr e s u l tc o m p a r a t i v e l y l a c t i ca c i df e r m e n t a t i o nb yr h i z o p u so r y z a ew i t ht h eh y d r o l y z a t ea sc a r b o n s o u r c ew a sa l s os t u d i e d c o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o na n dc u l t u r em e d i u mf o rr h i z o p u s o r y z a ew e r eo p t i m i z e d ，u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ，t h ec o n c e n t r a t i o n o fl a c t i ca c i d r e a c h2i 8m e m ea n dt h er a t i oo f t r a n s f o r mw a s5 6 i n7 5h i nt h i sw o r k ，t h e r ea r em u c hh e l pt o p r o d u c el a c t i ca c i db yd e v e l o p i n gf o rt h e c o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no f t h er e n e w a b l el i g n o c e l l u l o s e sm a t e r i a l i tw i l lb eag o o d c o n t r i b u t i o nf o rt h ed e v e l o p m e n to ft h er u r a la r e ae c o n o m ya n df o rt h es u s t a i n a b l e d e v e l o p m e n to f o a rc o u n t r y h u a n ga i l i n g e n v i r o n m e n te n 画n e e r i n g ) s u p e r v i s e db y ：p r o f z h o um e i h u a k e y w o r d s ：e o r ns t r a w , h y d r o l y s i s ，c e l l u l a s e ，k i n e t i c s ，f e r m e n t a t i o n ，l a c t i ca c i d 符号说明 b 一常数，b - k l + s 】o 一 e i o e 一纤维素酶 s 一底物( 溶解的纤维素多糖) p 一产物 e s 一纤维素酶与底物形成的复合物 g 一葡萄糖，g 2 一纤维二糖 k i 一反应速度常数i = 土i ，2 k 。一吸附平衡常数 k i 一平衡常数i - 4 1 ，2 e s 。一底物最大吸附酶量 【 一体积浓度 o - 初始浓度 t 一时间 v 一水解反应速度 k 一反应速度常数 m 一金属离子 h - - p l a n d k 常数 t 一水解温度 k - - b o l t z m m m 常数 ag 4 一水解反应标准g i b u s 焓变 r 一气体摩尔常数 a h + 一水解反应标准焓变 s t 一水解反应标准熵变 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所里交的学位论文，是奉人在导师的 指导f ，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引川的内容外，本论义不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作晶及成果的内容。