（环境科学专业论文）中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究.pdf

中国近海典型赤潮乍物细胞表面蛋白质组研究 条件下，虽然细胞表面蛋白的总量和蛋白点数明显减少，但也出现了一些新 的蛋白质点( a c l n l 、a c l n 2 、a c l n 3 、a c l n 4 、a c l n 5 和a c l n 6 ) 。这 些新出现的蛋白质点反映了藻细胞表面对营养变动的一种响应，可将这些新 出现的蛋白点作为细胞对环境营养物质变动的一种生物标志物一营养指示蛋 白； 4 应用已制备的铵载体抗体结合细胞表面免疫荧光标记技术，研究了链状亚历 山大藻细胞中铵载体在不同氮培养条件下的表达。结果表明，在氮限制条件 下，铵载体表达明显，而在其他氮营养条件下，铵载体表达不明显，因而铵 载体可作为链状亚历山大藻细胞氮限制的一种指示。 关键词：赤潮生物，细胞表面蛋白质组，蛋白质组技术，免疫荧光，生物质谱 i i 中国近海典型赤潮，f 物细胞表面蛋白质组研究 a b s t r a c t p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s el ua n da l e x a n d r i u mc a t e n e l l aa r et w ok e yh a r m f u l a l g a lb l o o m ( n a b ) s p e c i e sw i d e l ys p r e a da l o n gt h ec h i n as e ac o a s t a lw a t e r s t h i s t w oh a bs p e c i e sh a v ef o r m e de x t e n s i v eb l o m m si nt h ec o a s to ft h ec h i n as e ai nt h e p a s tf e wy e a r s ，a n db e c o m eo fe c o n o m i ca n dp u b l i cc o n c e md u et oi t si m p a c to nt h e m a r i n ee c o s y s t e m , a q u a c u l t u r ea n dp u b l i ch e a l t h t h i ss t u d yi n v e s t i g a t e dt h ec e l l s u r f a c ep r o t e o m eo ft h i st w oh a bs p e c i e su s i n gi m m u n o f l u o r e s e e n c e ，m o r d e n p r o t e o m i c ，i m m u n o p r o t e o m i ca p p r o a c h e st o g e t h e r 、) l ，i t l lm a s ss p e c t r o m e t r y , r a i s e dt h e l l i g hs p e c i f i ca n t i s e r at oc e l l s u r f a c ep r o t e i n s ，i s o l a t e da n di d e n t i f i e dc e l ls u r f a c e p r o t e i n s ，a n dc h a r a c t e r i z e dt h e s ep r o t e i n su s i n gm a l d i - t o f - t o fm a s ss p e c t r o m e t r y t h i ss t u d ya l s oi n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fn i t r o g e nn u t r i e n to nc e l ls u r f a c ep r o t e o m e t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g s ： 1 r a i s e dt h eh i ：曲s p e c i f i ca n t e r i s aa g a i n s tt h ec e l ls u r f a c ep r o t e i n su s i n go 5 p f a f i x e dw h o l ec e l l ( w c ) a sa na n t i g e n , t h et i t e r so ft h ea n t i s e r aw e r e1 ：2 0 0 0f o ra c a t e n e l l aa n d1 ：5 0 0 0f o r 只d o n g h a i e n s er e s p e c t i v e l y ；d e v e l o p e da n do p t i m i z e d t h ed e t e c t i o nm e t h o db a s e do ni m m u n o f l u o r s c e n c e ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e a n t i s e r u ma g a i n s tpd o n g h a i e n s ee x h i b i t e dh i 。