（物理电子学专业论文）集成光纤的毛细管电泳芯片检测系统的研制.pdf

摘要 摘要 毛细管电泳检测系统的研究是目前分析仪器发展的重要方向与前沿课题。它 可以实现对多种生物分子、离子等进行检测，是一种集进样、分离、检测等功能 于一体的分析平台，具有小型化、集成化的特点。本论文是研制一种与集成光纤 的毛细管电泳芯片相配套的小型检测系统。研究内容包括：检测系统的工作原理、 结构及其应用实验等。 研制成一台小型毛细管电泳芯片检测系统，该检测系统的特点是：用发光二 极管( l e d ) 作为激发光源：用光电倍增管完成光电信号的转换：双暗室结构避免 了外界杂散光的干扰：新颖的光纤耦合装置方便了实验的操作；四个高压电源模 块的使用，在电泳过程中可以实现夹流控制：继电器阵列可以灵活的进行电路的 切换：检测系统由a t 8 9 c 5 2 作为微控制器，采用串行接口电路进行数据通讯， 用高精度a d 转换器完成数据的采集。 该检测系统采用v b 6 0 软件开发了检测系统的控制软件，该控制软件能够进 行数据添加、删除、修改和保存。具有自动切换、倒计时、可进行l o 步程序设 置和分离电压与光电倍增管电压分别控制等功能。整个检测系统的尺寸为 2 4 2 m m 1 6 0 r a m 2 4 0 r a m ，质量为3 5 k g 。 使用该检测系统对样品进行了样品的夹流实验，证明了进入分离沟道中样品 的可控性：对f i t c 标记的精氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸混合物进行 了分离，分离电压2 5 0 v c m ，分离时间不到1 5 0 秒；在检测系统上对f i t c 标记 的四种氨基酸进行了四次重现性实验，其峰值面积、峰高以及迁移时间三个参数 的r s d 分别为4 7 ，2 2 和2 8 ，表明了该系统的可靠性。对g x l 7 4 h a e l i l d n a 和s a r s 病毒的p c r 扩增产物进行了电泳分离，实验结果表明在分离电压为 1 1 0 0 v 的情况下，大于1 0 个b p 的d n a 片段，该检测系统都能完成分离，具有 一定的实用性。 关键词：光纤、l e d 、p d m s 、检测系统、小型化 a b s t r a c t t h ef a b r i c a t i o no fd e t e c t i o ns y s t e mb a s e do rt h ei n t e g r a t e df i b e r c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p b os o ( p h y s i c a le l e c t r o n i c s ) d i r e c t e db yp r o f c u id a f u a b s t r a c t t h er e s e a r c ho nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o ns y s t e mn o wr e p r e s e n t st h ed e v e l o p i n g d i r e c t i o ni na n a l y s i si n s t r u m e n t sf i e l d t h ea n a l y s i ss y s t e mb a s e do nt h ei n t e g r a t e df i b e rc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sc h i pw h i c hc a l ld e t e c tt h eb i o c h e m i c a lm o l e c u l e sa n di o n s ，i sa ni n t e g r a t i v e p l a t f o r mf o rb i o c h e m i c a la n a l y s i sa n dh a sm u l t i p l ef u n c t i o n ss u c ha si n j e c t i o n ，s e p a r a t i o na n d d e t e c t i o ne t c t h ep a p e rp r e s e n t st h em i n i a t u r ed e t e c t i o ns y s t e m ，w h i c hi sc o r r e l a t i v ew i t ht h e i n t e g r a t e df i b e rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p t h er e s e a r c hc o n t e n t sc o n t a i nt h ep r i n c i p l e s t r u c t u r ea n da p p l i c a t i o ne x a m i n a t i o no f t h ed e t e c t i o ns y s t e m ， i nt h ed e t e c t i o ns y s