论文为本人亲门撰写，我刘 所写的内容负责，井完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名氧谖? 参 日期： 凇年工月。日 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有大部r j 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被套阅戏借阅。本人授权尔华人学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复锚丁三段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属f 不保密团。 学位论文作者签名：多鞋旌 日期：彬年弓月，口日 ) 司骅 日期窃巾r 年3 月h 尔华大学硕十：学位论文 第一章绪论 植物纤维资源利用的研究是7 0 年代国际上出现石油危机后，在地球上寻求 可再， 三资源及化工原料的研究热点，作为地球上首屈一指且可年年再生的植物纤 维资源自然引人注目。有效地转化植物纤维资源以生产乙醇、木糖、有机酸和单 细胞蛋i l l 等产品的研究一一直是众多学者所重视的课题。植物纤维原料量多价廉， 随着生物技术发展，植物纤维原料的转化利用，将为能源开发和发酵工业的原料 丌辟新的来源，以实现资源永续利用，符合可持续发展战略的要求。 1 1 植物纤维资源及其利用 1 1 1 植物纤维资源的构成 植物纤维资源主要有农作物秸秆和林业废料两大类，我国每年产生的秸秆类 原料数量巨大，据估计约有十亿吨之多。这些资源大多未能得到有效利用，在我 国的+ 些玉米、小麦和水稻产地，每年夏秋季的秸秆焚烧既造成巨大的资源浪费 又带来严重的环境污染。 植物纤维原料主要是由纤维素、半纤维素、木质素三种组分构成( 见表1 一1 ) ，草本与木本植物的三大组分在相对含量上有一定差异，农作物秸秆主要属于 草本植物。 表1 一i 典型的植物纤维主要成分的含量 i 类别纤维素( )半纤维素( )木质素( ) l 木本植物 4 0 5 01 2 3 42 0 3 0 草本植物 3 6 4 52 5 3 81 5 2 5 1 纤维素 纤维素是b 1 ，4 d 葡萄糖苷的线性聚合物，它们的分子式可表示为 ( c 6 h i 。0 5 ) n 。含碳4 4 4 4 、氢6 2 2 、氧4 9 3 4 。 纤维素分子中相邻的葡萄糖残基旋转18 0 度，因而在纤维素分子中，纤维素 二糖( c e l l o b i o s e ) 可以看作是纤维素的重复单位，但通常说的聚合度则以葡萄糖为 东华人学硕士一位论文 单位。一般纤维素的分子量8 0 k d 一2 0 0 0 k d ，相当于5 0 0 1 4 ，0 0 0 个葡萄糖残基。 纤维素不溶于水和散的有机溶剂，但纤维素具有强亲水性，可被水溶胀。 纤维索能溶于碱性溶液和高浓度无机酸溶液中，如硫酸、盐酸、磷酸，以及高氯 酸镀、酒石酸钠的碱性溶液中。纤维素分予在溶解过程中“r 能会弓l 起降解| 2 】。 纤维素的化学性质比较稳定。但在一定条件f 纤维素能被氧化、酯化、醚化， 碱性条件下可发生水解反应，也能被酸和酶水解。但和淀粉相比，由丁0 * 葡萄 糖苷键比a 葡萄糖苷键的键能约大13 k c a r m o l 【，特别是其氢键的作用较强， 并能形成结晶，较为稳定，使得水解过程较难进行。一般来说纤维素酸水斛能力 比淀粉约低4 0 0 倍【4 j ，酶水解能力低1 0 0 1 0 0 0 倍【5 】。 2 半纤维素 半纤维素是典型的分枝杂多糖，一般由2 3 种单糖组成，因而是比较复杂的 一类多糖，聚合度为5 0 2 0 0 。 秤半纤维素中的糖单元按其所含元素分为：1 戊糖：d 一木糖、l 阿拉伯糖； 2 己糖：d 甘露糖、d 葡萄糖、d 一半乳糖；3 己糖醛酸：d 一葡萄糖醛酸、d 半乳 糖醛酸；4 脱氧己糖；l 鼠李糖、l 岩藻糖。其主要糖基是木糖、阿拉伯糖、甘 露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖。因而将半纤维素水解成单糖以及研究利用 这些单糖的微生物也是一个极为有意义的课题。 