g hs p e c i e ss p e c i f i c i t ya n dd i dn o t r e a c t e dw i 廿ls p e c i e so rs t r a i n sw i t h i nt h es a m eg e n u so ro t h e rp h y t o p l a n k t o n s p e c i e s ，w h i l et h ea n t i s e r u ma g a i n s ta c a t e n e l l ae x h i b i t e dc o r s sr e a c t i o n s 、) l ，i t h o t h e ra l e x a n d r i u ms p e c i e so rs t r a i n s ； 2 i s o l a t e da n di d e n t i f i e dc e l ls u r f a c ep r o t e i n so fpd o n g h a i e n s ea n da c a t e n e l l a u s i n gi m m u n o f l u r e s c e n c ea n di m m u n o p r o t e o m i ca p p r o a c h ，a n dc h a r a c t e r i z e dc e l l s u r f a c ep r o t e i n so fa c a t e n e l l au s i n gm a s ss p e c t r o m e t r y t h er e s u l t sf r o m i m m u n o f l u o r e s c e n c ei n d i c a t e dt h a tt h ea n t e r i s ar a i s e da g a i n s tt h ew h o l ec e l l e x h i b i t e dh i g hs p e c i f i c i t yw h i c h o n l yr e a c t e d 、析t l lc e l ls u r f a c ep r o t e i n sa n d d i dn o t r e a c t e d 、i t l lc y t o p l a s m i cm e m b r a n ep r o t e i n sa n dc y t o s o l i cp r o t e i n s ；5 8a n d12 3 c e l ls u r f a c ep r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e di npd o n g h a i e n s ea n da c a t e n e l l a r e s p e c t i v e l yu s i n g2 - da n dw e s t e r n b l o tm e t h o d s ，w h i c hc o n t r i b u t e d19 1 a n d 6 7 6 o ft o t a lt h e c a l p r o t e i n s u s i n gp e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g a n d i i i 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 s e q u e n c e - d a t a b a s ea n a l y s i s ，t o t a l l y , 4 5p r o t e i n so f a c a t e n e l l aw e r ec h a r a c t e r i z e d ， a m o n go ft h e m ，12p r o t e i n sw e r en u t r i e n ta b s o r b i n ga n dt r a n s p o r t i n g b i n d i n g p r o t e i n s ，1 0p r o t e i n sw e r ef l a g e l l a rr e l a t e dp r o t e i n s ，4p r o t e i n sw e r ec e l lw a l l p r o t e c t i n gp r o t e i n s ，3p r o t e i n sw e r es i g n a l i n gp r o t e i n s ，2p r o t e i n sw e r es t r e s s p r o t e i n sa n do t h e r14f u n c t i o n a lp r o t e i n s ； 3 c o m p a r a t i v es t u d i e dt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s t i o no fc e l ls u r f a c ep r o t e o m eo fa c a t e n e l l ag r o w ni nv a r i o u sn i t r o g e nn u