t e m ，t h eb l u el e dw a su s e da st h ee x c i t i n gl i g h ts o u r c ea n dt h ep m tw a s u s e da st h eo p t o e l e c t r o n i cc o n v e r t e r t oa v o i dt h ei n t e r f e r e n c eo f s t r a yl i g h to u t s i d et h es y s t e m ，t h e s t r u c t u r eo f d o u b l ed a r k r o o mw a sa d o p t e d t h en o v e lf i b e rc o u p l e rm a d et h ee x p e r i m e n to p e r a t i o n e a s i l y f o u rh i g hv o l t a g ep o w e rs u p p l ym o d u l e sw e r eu s e di nt h ed e t e c t i o ns y s t e m ，a n dt h es a m p l e i nt h es e p a r a t i o nc h a n n e lc o u l db ec o n t r o l l e d t h er e l a ya r r a yw a su s e dt or e a l i z ec i r c u i ts w i t c h ； t h ea t 8 9 c 5 2w a su s e da st h em i c r o c o n t r o l l e rt oc o n t r o lt h ew o r ko fe v e r yc o m p o n e n ta n dt h e s e r i a li n t e r f a c ec i r c u i tw a su s e di nt l l ed a t at r a 币ca n dt h eh i g h - p r e c i s i o na d cw a su s e di nt h ed a t a a c q u i s i t i o n u s i n gt h ev i s u a lb a s i c6 0 ，t h ec o n t r o ls o f t w a r e ，w h i c hc a na d d ，d e l e t e ，m o d i f ya n d s a v et h ed a t aw a s p r e s e n t e d ，a n di th a st h ef u n c t i o n ss u c ha sa u t o m a t i cc i r c u i ts w i t c h ，c o u n td o w n ， 1 0p r o g r a ms e t t i n gs t e p sa n dt h es e p a r a t i o nv o l t a g e ，p m tv o l t a g ec a nb ec o n t r o l l e dr e s p e c t i v e l y t h es i z e ，m a s s ，r e s p o n s ea n ds e n s i t i v i t ya r e2 4 2 m m x1 6 0 m m x 2 4 0 m m ，2 5 k g ，r e s p e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n to f p i n c h e ds a m p l el o a d i n gw a si m p l e m e n t e di nt h ed e t e c t i o ns y s t e ma n dt h e p h e n o m e n o nt h a ts a m p l ec o u l d b ec o n t r o l l e di nt h es e p a r a t i o nc h a n n e lw a sp r o v e d am i x t u r eo f f o u ra m i n o a c i d s ( a i 譬i n i n e ，p h e n y l a l a n i n e ，g l y c i n ，a s p a r t i ca c i d ) l a b e l e d w i t hf l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( f l t c ) w a ss e p a r a t e di nt h ed e t e c t i o ns y s t e m ，t h es e p a r a t i o nv o l t a g ei s2 5 0 v e r a ， t h es e p a r a t i o nt i m ei sl e s st h a n1 5 0s e c o n d s t h er e p e a t e de x p e r i m e n