植物资源的半纤维素组分随来源不同而不同。禾本、谷类植物和硬木的半纤 维素是以b 一1 , 4 木聚糖为主，软术的半纤维素是以p 1 , 4 甘露聚糖和葡甘露聚糖 为主。木聚糖是木糖通过b 1 ，4 连接的聚合物，和纤维素类似而糖残基少一个羟 甲基，木聚糖之间不易形成氢键而有较大的水溶性。 半纤维素的链比纤维索的短得多，有的能溶于水、醇、二甲基亚砜、碱性溶 液等。半纤维素很容易被酸水解，其水解能力b e 纤维素高1 0 4 0 0 倍，与淀粉相 当。半纤维素也能被碱降解，还能被半纤维素酶水解。 半纤维索的水解酶系相当复杂。由于水解发生在糖苷键，因而半纤维素酶也 属于聚糖水解酶，按水解的单糖残基分为l 阿拉伯糖酶、d 一半乳糖酶、d 一甘露 聚糖酶、d 木聚糖酶。 3 木质素 小质素与纤维素及半纤维素不同，是一种复杂的高度交链的苯基丙稀聚合 东华大学硕士学位论文 物，且是一种没有结晶的无定形的结构，并具有粘合纤维性结构于一体的功能。 木质索不溶于水，可溶于酸溶液、碱性溶液及甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂中， 容易产生醇解和酸水解，也能进行卤化、硝化、氧化等反应。 只有很少的微生物可以降解木质素，它们在保持地球碳平衡中起着关键的作 用，因而在生态学上很有意义。白腐霉菌是已知降解木质素最有效和最快的微生 物，有的细菌种也能降解木质素m ”，但不如白腐菌快速和彻底。 木质素酶在工业上有着广泛的应用潜力。在降解木质素的酶中包括木质素过 氧化酶1 8 i 、锰过氧化酶一i 、乙二醛氧化酶。 1 1 2 植物纤维资源的利用现状 秸秆是籽实收获后纤维素成分含量很高的农作物残留物，包括玉米、稻草、 小麦、马铃薯等的秸秆。据联台国环境规划署报道，世界上种植的各种谷物，每 年可提供秸秆1 7 1 0 8 t ，其中被利用的秸秆等农林废弃物不足2 。我国是一个 农业大国，秸秆资源非常丰富，每年产量达数亿吨。据农业部项目专家预测，到 2 0 1 0 年我国的秸秆总产量将达7 2 1 0 8 t 。这些丰富的秸秆资源在我国利用率很 低，合理利用秸秆资源、保护环境，直接关系到国民经济的可持续发展。目前我 国农村秸秆的综合利用途径主要表现以下几个方面： i 秸秆用作燃料。即直接燃烧取暖或煮饭，随着农村经济的发展，此法将逐 渐被淘汰。而利用秸秆作新型燃料，如生产秸秆燃料( 热压生产秸秆炭 等) 、秸秆通过沼气转化、秸秆气化技术等，目前，仍处于研究和试点阶段， 由于存在经济、技术等方面的问题，难以推广应用。 2 秸秆作农村建筑材料。即秸秆用来盖草房。近年来，砖瓦房普及，草房已 不多见。因此，此法已逐渐退出历史舞台。目前，有报道将秸秆与化学胶 合剂混合，经热压生产轻型建材加以利用的，但只是处于起步阶段。 3 用作肥料。可以直接秸秆还田，也可以将秸秆焚烧后的草木狄当作钾肥还田， 还i 叮以经过沤肥后还用。 4 用作造纸、建筑及保温材料。麦秆、麻秆等可以造纸，麦秆还可以砌墙； 麦秆、稻秆可以用作包覆材料，起保温作用。 以上各种综合利用技术都没有形成大规模的工业化利用，只有造纸实现了秸 东华人学硕士学位论文 秆的工业化利用，但是主要以麦秆、麻秆为原料，对秸秆的利用有限，使得目前 农作物秸秆大量剩余和浪费。 在没有合理有效地利用这些秸秆之前，农民们唯一省时省力的做法就是露天 燃烧秸秆，这一问题的快速发展不仅污染环境，而且导致火灾隐患，严重影响和 十扰了经济发展的正常秩序，在一些地区造成了巨大的经济损失。据报道，成都 双流机场从1 9 9 6 年至今深受其害，1 9 9 7 年5 月1 4 1 8 同由于焚烧秸秆的烟雾 影响致使1 0 个航班无法降落，2 2 个航班延误。1 9 9 8 年5 月1 3 1 8 日有1 3 个航 班被取消，6 7 个航班延误，而且有愈演愈烈之势。再如1 9 9 9 年江宁梅山地区方 圆数十公里自5 月3 0 日大面积焚烧秸秆，焚烧时浓烟蔽日，导致南京禄口圈际 机场停b 两个小时，3 1 日采集的 s p 样品分析表明，钾含量上升了3 倍，硅含 量增大了9 0 ，严重影响了人民群众的身心健康。