t r i e n tc o n d i t i o n su s i n g2 一dm e t h o d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt w on e wp r o t e i n s ( a c u r la n da c u r 2 ) a p p e a r e di nt h e p r o t e i np r o f i l e so fa c a t e n e l l ag r o w ni nu r e aa sn i t r o g e ns o u r c e ，a n dag r o u po f p r o t e i n s ( a c n h g1 ) a n do n ep r o t e i n ( a c n h1 ) a p p e a r e di nt h ep r o t e i np r o f i l e so f a c a t e n e l l ag r o w ni na m m o n i u m 髂n i t r o g e ns o u r c ec o m p a r e dt on i t r a t e 鹤 n i t r o g e ns o u r c e u n d e rn i t r o g e nl i m i t a t i o n , t h ea m o u n ta n dp r o t e i ns p o t s d e c r e a s e da p p a r e n t l yb u taf e wn e wp r o t e i n s ( a c l ni 、a c l n 2 、a c l n 3 、 a c l n 4 、a c l n 5a n da c l n 6 ) a p p e a r e d t h e s ep r o t e i n sr e f l e c t e dt h er e s p o n s eo f c e l ls u r f a c et on u t r i e n tv a r i a t i o na n dt h e s en e wp r o t e i n s m i g h tb eu s e d a s i n d i c a t o t r so fc e l l st on u t r i e n tv a r i a t i o n - n u t i e n ti n d i c a t o rp r o t e i n s ； 4 i n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o no fa m m o n i u mt r a n s p o r t o ro fa c a t e n e l l ag r o w ni n d i f f e r e n t n i t r o g e n n u t r i e n t s u s i n g a m m o n i u m t r a n s p o r t o ra n t i b o d y a n d i m m u n o f l u o r e s c e n c e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fa m m o n i u m t r a n s p o r t o rw e r eh i g h e ru n d e rn i t r o g e nl i m i t a t i o nw h i l et h ee x p r e s s i o no f a m m o n i u m t r a n s p o r t o rw a sn o ta p p a r e n tu n d e ro t h e rn i t r o g e nn u t r i e n tc o n d i t i o n s a m m o n i u mt m n s p o r t o rc o u l db eu s e da s n i t r o g e n l i m i t i o ni n d i c a t o ro fa c a r e n e l l a k e yw o r d s ：h a r m f u la l g a e ，c e l ls u r f a c ep r o t e o m e ，p r o t e o m i c ， i m m u n o f l u o r e s c e n c e ，m a s ss p e c t r o m e t r y i v 中国近海典裂赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 缩略词表 英文缩写 a p s b s a c d t a e d t a d t t h r p h a b m a i d it o f1 的l f p f a p m f p b s 劂 w c c s w c a 2 d e s d s 中文名称 过硫酸铵 牛血清蛋白 1 , 2 环已二胺四乙酸 乙二胺四乙酸 二硫苏糖醇 辣根过氧化物酶 有害赤潮 飞行质谱一质谱联用 多聚甲醛 肽指纹图谱 磷酸缓冲液 三氟乙酸 细胞( 质) 内蛋白 全细胞表面抗原 双向电泳 十二烷基磺酸钠 v 中国近海典裂赤潮，e 物细胞表面蛋白质组研究，一 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人 易年岁月e t 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 l 、保密( 4 ) ，在2 年解密后适用本授权书。 