to ff o u ra m i n oa c i d s i n d i c a t e dt h a tt h er s do ft h et h r e ep a r a m e t e r s ：p e a ka r e a ，p e a kh e i g h ta n dr e p e a t a b i l i t yo f t r a n s p o r tt i m ew e r e4 7 ，2 2 a n d2 8 ，a n dt h er e l i a b i l i t yo f t h ed e t e c t i o ns y s t e mw a sp r o v e d t h es e p a r a t i o ne x p e r i m e n to f t h e m i x t u r eo f o x l 7 4 h a e l l l d n a a n d t h e p c r p r o d u c t so f s a r s v i r u si n d i c a t e dt h a tt h ed e t e c t i o ns y s t e mc o u l ds e p a r a t ec o m p l e t e l yt h ed n a s e g m e n tn ol e s st h a n 1 0b pu n d e rt h ec o n d i t i o no fl l o o v k e y w o r d s ：f i b e r , l e d ，p d m s ，d e t e c t i o ns y s t e m ，f a b r i c a t i o n ，m i n i a t u r i z a t i o n i l 研究成果声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下 进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢 的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国科学院电子学研究所或其它教育机构的学位或 证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任 何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。 特此申明。 签名：芴放 日期：2 彩钮7 关于学位论文使用权的说明 本人完全了解中国科学院电子学研究所有关保留、使用学位论 文的规定，其中包括：电子所有权保管、并向有关部门送交学位论 文的原件与复印件；电子所可以采用影印、缩印或其他复制手段复 制并保存学位论文；电子所可允许学位论文被查阅或借阅；电子 所可以学术交流为目的，复制赠送和交换学位论文；电子所可以公 布学位论文的全部或部分内容( 保密学位论文在解密后遵守此规定) 。 签名：菇波日期：王口口f 点上甲 导师签名：乡纱灭钳日期：2 。哳f 上9 r 第一章绪论 第一章引言 1 1 电泳技术 1 1 1 电泳简介 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 最初是指带电荷凝胶粒子在直流电场中移动的现象，但低分子带电物质也有泳动 现象。实际上胶体的定义是比较含糊的，它与高分子多电解质难以截然划分。由 于这一技术发展很快，已广泛应用于蛋白质、氨基酸、核酸、嘌呤、嘧啶以及其 他有机化合物甚至无机离子等各领域，并且使用本质上相同的仪器和操作方法， 因此现在统一使用电泳这一名称。电泳不仅指这一现象，也是一种分离的方法或 技术。电泳就是分离和鉴定混合物中带电粒子( 包括离子、高分子多电解质、胶 体、病毒颗粒以至活得细胞如细菌和红细胞等) 的技术。 早在1 9 世纪初期，就已经发现胶体粒子有电泳现象，并用在胶体化学的研 究中。但在此后的1 0 0 多年时间内，进展缓慢。直到1 9 3 7 年，成功地进行纸电 泳以后，电泳技术才迅速发展并得到广泛应用。 1 8 0 9 年，俄国物理学家p e n c e 首次发现电泳。但是，电泳作为分离技术是 瑞典科学家t i s e l i u s 1 】在1 9 3 7 年首次提出的，他创造了t i s e l i u s 电泳仪，并建立 了移动界面电泳方法。由于他对电泳技术的发展和应用所做的杰出贡献，于1 9 4 8 年获得诺贝尔化学奖。 对高效毛细管电泳最具启发性的工作首推h i e r t e n ，他于1 9 6 7 年发表了一篇 讨论仪器的论文【2 1 。他最早提出用窄孑l 径管在高电场下进行自由溶液电泳，并用 内壁有甲基纤维素涂层、内径为3 m m 的石英玻璃管在慢速旋转下分离，用紫外 检测，成功地证实了他的设想。此仪器可用于无机和有机离子、多肽、蛋白质、 核酸、病毒和细菌的分离，能高精度测定淌度，亦可用于等电聚焦和等速电泳， 但操作麻烦。 1 9 7 9 年，m i k k e r s 和e v e r a e r t s 等【3 1 研究了毛细管区带电泳中的区带与背景电 场差异的理论问题，提出用毛细管来抑制对流并增强散热效果的方案。但该小组 在高效区带电泳方面的出色工作并未引起分离科学家的足够兴趣与注意。 