国家农业部针对此情况于1 9 9 7 年连续两次下发了关于严禁焚烧秸秆，做好秸秆综合利用工作的紧急通知； 次年国家农业部、财政部、环保局、民航、交通等部门又联合下发了关于严禁 焚烧秸秆，保护生态环境的通知。 由此可见，秸秆的焚烧已经严重影响了各项经济活动的正常进行，污染了环 境，杜绝秸秆焚烧势在必行，而解决问题的根本在于加快秸秆综合利用的研究， 对秸秆的流向进行疏导。 1 2 植物纤维资源生物转化利用 目前，考虑到植物纤维资源利用率仅有1 左右，主要用于建筑、造纸、燃 料和饲料等方面，且其有效利用低，大部分未被利用而被焚烧，这样既浪费资源 又污染环境。随着人口增加、工业发展和石油资源的枯竭，如钶综合高效利用可 再生植物纤维资源，引起世界各国极大关注和高度重视。随着生物技术的提高， 通过微生物技术方法将其转化单糖，继而进一步发酵生产乙醇、丙酮、糠醛、乳 酸等化工原料，对解决未来能源和资源问题具有重大的意义。 1 植物纤维材料的生物转化 植物纤维材料中包含纤维素、半纤维素和木质素。要进行生物转化须经过原 料预处理以除去木质素和半纤维素，再进行水解转化为葡萄糖，经微生物发酵的 发酵混合物，最后分离获得产品。如图1 - 1 所示，在这些过程中纤维素水解是最 东华人学硕士学位论文 为关键的一步。 酸碱酶酶酸微生物 iii 皇皇审 植物纤维材科1 三至亟 叫4 三至三 _ 4 三垂 4 ：i j i ： + 产品 图1 i 植物纤维牛才料的生物转化 在生物转化过程中，一般原料预处理和产品分离需单独进行，而水解和发酵 可以单独进行也可以同时进行。根据水解与发酵过程的关系，一般有下面二种工 艺： 植物纤维材料的转化一般采用三种工艺：( 1 ) 水解发酵分步进行。先将植物 纤维材料水解生成水溶性产物，而后经微生物发酵生产各种产品。这是最常用的 工艺，整个过程在不同的反应器中分步进行，易于控制，但存在产物抑制，限制 水解速度和纤维素转化率的提高。( 2 ) 同时糖化和发酵法。在同反应器中进彳 | 二 纤维素材料的糖化和发酵。在同时糖化和发酵方法中，葡萄糖和纤维二糖的浓度 较低，因而糖引起的产物抑制小，但工艺条件很难满足两者的优化条件。此工艺 在生成乙醇1 t t 1 2 、乳酸 1 3 , 1 4 峰过程中有研究者采用。( 3 ) 微生物直接转化。用两 种或两种以上微生物共同培养发酵，将纤维素材料直接转化为产品，如以秸秆为 底物进行绿色木霉和酵母共发酵生产单细胞蛋白，提高了底物的营养价值和纤维 素的转化率：用农业残余物生产蛋白饲料雌1 等。 1 2 1 植物纤维资源的预处理 植物纤维材料主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，这三种成分紧密地 结合在起。到目前为止，人类利用现代分析技术，对植物纤维的微观结构、各 组分的物理和化学性质及其分离技术已有很好的认识和掌握。在纤维素的微小构 成单位周围被半纤维素层和木质素层包围，妨碍酶或酸与纤维素的接触，同时纤 维素的结晶结构对酶或酸的敏感性很差。所以预处理是强化水解必不可少的f ”i 。 预处理引起植物纤维素的结构变化，或除去材料中的木质素和半纤维素【l8 1 、或 降低纤维素的结晶度，并增加可用表面积和底物的孔体积，从而增加原料的降解 度。因此人们不得不借助物理的、化学的、生物的方法来进行预处理，使纤维素、 半纤维素、木质素等分离开来i l t ”l ，破坏纤维素的晶体结构、降低聚合度，使纤 东华人学顾士学位论文 维材料的降解得以顺利进行i 2 0 1 。业已表明，在酶促降解、直接微生物降解及酸 催化水解之前，对纤维原料进行预处理，可以显著提高纤维原料的降解速度和增 加葡萄糖的产率 2 1 , 2 2 i 。 预处理作用主要包括几个方面：( 1 ) 溶解掉原料中的绝大多数半纤维素等非 纤维素成分和少部分纤维素组分，消除空问阻碍作用；( 2 ) 纤维素聚合度的降低； ( 3 ) 纤维素结晶度的降低；( 4 ) 纤维索晶体尺寸变小。 植物纤维素材料的预处理方法有物理法、化学法和生物法。物理法有微粉碎 ( 球麽) 、电离辐射、微波照射、快速减压、蒸汽爆破、y 一线照射与超声波振荡 等。