2 、不保密() ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 作者签名期：撕1 年啁6 日 锄虢互久矽期：砂k 轳岛 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 第一章绪论 赤潮泛指由于海洋浮游生物( 主要是甲藻类) 的过度繁殖造成海水变色的现 象( 齐雨藻，2 0 0 3 ) 。它原本是一种正常的自然现象，但近半个世纪来，由于人 类工业化进程的加快，沿海富营养化的加剧，赤潮的发生频率、强度、地理分布 和有害( 毒) 赤潮藻种类等急剧增加，有害赤潮已成为一个全球性的环境和健康 问题。赤潮不仅直接影响到海洋生态系统的稳定、海洋生物资源的可持续利用、 水产养殖业和海洋产业等的健康发展，对人类健康甚至生命也构成了严重威胁 ( 周名江等，2 0 0 1 ；l a n d s b e r ge ta l ，2 0 0 2 ) 。 在引发赤潮的诸多种类中，甲藻是目前形成赤潮的最主要种。据报道，能形 成赤潮的甲藻有9 3 - 1 2 7 种，而且由于很多甲藻( 4 5 - 5 7 种) 能生产毒素，这些 毒素对生物和人类具有致毒甚全致死作用，因而甲藻赤潮成为当前危害最大、研 究最多的一类赤潮( 齐雨藻，2 0 0 3 ) 。在过去的半个多世纪，围绕有害甲藻赤潮 开展了大量的工作，对甲藻赤潮形成的生态学和海洋学机制都有了一定程度的认 识，在有害赤潮生物的生物学、生理学和生态学等方面都取得了丰硕的成果。但 由于甲藻特殊的进化地位( 间核生物) 、生活习性( 运动性) 、庞大的基因组( 约 为人类的5 0 倍) 和全球甲藻基因库的缺乏，以及研究方法和技术手段的限制， 目前我们对甲藻的了解还非常有限，对甲藻的一些基本的生命活动规律还不是很 清楚，这在一定程度上也阻碍了我们对甲藻赤潮发生机理的研究( 梁松等，2 0 0 0 ； 周名江等，2 0 0 1 ；俞志明等，2 0 0 2 ) 。 在过去的诸多研究中，人们更多地关注于赤潮生物与环境因子的相互作用， 更多地是从种群和细胞的层面上去探讨赤潮形成的可能原因( 邹景忠等，1 9 8 3 ) ， 很少从分子水平上去探讨赤潮发生的内部机制。甲藻细胞壁是将甲藻细胞与外界 环境隔离的一道屏障，它不仅对细胞起到保护作用，也是甲藻细胞进行各种生命 活动的重要界面，但目前我们对甲藻细胞壁的了解还非常有限。一些研究已显示， 甲藻细胞表面存在一些具有重要生理功能的蛋白，如与营养盐吸收相关的酶和跨 膜运输蛋白( 转运蛋白) 、信号传导蛋白等等( k u s t u ，2 0 0 6 ；w i l h e l m ，2 0 0 6 ) ， 因而开展甲藻细胞表面蛋白质组研究非常必要，将有助于我们对赤潮的认识，可 能对揭示赤潮生物重要生命活动和赤潮发生机理有重大的理论意义。 s 中因近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 1 1 赤潮生物细胞表面蛋白研究进展 在过去的很长一段时间内，人们一直认为细胞壁是一个无生命的结构，对细 胞主要起保护作用。但随着研究的4 、= 断深入和新的研究方法和技术的出现，一些 具有重要生理功能的蛋白质和酶陆续在一些植物及藻类细胞壁中被发现，细胞壁 结构和功能研究受到了人们的重视。 1 1 1 甲藻细胞壳( 壁) 结构 在海洋中，甲藻是一类特殊的生物，它界于原核和真核生物之间，也被称为 介核生物，既保留了原核生物的一些特性，也具备真核生物的一些特性。研究表 明，大多数甲藻细胞具有壳( 壁) ，也有一些种类裸露，无壳。目前对甲藻细胞 壁的细微结构已进行了较多的研究。甲藻细胞表面常有一层由原生质体分泌形成 的相当坚实的表质膜，细胞壁有或无，壁薄或厚而硬( 齐雨藻等，2 0 0 3 ) 。细胞 壳、壁是甲藻细胞直接与外环境接触的结构，它在藻细胞生理上起着重要的作用 ( m o r r i l l ，1 9 8 4 ) 。甲藻细胞壳壁由外到内分别是外壁膜( o u t e r m o s tm e m b r a n e ) 、 外膜( o u t e rp l a t em e m b r a n e ) 、壳壁纤维( t h e c a lv e s i c l e ) 、壳壁( t h e c a lp l a t e ) 、 周质空间( p e l l i c u l a rl a y e r ) 和质膜( c y t o p l a s m i cm e m b r a n e ) ( m o r r i l le ta 1 ，19 8 4 ) 。 甲藻细胞壳壁中包含有初生纤维素、多糖和蛋白( 齐雨藻等，2 0 0 3 ) 。细胞壳壁 上的外壁膜上的蛋白即为甲藻的细胞表面蛋白。 图1 1 典型赤潮藻( 甲藻) 细胞壳壁结构示意图 f i g1 1s c h e m m i cd i a g r a mo ft h ea m p h i e s m ao fat y p i c a lt h e c a t ed i n o f l a g e l l a t eb a s e d o nm o r r i l la n dl o e b l i c h 6 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 1 1 2 细胞表面蛋白研究方法 在过去的二十年，由于新技术和新方法的不断涌现，为生物细胞表面( 细 胞壁和细胞膜) 蛋白研究提供了技术支持，一些研究细胞表面蛋白的方法也不断 地被发展建立起来，并用于细胞表面蛋白研究。