集成光纤的毛细管电泳芯片检测系统的研制 1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 4 1 用7 5 u m 内径和l o o c m 的玻璃毛细管在3 0 k v 的高电压下进行电泳，获得了数十万理论板数的高分离效率，并阐明了其理论， 描述了操作条件与分离效率的关系，证明了毛细管电泳作为分析技术的先例，使 该技术有了突破性进展。 1 9 8 3 年，j o r g e n s o n 5 】进一步制备了内涂层毛细管，减少了对溶质的吸隧童。 h j e n e n t 6 1 首先将充聚丙烯酰胺凝胶毛细管用于毛细管电泳分离，发展了毛细管凝 胶电泳( c o e ) 。由于c g e 具有极高的分辨力，很快受到人们的青睐。c o h e n t 7 1 等 最先用c g e 分离了蛋白碎片。c g e 分离和l i f 检测相结合，成为d n a 快速序 列分析的优选方案【8 】。 1 9 8 4 年，t e r a b e l 9 1 等将离子型表面活性剂胶束引入毛细管电泳中，以胶束作 为分配相，使电中性物质可以通过在胶束相和水相的分配不同达到分离，从而发 展了毛细管电泳的新分支毛细管胶束电动色谱( m e c c ) ，提高了分离选择性， 扩大了毛细管电泳的应用范围。 1 9 8 5 年，h e r t e n 【1 0 1 等把传统的等电聚焦过程移到毛细管内进行，提出了毛 细管等电聚焦( c i e f l 。同年，c o h e n 和k a r g e r 发表了毛细管凝胶电泳( c g a ) 的研 究工作。 1 9 8 7 年，s m i t h 1 l 】等通过电喷射接口将质谱与毛细管电泳联用，获得有关样 品的分子结构信息。进步采用基体辅助激光解吸电离，质谱法，得到分子质量 高达1 9 0 0 0 0 d a 的生物大分子的准确分子量及其结构信息。 1 9 8 7 年，w a u i n g f b r d 和e w i n g t l 2 懈电化学方法引入毛细管电泳检测，并用 超微电极进行了单细胞的现场毛细管电泳分离和检测。 1 9 8 9 年，毛细管电泳商品仪器的问世及高灵敏度在柱检测器的发展，使毛 细管电泳研究在世界范围内蓬勃开展，促进了毛细管电泳技术和理论的迅猛发 展。毛细管电泳的最大优点是应用范围广，最初认为它主要用于生物大分子的分 析，现在已经证明它能用于氨基酸、维生素、农药、无机离子、有机酸、染料、 表面活性剂、肽和蛋白质、碳水化合物、低聚核苷和d n a 片断，甚至整个细胞 核病毒粒子的分离。 进入2 0 世纪9 0 年代后，a p p l i e db i o s y s t e m ，b e c k m a ni n c 。，b i o r a d ，c o l o r a , d i o n e x ，w a t e r s 和s p e c t r a p h y s i c s 等各大仪器公司分别推出不同型号、具有不同的 2 第一章绪论 检测器的毛细管电泳商品仪器。9 0 年代初，伴随着微型制造技术的发展，微型 毛细管电泳芯片”】的出现更被认为是毛细管电泳技术上的一大突破。 现在电泳技术已在无机化学、有机化学、生物化学、分子生物学、放射化学 和免疫化学等学科中成为各种带电物质的分离鉴定的重要手段，己成为在科研、 教学、工业、医药等领域常用的快速而又准确地分离分析方法。 近年来，毛细管电泳研究有了很大的进展，主要包括新的分离方法和理论研 究，高灵敏度检测器和检测方法研究，电渗流的控制和毛细管柱技术的研究，迁 移时间和峰面积的重现性以及定量分析方法的改进，在柱样品浓缩方法等诸多方 面的研究。 所有这一切都说明，毛细管电泳作为年轻的分离分析技术，正充满活力地飞 速发展着。而这个领域的飞速发展在基因组计划的完成和蛋白计划的实现中占据 着无法替代的地位，起着巨大的推动作用。 1 1 2 电泳的基本原理 电泳是电解质中带电粒子在电场作用下以不同速度向电荷相反方向迁移的 现象，利用这种现象对化学或生物化学组分进行分离分析的技术称之为电泳技 术。毛细管电泳是离子或带电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或和 分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。 电泳的基本概念相当简单，当一带电粒子置于电场中时，它受到一个正比于 它的有效电荷( g ) 和电场强度( e ) 的力( f ) 的作用： f = q e( 1 ) 在电场作用下带电粒子以速度( v ) 作平移运动，与此同时它又受到一个与其速度 成正比的粘滞阻力( f ) 的作用，即 f 7 = j i , ( 2 ) ，为比例常数：称为平动摩擦系数，与粒子的大小和形状有关。当这两个作用力 相对平衡时，f = f ，粒子以稳态速度( v ) 运动，于是： v 7 = q e l f( 3 ) 对于球形粒子，r 由s t o k e s 定律给出： 集成光纤的毛细管i 乜泳芯片榆测系统的研制 f = 6 聊 式( 4 ) 中啊为介质粘度，r 为表观液体动力学半径，因而公式( 3 ) 可写为 v = 业6 n r r ( 5 )、， 因为乞= q o - ，用带电粒子的z e t a 电势来表示，公式( 5 ) 成为： y = 堕6 n q e ( 6 ) 、， 对于棒状粒子： v = 堕4 n q e ( 7 )、， 由此可见，带电粒子在电场中的迁移速度，除了与电场强度和介电特性有关 外，k l i - 与粒子的有效电荷及其大小和形状有关。