用物理法处理过的植物纤维材料，木质素和半纤维素结合层被破坏，颗粒尺 寸和结晶度降低，比表面积增加，酶和酸的可及度明显提高，从而提高了水解效 率。物理法需要较多的能量，成本高。化学法使用酸、碱、有机溶剂或氧化剂处 理纤维素材料，脱除木质素与纤维素的结合，使酸或酶易与纤维索接触，提高水 解速度。化学法操作简单，但在酶水解之前需中和或除去化学试刘。比较理想的 方法是将物理法和化学法两者结合，先用物理法处理，再( 或同时) 用化学法处 理。使用能分解破坏木质素和半纤维素的微生物或酶对纤维素材料进行预处理的 方法即为生物法，如利用能使木材腐蚀的微生物对木质素分子的侧链进行氧化和 芳香环氧化裂解、采用木质素分解菌直接脱去木质素或利用分离的酶对底物进行 预处理，有时还将这些方法结合起来 2 3 , 2 4 j 。许多研究者对不同材料采用了各种预 处理进行研究。 ，z2 植物纤维的水解 植物纤维材料生物转化中最为关键的步是将纤维素转化为葡萄糖。植物纤 维材料中的物质一般都以聚合物的形式存在，只有降解成单糖才能被微生物利 用。纤维素水解成葡萄糖的方法有酸水解法和酶水解法。 1 植物纤维酸水解 酸法水解纤维素，这是比较成熟的方法。根据酸的浓度可分为稀酸水解和浓 酸水解。稀酸水解法使用浓度为0 5 i 的硫酸，在1 4 0 1 8 0 下水解；浓酸水 解法是8 0 年代术才开发出来的，采用7 0 左右的浓硫酸在较低的温度和压力下 进行水解。 东华大学硕 学位论文 酸水解存在很多问题：酸水解对设备有很强的腐蚀作用；酸水解条件苛刻， 需要较高的温度和压力；酸水解后需要中和，并产生大量的酸废水：浓酸水解会 生成有毒的分解产物如糖醛、酚类等物质，有时水解产物需要进一步分离方能用 作微生物利用，稀酸水解产糖率低，仅为理论值的5 0 6 0 。 由于卜述原因，限制了酸水解的发展和应用，现已基本被淘汰。 2 植物纤维酶水解 酶水解法是利用纤维素酶在温和的温度和p h 下进行水解。随着生物技术的 发展，人们对纤维素的酶法生物转化日益重视。 纤维索酶技术对纤维素转化具有清洁、安全，有取代化学方法的潜力。纤维 素酶水解与化学法水解相比其优点在于：条件温和、降解率高、可发酵糖、使用 生物催化剂，不需要回收。 酶水解法有广阔的应用前景，但由于酶水解法因酶水解反应时间长，至今仍 未达到工业水平。因而加快酶水解速度特别重要。要加快酶反应速度，一是提高 产酶微生物的酶活力；二是加强对原料的预处理：三是强化反应过程。 1 2 3 葡萄糖的发酵 葡萄糖发酵是目前微生物工业的基础，几乎所有微生物都可以利用葡萄糖， 因而用微生物发酵生产的产品，都可以利用纤维水解产生的葡萄糖。目前，纤维 素生物转化的主要产品有乙醇、乳酸、蛋白、丙酮等。特别是生产乙醇的研究最 多。 1 3 纤维素酶 纤维素酶( c e l l u l a s e ) 是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。 1 3 1 纤维素酶研究概况 俐1 8 8 6 1 8 8 8 年b a r y 和m a r s h a l l 在真菌中发现了纤维素酶。1 2 6 1 1 9 0 6 年 s e r l l i e r e 在蜗牛的消化液中也发现纤维索酶，能分解天然纤维素。1 9 9 3 年 g r a s s m a n 等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出了两个组分。四十年代对产 生纤维素酶的微生物进行了大量分离筛选工作，建立起了较为完整的分离筛选方 东华大学硕士学位论文 法。从1 9 5 0 年r e e s e 等提出纤维素酶作用方式的c 1 c x 假说以后，丌始转入纤 维素酶的基础研究，包括对纤维素酶的组成性质、作用方式、培养条件、分离提 纯、测定方法等。六1 一年代后，丌始研究绿色木霉和康氏木霉的纤维素酶，山于 分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化技术，对纤维素酶的研究有了比较 大的进展，并且实现了纤维素酶制剂的工业化生产，纤维素酶制剂的产量也逐年 增加。