主要研究方法如下： ( 1 ) 细胞表面蛋白顺序提取方法。该方法最早是由r o b e r t s o n 等人( 1 9 9 7 ) 建立，主要用于植物细胞壁蛋白的提取。其原理是根据细胞表面蛋白溶解特性差 异，采用四种化学试剂顺序提取：首先用氯化钙( c a c l 2 ) 提取细胞表面弱结合 蛋白，随后使用l ，2 环已二胺四乙酸( c d t a ) 来抽提细胞壁上与胶体结合的细 胞表面蛋白，再通过二硫苏糖醇( d t t ) 调节蛋白间的二硫键以及用氯化钠( n a c l ) 来提取强离子结合的蛋白，最后通过硼酸盐破坏糖蛋白和其它糖类之间的结合 键，以便于释放出细胞壁蛋白。通过这几种化学试剂顺序提取，可成功地从植物 细胞壁中提取细胞壁蛋白而基本不破坏植物细胞结构( r o b e r t s o n ，1 9 9 7 ) 。这种方 法已广泛用于高等植物及一些藻类细胞壁或细胞表面蛋白的研究，但也存在一些 缺点，如提取过程比较烦琐、提取物中离子含量高以及细胞破碎引起的胞内蛋白 污染等； ( 2 ) 荧光标记技术。该技术主要利用荧光或化学发光物质，如f i t c 标记 细胞表面蛋白，或利用酶与底物的相互作用，如e l f 方法，在荧光显微镜下观 察荧光强度或用s d s p a g e 的方法检测化学发光( h u a n ge ta l ，2 0 0 5 ) 。目前这种 方法已用于细胞表面蛋白的检测。该方法的缺点是只能提供细胞表面总荧光强度 或某个蛋白质的检测，不能反映细胞表面蛋白真正组成或对其功能进行研究； ( 3 ) 细胞表面免疫荧光技术。其原理是利用赤潮生物细胞表面存在的蛋白 抗原，制备对应的抗体血清。利用抗体抗原结合反应，在抗体上标记f i t c 等荧 光物质从而使得能在荧光显微镜下观测到荧光。该技术已广泛应用于有害赤潮生 物的检测( c 6 r d o v ae ta l ，2 0 0 2 ；l o p e z - r o d a s ，19 9 9 ；a n d e r s o ne ta l ，19 9 0 ；a n d e r s o n e ta l ，1 9 9 5 ；m e n d o z ae ta l ，1 9 9 5 ) ，但该技术也只能反映细胞表面蛋白的总荧光强 度，不能对细胞表面蛋白进行深入细致的研究，需与其他方法，如w e s t e m b l o t 的方法结合才能用于细胞表面蛋白的研究； ( 4 ) 放射性同位素示踪方法。这是b e r t o m e n 等( 2 0 0 3 ) 报道的一种方法， 他们应用放射性的1 2 5 i 标记细胞表面蛋白，证实了一种分子量大小为4 3 k d a ，p i 7 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 值为8 5 左右的细胞表面蛋白。因为1 2 5 i 不能穿过细胞质膜，所以它只能标记细 胞质膜以外的蛋白。同时b e r t o m e n 等也论证了应用该技术发现的蛋白为细胞表 面蛋白。该技术由于涉及到同位素的检测，因而在使用方面受到一定的限制，但 它为我们研究并确认细胞表面蛋白提供了一个种方法手段； ( 5 ) 蛋白质组技术。这是近年来发展起来的一门新技术。利用现代蛋白质 组学研究方法和技术，采用机械或化学的方法分离细胞表面蛋白，通过双向电泳 和质谱技术对表面蛋白进行分离鉴定。目前这种方法广泛用于细胞表面蛋白的研 究( h u a n ge ta l ，2 0 0 2 ，2 0 0 4 ) ，由于采用化学或机械的分离方法，因而在样品准 备时常被一些非细胞表面蛋白所污染。目前一种结合荧光标志的新方法一荧光差 异凝胶电泳法( 2 d ed i g e ) 已用于细胞表面蛋白的研究。该原理是利用荧光标 记的方法，对细胞表面蛋白先进行标记，后用另外一种荧光标记全细胞，比较其 差异，确认细胞表面蛋白。该方法灵敏、可靠，可作为细胞表面蛋白研究的一个 新方法； ( 5 ) 免疫蛋白质组技术。该方法首先需制备细胞表面抗体，再结合蛋白双 向电泳技术和w e s t e m b l o t 方法，对细胞表面蛋白进行鉴定。k o m i l o v s 等( 2 0 0 2 ) 应用该技术研究了h e l i c o b a c t e rp u l l o r u m 、h e l i c o b a c t e rb i l l s 和h e l i c o b a c t e r h e p a t i c u s 的细胞表面蛋白，并分析了该三种株间的细胞表面差异点。 尽管上述方法已用于细胞表面蛋白的研究，但这些方法或存在样品准备的 局限性，或方法尚未成熟，需要进一步完善。 1 1 3 赤潮生物细胞表面蛋白研究进展 目前对赤潮生物细胞表面蛋白的研究相对较少，有限的研究主要集中在其他 一些种类的浮游植物，包括以下几个方面：( 1 ) 碱性磷酸酶为代表的胞外酶的研 究；( 2 ) 细胞表面与营养盐吸收相关的酶与转运蛋白；( 3 ) 细胞表面一些其他重 要生理功能蛋白，如信号传导蛋白。 相对而言，目前研究较多的是赤潮生物胞外酶。在赤潮生物细胞表面和水体 中存在大量的胞外酶，这些酶分解水体中以高分子聚合物( 分子量 1 5 0 0 d a ) 形 式存在的有机物，使得这些高分子聚合物分解成为穿过细胞质膜而被吸收利用的 小分子物质( 大约为6 0 0 d a 或更小) ( a m o s t ie ta l ，2 0 0 0 ；k o n o p k ae ta l ，2 0 0 2 ) 。 