因此，粒子的大小和形状，以及 其有效电荷的差异，就构成了电泳分离的基础。 因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度( m o b i l i 咄) 而不用速度来描述带电粒子的电泳行为与特性。电泳淌度( ，) 定义为单位场强 下离子的平均电泳速度，即： 。2 v e( 8 ) 在毛细管中，电渗流( e l e c 叻o o 锄o t i c ，简称e o f ) 指的是体相溶液在外加电 场作用下整体朝一个方向运动的现象。e o f 的速度与电势有关。由熟知的 v o n s m o l u c h o w s k i 方程给出： ：一煎e( 9 ) 式中为真空介电常数。 类似于电泳，常用电渗流系数或电渗淌度( 。) 表示e o f 大小： = v 阳e( 1 0 ) 在毛细管电泳分离中，e o f 引起电解质溶液从毛细管的一端向另一端流动。 第一章绪论 在通常情况下，e o f 速度可用实验方法按下式计算： v 。= l t 。 ( 1 1 ) ，为毛细管的进样端口至检测窗口的长度，称为有效长度，t 。为电渗流标记物从 进样端迁移至检测窗口所需时间。 由公式( 9 ) 可见，影响e o f 速度的主要因素有电场强度、管壁的z e t a 电势和 溶液特性，而z e t a 电势受管壁材料及其特性和溶液性质的影响，因此，归纳起 来，影响e o f 的因素有电场强度、毛细管材料、溶液的p h 值、电解质溶液的成 分和浓度、添加剂、温度等。 一 图1 1 毛细管电泳示意图 图1 1 为电泳示意图，箭头代表电泳的方向。由图可见，在外加电场作用下， 带较多正电荷的质量较小的粒子电泳速度最快，以下依次为带较少正电荷的质量 较小的粒子、带较少负电荷的质量较小的粒子、带较多负电荷的质量较小的粒子 等。在管壁带负电的情况下，电渗流的方向是朝向阴极，反之则相反。 1 1 3 电泳的发展新动向 目前，国际上的电泳技术侧重于应用，但方法本身的完善和发展也同样热火 朝天。应用研究的内容是多方面的，其中最富特色者有蛋白质分离、糖分析、 d n a “ 测序、单细胞分析等。 方法发展同样也是多方面的，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。 般而言，新方法的发展研究难度大，而且可遇不可求，但近些年却有不小进展， 比如建立阵列毛细管电泳( c a e ) ，亲和毛细管电泳( a c e ) ，芯片式毛细管电泳( c c e ) 等。c c e 是一种微型化的超速( 秒级) 电泳技术，其研究可能会进一步展开。c a e 的当前目标是实现高速d n a 测序，同时也适合于其他大规模分析工作。 粲成光纤的毛钏管f 乜泳芯片检测系统的1 i j f 制 1 2 微流控电泳分析芯片 1 2 1 微全分析系统 微全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，ut a s ) 或称芯片实验室 f l a b o r a t o r y - o n - a - c h i p ，简称l o c ) 是一个跨学科的新领域，其目标是通过分析 化学、微机电加i ( m e m s ) 、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉 实现化学分析系统从试样处理到检测的整体化、自动化、集成化与便携化，也就 是把试样的采集、预处理、分离、反应、检测等部分集成在几平方厘米的面积内， 从而高效、快速地完成试样的分离、分析和检测。它不仅可使珍贵的生物试样与 试剂消耗大大降低到微升乃至纳升级，而且使分析速度成十倍百倍地提高，费用 成十倍、百倍地下降，从而为分析测试技术普及到千家万户，实现分析实验室的 “家庭化”、“个人化”创造了条件。 1 9 9 0 年，瑞士c i b r - g e i 删公司的m a n z 与w i d m c 一1 5 1 提出了微流控芯片型微全 分析系统，当时主要强调了分析系统的“微”与“全”，及微管道网络的m e m s 加工方法，而并未明确其外形特征。次年，m a n z 等在平板微芯片上实现了毛细 管电泳与流动注射分析，从而把微系统的主要构型定为一般厚度不超过5 毫米， 面积为数平方厘米至十几平方厘米的平板芯片1 6 】。1 9 9 4 年开始，美国橡树岭国家 实验室r 锄s 吖等【1 7 1 在m a n z 的工作基础上发表了一系列论文，改进了芯片毛细管 电泳的进样方法，提高了其性能与实用性，引起了更广泛地关注。1 9 9 5 年美国加 州大学b e r k e l e y 分校的m a t h i e s 等人n 8 】在微流控芯片上实现了高速d n a 澳t 序，微流 控芯片的商业开发价值开始显现，而此时微阵列型的生物芯片已进入实质性的商 品开发阶段。1 9 9 6 年m a t h i e s 等1 9 b ( 将基因分析中有重要意义的聚合酶链反应 ( p c r l 扩增与毛细管电泳集成在一起，展示了微全分析系统在试样处理方面的潜 力。