七十年代后，随着分离技术进一步发展，各种性质不同的高纯度纤维素酶 被得到。八十年代后期，开始了纤维素酶的基因克隆技术研究，并以改革酶的生 产工艺、改良酶的性质、降低酶的生产成本为目的。特别是纤维素酶基因在酵母 巾的表达是纤维素酶基因工程应用发展的一个重要途径，如果取得进展，酵母就 可以直接将纤维素转化乙醇2 ”。 我国纤维素酶的研究较晚。在六十年代初期，对分解纤维素的菌种进行过研 究。七十年代后，纤维素酶的研究迅速开展，在菌种选育、酶制剂生产和应用上 都取得了很大的进展。八斗j 年代召开全国性纤维素酶的学术会议。到九十年代以 后，有了比较多的研究报道。 1 3 2 纤维素酶的组分 纤维素酶是一种多组分的复合酶系，现已确定纤维素酶含有三种主要组分： 内切型b 葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ) ：也称c x 酶、c m c 酶、e g 。它能水解 溶解的纤维索衍生物，以及膨胀的和部分降解的纤维素，但不能作用于结 晶的纤维素。它以随机的形式在纤维素聚合物内的非结晶区进行切割，对 术端键的敏感性比问键小。它的主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三 糖。 外切型b 葡聚糖酶( e c 3 2 1 9 1 ) 也称c 1 酶、纤维二糖水解酶或微晶纤 维素酶、c b h 。c 1 酶是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解 过程中起主导作用，它能从纤维素链的非还原性末端切割，生成可溶的纤 维糊精和纤维二糖。 纤维二糖酶( e c 3 2 1 2 1 ) ：也称c b 或1 3 一葡萄糖苷酶、b g 。它能水解纤 维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二：糖和纤维三糖的水解很 快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。这种酶的专“性比较差。 ) ) ) “ ! o 东华大学硕士学位论文 纤维素酶的每一个组分又由若干亚组分组成，在将天然纤维素水解成葡萄糖 的过程中，必须依靠三种组分的协同作用才能完成。 1 3 3 纤维素酶水解机理 纤维素酶使纤维素转化成葡萄糖过程中的具体细节至今仍不清楚，尽管普遍 认为是纤维素酶各组分协同作用，尤其是对c 1 酶和c x 酶的作用方式，许多学者 持有不同的看法。1 9 5 0 年r e e s e 等人对纤维素酶的作用方式提出了一个著名的 c i c x 假龅； c 1c 。 结晶纤维素无定形纤维素可溶性产物 但是，r e e s e 提出的c l 和c x 分段水解纤维素的设想在以后的实验中并未得 到证实。6 0 年代以来，由于分子筛、离子交换树脂、电泳等分离技术的应用， 对纤维素酶组分及作用方式的研究更为深入。对于各组分之间的协同降解方式， 目前主要有两种看法： 第一种观点认为28 1 ，在协同降解过程中，首先由c x 酶在纤维素聚合物的内 部末端起作用，在纤维素的非结晶部分进行切割，产生新的末端；然后再由c i 酶以纤维素二糖为单位进行水解；最后由纤维素二糖酶水解将纤维素二糖水解为 葡萄糖( 见图i 2 ) 。 不溶性纤维素t 堕+ 不溶性和可溶性纤维寡糖 l 一一| c 1 酶 |+ 一一纤维二糖 l i i 一 i c b k 反馈抑制) f i t 葡萄糖 图1 2 另一观点以e n a r i 等为代表f 2 ”，认为首先是由外切型葡聚糖酶( c b hi 和 c b hl i ) 水解不溶性纤维素生成可溶性的纤维素湖精和纤维素二糖；然后由内 切型葡聚糖酶( e gi 和e g l i ) 作用于纤维素湖精，生成纤维素二糖：再由纤维二 糖酶将纤维素二糖分解成两个葡萄糖( 图1 - 3 ) 。 东华人学硕十学位论文 纤维素 c b h i c b h i i 、c b h ic b h l l 夕i ii 纤维糊精e g ie g i i 譬维二糖 c b 葡萄糖 图1 3 1 3 4 纤维素酶的活化和抑制 和其他的酶一样，纤维素酶在催化水解过程中受到某些抑制剂和活化剂的影 响。