19 9 8 年之后，些微流控芯片开发企业纷纷与世界著名分析仪器生产厂家合 作，利用各自的优势技术平台推出首台微流控分析仪器，1 9 9 9 年惠普c a l i p e r 联合研制的首台微流控芯片商品化仪器开始在欧美市场销售，其他几家厂商也逐 渐将其产品推向市场。 1 2 ，2 徽流控分析芯片 微流控分析( m i c r o f l u i d i c a n a l y s i s ) 是微全分析系统的主要组成部分，而将化 6 第一章绪论 学分析的多种功能集成在一寸见方大小的芯片上的微流控芯片( m i c r o f l u i d i c c h i p s ) 又是当前最活跃的发展前沿，代表着2 l 世纪分析仪器走向微型化、集成化 的发展方向，已成为国内外许多著名实验室的奋斗目标。微流控芯片是9 0 年代 初、中期主要在分析化学领域发展起来的，它以分析化学为基础，以微机电加工 技术为依托，以微观到网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当 前微型分析系统领域发展的重点。它的目标是把整个化验室的功能，包括采样、 稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，而且可多次使用。 微流控芯片的构造一般为平板材料，其中一片用微加工技术刻有细微通道 【2 0 1 ，然后两片平板覆合在一起，形成具有封闭通道的芯片，在任意一片上还有通 道的进出口。 其分析技术特点为：( 1 ) 系统中试样与试剂体积为p l n l ；( 2 ) 液体流动一 般为电场作用下的受控流动，但有时也辅以其他手段；( 3 ) 分析时间一般较短， 为秒级甚至毫秒级，可在很短的时间内完成诸如混合、分流、改变流动方向等复 杂的操作程序。 由于芯片面积很小，仅几平方厘米，通道尺度也为微米级，液体的总体积仅 为p l n l ，所以普通的液流驱动手段不适合于微流控系统，需要一些特殊的方法。 其中最常用的是在通道上施加电场，即通过通道两端电极施一电压，用因之产生 的电渗流及电迁移作液流的驱动手段，通过电场强度和方向的控制来灵活地对液 体流动的方向和速度进行自动化的控制，实现待测物的计量、混合、反应、分离 与转移，此外，也有采用微型的压力泵，注射泵等手段驱动液流。 1 2 3 微流控分析芯片的分类 微流控芯片主要以分析化学和分析生物学为基础，以微细加工技术为辅助， 将传统的生物( 化学) 的样品制备、生化反应、数据检测等几个步骤集合于一体， 缩小芯片上的实验系统。根据其所迸行的反应过程，可将其分成以下几类。 ( 1 ) 生物样品的制备芯片 目前，生物样品的芯片制备主要是指核酸( d n a ，r n a ) 的制备分析，其制 备过程经常要经过细胞分离、破胞等步骤，最终得到纯度较高的核酸，并进行分 析。生物的样品分析制备包括样品的制备，生物化学和分子生物学反应，结果检 测和数据处理等过程。将其中一个或几个步骤微型化集成到同一芯片上，就能获 集成光纤的毛细管电泳芯片检测系统的研制 得特殊功能的生物芯片。 ( 2 ) 毛细管电泳型生物芯片 芯片毛细管电泳法首先由杜邦公司的p a c e 开发出来的。他们在一个很小的单 晶硅片上刻蚀出类毛细管装置，用来进行d n a 序列分析。c e 是一种以高压电场 为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中组分的浓度和分配行为差异进行分 离的一种液相分离技术。但是传统毛细管动电进样不仅效率低，还对试样中的浓 度比较敏感，当阵列毛细管量大时，制作合格阵列毛细管的难度就加大了很多。 这些困难在微流控毛细管芯片上却得到了很好的解决。 ( 3 ) 聚合酶链反应( p c r ) 芯片 在芯片上进行p c r 反应，扩增核酸已经有成功的报道。美国宾夕尼亚大学的 小组成功地用水坝式微过滤芯片中直接分离获得的人体白细胞经过升温破胞后 释放的d n a 进行聚合酶链反应，这是世界首例将样品制备和聚合酶链反应集成 一体的研究成果。 1 2 ，4 微流控分析的发展趋势和存在的问题 微流控分析系统从以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液一液萃取、过 滤、无膜扩散等多种分离手段。其中多相层流分离微流控系统结构简单，有多种 分离工能，具有广泛的应用前剽2 ”。 微流控分析系统从以电渗流为主要液流驱动手段发展到流体动力、气压、重 力、离心力、剪切力等多种手段。例如，d u i t y 等t 2 2 】研究了以离心力驱动试样和 试剂的圆盘式微流控系统，同时实现4 8 个通道的酶法比色测定。 微流控分析系统从单道检测发展到多重平行检测，加州大学伯克利分校 m a t h i e s 的研究组在1 9 9 9 年提出了集9 6 个分离通道于一体的如c d 光盘的微流控阵 列毛细管芯片系统【2 3 】，用此芯片仅用2 分钟便平行测定t 9 6 个d n a 试样的片段。 微流控分丰厅系统从以激光诱导荧光及光度法为主要检 贝l i 器发展到多种检测 手段，如电化学、质谱、原于光谱、光声光谱、化学发光等。 微流控分析系统从分离检测发展为包括复杂试样前处理的高功能全分析系 统。m a n z 的研究组提出了聚合酶链反应( p c r ) 微流控芯片扩增反应器【2 4 1 。芯片上 的通道每个循环经过由三个加热铜块提供的p c r 变性、退火及延伸温区，总共循 环2 0 次。用此装置最快时9 0 秒后即可得到扩增的d n a 试样，不仅仪器体积缩小。 第一章绪论 减少了试样和试剂消耗，还提高了扩增速度。p c r 芯片还同时提供了与d n a 测序 芯片联用或集成化的可能性。w o o l l e y 等则使用一个集成在芯片微通道入口处的 可变温反应室进行p c r 扩增与毛细管电泳联用。反应物加入p c r 反应室后，计算 机控制反应室温度，2 5 3 0 秒完成一次扩增循环。扩增与分离全过程在2 0 分钟内 完成。 微流控分析系统从成分分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合 成手段，在新药物筛选中显示出强大的生命力。 微流控分析系统从一般成分分析发展为单分子、单细胞分析。最近g o s c h 等 1 2 5 1 在硅一玻璃微流控芯片上用共聚焦荧光显微技术检测了四甲基罗丹明标记的单 个分子。 微流控芯片从以玻璃基质为主要发展到玻璃与高分子聚合材料并重，尤其在 芯片的产业化方面，后者将更具备优势。 微流控分析系统开始从基础与应用基础研究阶段进入产业化及市场开发阶 段。9 9 年a g i l e n tt e c i l i l o l o 百e s 与c a l i p e rt e c l l l l 0 1 0 舀e s 联合推出的具有代表性的商 品化仪器b i o a n a l y z e r 2 1 0 0 测定d n a 的1 7 8 1 7 8 c m 芯片。其中间通道为毛细管电 泳分离通道，仅长约1 5 m m 。片上四个较大的孔为缓冲液及标准梯形条带试样池， 1 2 个较小的孔为试样池，分别通向分离通道并与之交叉。当每个液池同时插入电 极，并按一定次序通以高压或切断时，1 2 个试样按十字通道进样的相似原理，相 继注入分离通道，仅用2 0 多秒，d n a 片断即达到分离，并立即在通道终端用激 光诱导荧光法进行检测。全部1 2 个试样的测定约需3 0 分钟。芯片价值十几美元， 为一次性使用，测定1 2 个试样后即弃去。 微流控分析存在的问题是宏观试样与微芯片的衔接或接口问题，它对微流控 系统的实际应用与普及十分重要，但目前进样多采用手工完成，效率低下，可靠 性也较差。进样与换样的自动化、微型化、集成化势在必行【2 6 1 。 1 3 微流控芯片的检测方法 1 3 1 光学检测法 由于检测空间的尺寸非常小，灵敏的检测手段对于微流控芯片的使用是非常 重要的。激光诱导荧光检测法( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 1 2 7 】具有极高的 9 集成光纤的毛细管i u 泳芯片检测系统的研制 灵敏性，到目前为止，它是被最经常采用的检测法。最普通的应用于微流控芯片 的l i f 检测系统是共聚焦检测系统，m a t h i e s 和h u a n g 详细描述了这种方法，它 使用一个激发光源提供一个连续的、经过校准的光束，光束经过二色分光镜反射 进入一个多孔物镜中，物镜将激光汇聚成一束很窄的光束聚焦在微通道内荧光标 记物上，用来激发荧光。荧光标记物发射的荧光经过物镜的收集和校准，再由二 色分光镜返回。在这个方向，分光镜反射激光并使波长相对较长的荧光通过。一 个消除色差的透镜将光聚焦至一个空间滤光器的入口( 共聚焦孔道) ，这个空间 滤光器和显微镜的物镜是共聚焦的。只有来自于微流控芯片聚焦区域的光线才能 穿过微孔，这样，源自微流控芯片的表面的散射光和源自通道外的荧光被消除掉 了，增加了信噪比，构成一个高灵敏度的检测系统。经过空间滤光器的光线再被 导入至一个或几个检测器，如光电倍增管( p m t ) 或电荷耦合器件( c c d ) 等等。 可以将p m t 或c c d 的输出进行前置放大，数字化并输入计算机进行处理，最后 得到有用的信息。与单通道微流控芯片的情况相比，对阵列式微流控芯片进行 l i f 检测的难度更大。可以用激光器对微通道阵列进彳亍扫描，这样减少了任务循 环的次数，还可以使用持续光照的方法，但这减少了作用于单个微通道上的激光 光强度，并且这两种方法种都减小了信噪比。s i m p s o n 等构建了一个不很完善的 系统用于阵列式微流控芯片的检测，并在基因型检测中获得了验证，开发出实用 的阵列式微流控芯片l i f 检测系统仍旧是一个很大的挑战【2 s 】。 还有使用光吸收检测器对毛细管电泳微流控芯片进行检测的报道，但由于微 加工的通道有限的光路长度，严重影响了检测的灵敏度。由于检测稳定弱电流的 电子器件的发展，在传统的毛细管电泳检测中，检测精度已达到毫摩尔量级，光 路长度可达5 0 1 0 0 9 m 。为进一步改善微流控芯片上的检测灵敏度，b r u i n 在上面 加工出一个1 4 0 9 m 的u 型检测室，它能测出6 1 a m 量级的荧光素【2 9 1 ，为将这个 小室与一个u v 一可见吸收检测器集成在一起，l i a n g 等人在u 型检测室的两侧加 工出额外的两个通道用来放置光纤，用来将入射光导入检测室及将透射光导入光 学检测器 3 0 1 。 其它的光学检测法包括：化学发光、电化学发光、非荧光的光学检测法等。 1 3 ，2 电化学检测 虽然l i f 法能够提供分子水平的灵敏度，但对于微流控器件来说这样的系统 0 第一章绪论 体积有些太大了，减弱了由于器件微型化所带来的好处。