抑制剂使酶的活力减弱，一些抑制剂除去后酶活力可恢复，而有些抑制剂除 去后酶活力不可恢复。抑制大致可分为两类：物理性抑制和化学性抑制。物理性 抑制主要为障碍效应，由于抑制剂存在，纤维索酶与底物在空间上的接触受到障 碍，酶的活力减弱，比如纤维素材料存在的木质素和半纤维素就具有障碍效应， 采用适当的方法除去木质素和半纤维素就可除去抑制，恢复酶活力。化学性抑制 分为一叮逆和不可逆抑制。可逆抑制中酶与抑制剂的结合存在解离平衡关系，它又 分为竞争性、非竞争性、反竞争性和混合型抑制。不可逆抑制使酶永久失活”j 。 常见的纤维素酶抑制荆有重金属、卤素化合物、去垢剂、染料、单宁、花色 素和植物中的酚类等，纤维素水解产物如纤维素二糖和葡萄糖等以及底物如甲基 纤维素等，但研究最多的是与酶水解相关的产物抑制作用。与抑制相对应的是活 化，可提高纤维素酶活性的物质称为活化剂。有些物质在一定条件f 是抑制剂， 而条件改变时，就可能转化为活化剂。作为纤维素酶活化剂的有些无机盐如n a f 等、少数几个羟基化合物如甘油、非离子表面活性剂如t w e e n 8 0 等。 1 4 乳酸的性质、用途和发酵法生产 乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸，广泛存在于人体、动物体、植物和 微生物中，乳酸按其旋光性可分为d ( ) 哥l 酸，l ( + ) 一乳酸和d l 一乳酸三种。人体 只能代谢利用其中的l - 乳酸，因此，世界卫生组织提倡使用l 哥l 酸作为食品添 加剂和内服药，取代目前普遍使用的d l 乳酸。此外，l - 乳酸、l - 乳酸盐及其聚 合物还广泛应用于医药、农业和化学工业。尤其近几年，人们利用i 。- 乳酸聚合 东华大学硕士学位论文 物生成的聚l 乳酸制造生物降解塑料、绿色包装材料及农用薄膜，用j i 解决h 益严重的环境污染问题，引起了世界的，、。泛关注，应用前景十分广阔。 1 4 1 乳酸的性质、用途 乳酸( l a c t i ca c i d ) 的学名为一羟基丙酸( 2 - 羟基丙酸，2 - h y d r o x y p r o p a n o i c a c i d ) ，分子式为c 3 h 6 0 3 ，分子量9 0 0 8 ，是一种天然存在的有机酸。由于其分子 内含有一个不对称的碳原子，所以具有光学异构象，从而具有d 型和l 一型两种 构型。l 乳酸为右旋，但l 一乳酸盐或脂却是左旋；d 乳酸是左旋；当d ( ) 乳酸 和l ( + ) 一乳酸等比例混合时，即成为消旋的d l 一乳酸。 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，熔点为1 6 8 t 2 ，沸点为1 2 2 。c ，相对密 度1 2 4 9 。乳酸与水可以完全互溶，不易结晶。6 0 以上浓度的乳酸溶液有很强 的吸湿性。在6 7 1 3 3 p a 的真空条件下反复分馏，可以得到纯品的乳酸结晶。 由于乳酸分子中有羟基和羧基，所以具有酯化能力，乳酸的这种酯化能力使 其在开发可生物降解高分子聚合物方亟具有很广阔的应用前景。 乳酸脱水聚合形成聚乳酸的一般形式为： n h o - - c h - - c o o h c h 3 因此，浓乳酸中往往因产生聚产生偏差。另外， 加热让其自动酯化形成的乳交酯( l a c t i d e ) 结构如下： c h 3 一c h _ c 一0 00 l 0 一c 一一c h c h 3 聚乳酸因具有高强度热塑性、可纺织性、生物可降性( b i o d e g r a d a b l e ) 以及 可从再生资源发酵得到等优点引起了人们的兴趣，被认为是最具发展前途的日用 和工业用生物降解高分子材料之一。 乳酸在食品、医药、皮革、化工、印染、卷烟等行业均有应用。 1 食品与酿造业 食品工业所用的乳酸浓度一般为5 0 ，主要用于乳酸饮料、糕点和作酸味剂。 东华大学硕土学位论文 在食品丁业中，由于乳酸对人体无副作用，容易吸收，可直接参与