解决这个问题的一个很 好的选择就是电化学检测法。当将电极加工到微芯片上后，会大大提高灵敏度， 同时大大降低反应时间。w o o l l e y 等人设计了集成有电化学检测器的d n a 分析 微流控芯片，电化学检测器是在分离通道3 0 u m 处的一个l o p m 宽的工作电极， 为了减小分离时所加的高压电场的影响，这里采用了柱后检测的模式，通过这种 非直接的检测模式，对o x l 7 4h a e l l i 的限制酶降解物进行了检测，检测精度可 达2 8 z m o l p ”。g a v i n 和e w i n g 为在微通道内进行连续电泳分离加工出一种阵列 式的电化学检测结构，它由在微通道的出口处的5 帅的空f f i ( 0 5 p m 宽，1 2 2 咖 长，0 2 u m 高) 内放置1 0 0 个铂微电极阵列组成，使用这种器件在神经递质分离 电化学检测应用中获得了成功f 3 2 】。 1 3 3 质谱检测 质谱( m a s ss p e c t r o s c o p y ，m s ) 在分析化学中是一个很有用的工具，它可以 完成分离，检测以及对许多组分的确认工作，如多肽和核酸等。使用一系列微型 电子喷射器件，可以成功地实现质谱与毛细管电泳的联用，最近，微流控芯片也 与电子喷射质谱( e s i m s 实现了联用，这些微流控器件是在没有任何电泳分 离的情况下利用电渗的原理将样品注入质谱的，而且还可以在微流控器件上放置 多种样品并进行自动分析。最近有报道利用气动喷雾器为电子喷射产生稳定的样 品流，这样就不需要难于加工和集成的电子喷射头了，并且整个器件的加工过程 只需一步刻蚀步骤就可以了。目前已经开发出用于蛋白质质谱分析的微流控系 统，它的样品流和数据分析完全由计算机进行控制，外加的高电压是用来产生电 渗推动液体流进入质谱的，在整个过程中并未进行电泳分离【3 3 】。 1 3 4 其它检测方法 其他应用于微流控芯片的检测方法包括莱曼光谱法( r a m a ns t e c t r o s c o p y ) 、 全息反射率检测法( h o l o g r a p h i cr e f i a c t i v ei n d e xd e t e c t i o n ) 、付里时变换分光计检 测法、电导检测等。p a t r i c k 等人通过莱曼光谱法对杀虫剂的微流控芯片进行了等 速电泳分离检测，他们使用一个2 w ，5 3 2 n m 的n d y v 0 4 的激光源产生莱曼光谱， 数据采集速度为2 - 5s p e c t r a s ，分辨率为8 c m ，使用的样品浓度为1 0 1 0 _ 7 m t 3 4 1 。 b u r g g r a f 等人设计组装了全息反射率检测器用于微流控毛细管电泳芯片，这种检 集成光纤的毛细管i u 泳芯片榆测系统的硼f 制 测器的测试结果并不能令人满意，但这种方法有可能成为通用的检测法 3 5 】。 1 4 微流控芯片的应用 一项新技术总是在不断应用的过程中变得愈来愈成熟的。目前的大部分关于 微流控芯片研究工作都是指向生命科学领域的应用，例如微流控芯片现已应用于 核酸，蛋白质及其它的各种类型的样品分析，商业化的微流控芯片产品的应用也 是集中在这个领域。 1 4 1 微流控芯片应用于核酸分析 核酸分析是微流控芯片的一个主要应用领域。到目前为止已经利用微流控芯 片进行了寡聚核苷酸、r n a 、基因型和d n a 分离、测序等方面的分析，这些分 析过程是非常迅速的，如对寡聚核苷酸进行分析只需不到一分钟的时间，d n a 测序的时问不到2 0 分钟。微流控芯片在商业上，如测试医学上重要的l o d 的基 因型及人类d n a 基因组测序中也已得到了应用。 微流控芯片被用来测定寡聚核苷酸( 1 0 2 5 b a s e ) 、限制性酶降解产物0 x 1 7 4 h a e l l id n a 或核糖体r n a 等。使用阵列型微流控芯片，在1 2 0 s 内，完成了从 7 0 到1 0 0 0 b p 的中x 1 7 4 h a e l i ld n a 片断的分离f 3 6 】。 通过微流控芯片进行基因型测试方面的应用最近发展得很快，这使得对于如 血色沉着病和肌肉发育不健全等遗传疾病有关的基因可进行快速的辨识，然后进 行遗传药理学方面的研究。1 9 9 7 年，w o o l l e y 等人使用毛细管阵列电泳微流控芯 片分析了来自于遗传性血色沉着病诊断的候选基因h l a h 基因的限制性酶降解 产物的标记物，他们使用平行放置的l i f 扫描器对嵌入式t h i a z o l eo r a n g e 染料标 记的1 2 种样品进行了分析【”1 ；s i m p s o n 等人使用一个l i f 扫描器，在一个具有 9 6 个样品池，4 8 条分析毛细管阵列电泳微流控芯片上，在不到8 分钟内，对9 6 种血色沉着病样品进行了分析。c h e n g 等人使用一个硅一玻璃微流控芯片对具有 特殊位点的专用于消除肌肉发育不健全疾病p c r 产物进行了分离 3 8 】。s c h m a l z i n g 等人使用一个具有2 。6 c m 长的单分离通道的微流控芯片，对荧光标记的c t i v p c r 样品( 1 0 c i ：c s f i p o ，t p o x ，t