8 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质纽研究 胞外酶研究对揭示赤潮发生机制具有重要的意义。目前该领域已成为海洋生态学 的研究热点，赤潮生物细胞表面的胞外酶的研究也多有报导( b i l l e ne ta l ，1 9 9 1 ： b o c t i u sc ta l ，19 9 4 ：f e l l e re ta l ，19 9 6 ：h o p p ee ta l ，19 9 9 ：h u a n ge ta l ，19 9 9 ) 在赤潮形成过程中，赤潮生物和环境因子相互作用的结果，使得某一种或几 种藻类能够通过竞争淘汰其它藻类成为优势种，这是某些特殊的条件决定了赤潮 生物的优势地位( r i e g m a ne ta l ，2 0 0 0 ) 。如在磷限制的条件下，赫氏藻( e m i l i a n i a h u x l e y i ) 是一种能成为群落的唯一优势种并形成大面积赤潮的藻类( g a y o s o ， 1 9 9 5 ) 。r i e g m a n 等( 2 0 0 1 ) 的研究结果表明，赫氏藻的碱性磷酸酶的活性在研 究的几种藻类中最高。因此，一些学者认为，赤潮生物可能在胞外酶的活性上占 有某些生态位上的优势，使得赤潮生物在同样受限的条件下，能够竞争过其它的 藻类，成为优势种( r i e g m a ne ta l ，2 0 0 0 ) 。 最新的研究发现，藻类细胞表面存在大量的与n h 3 、c o z 、n h 4 、n 0 3 。、n 0 2 等转运相关的蛋白。k u s t u 等( 2 0 0 6 ) 在他们的研究中发现了并认证了在绿藻 c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i 细胞表面存在氨气载体( k u s t u c ta 1 2 0 0 6 ) 。w i l h e l m 等( 2 0 0 6 ) 也研究了硅藻与绿藻细胞表面的铵载体的调节机制的差异性( w i l h e l m e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。n a g o r e 等( 2 0 0 6 ) 的研究也发现蓝藻s y n e c h o c o c c u se l o n g a t u s 细胞 表面存在硝酸盐和亚硝酸盐的转运蛋白( n a g o r e e ta 1 2 0 0 6 ) 。 k u s t u 等和w i l h e l m 等在它们的研究中发现了硅藻和绿藻细胞表面都存在二 氧化碳浓缩蛋白( c a r b o nd i o x i d ec o n c e n t r a t i n gm e c h a n i s mp r o t e i n ) ( k u s t uc ta l ， 2 0 0 6 ；w i l h e l me ta 1 2 0 0 6 ) 。该结果证明藻细胞表面蛋白不仅能吸收环境中的营 养盐也能转运如二氧化碳一样的气体物质。通过该蛋白，藻类不仅可吸收溶解的 无机碳，如碳酸根或碳酸氢根离子，也可高效利用海水中溶解的二氧化碳，以满 足细胞光合作用对碳源的需求。 现有的一些研究证明，赤潮藻细胞生理生态变化的一些适应机制与细胞表面 蛋白存在一定的相关性。研究认为d i c t y c o s t e l i u md i s c o i d e u m 细胞表面蛋白中有 能根接收外部环境改变传导的信号通道蛋白( w e s te ta l ，2 0 0 2 ) 。因此在赤潮藻细 胞中很可能也会存在大量的与信号传递相关的信号通道蛋白。某些特殊的蛋白如 高亲和性的转运蛋白( t a m a ie ta l ，1 9 9 5 ：s h i m o g a w a r ae ta l ，1 9 9 5 ) 、结合蛋白 ( s c a n l a ne ta l ，1 9 9 3 ) 以及胞外酶( c e m b e l l ae ta l ，1 9 8 4 ) 都能在外部营养盐或者 9 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 其它环境胁迫下，在微生物和高等植物的细胞表面大量表达。而藻细胞表面结构 与高等植物有众多相似之处，因此，这些蛋白很可能在营养盐限制或者其它条件 诱导下在赤潮藻细胞表面也会表达。另外，以甲藻为典型的海洋浮游植物自身化 学发光作用，对应的藻的刺激反应机制被认为可能是与细胞表面蛋白有关( i g g l e y e ta l ，1 9 6 9 ；b l a s e re ta l ，2 0 0 2 ) 。这一刺激机制目前还没有完全研究清楚，但是 研究者认为细胞表面蛋白的改变可以作为细胞感受外界信号传导机制 ( m a l l i p a t t u e ta 1 2 0 0 2 ) 。另外，研究者认为一些机械感受器也存在于许多的藻 细胞表面之中( d a v i e se ta l ，1 9 9 5 ；p e r o z oe ta l ，2 0 0 2 ) 。 与藻类细胞表面蛋白相关的研究还包括：l o p e z - r o d a s ( 1 9 9 9 ) ，a n d e r s o n 等 ( 1 9 9 0 ，1 9 9 5 ) 应用将藻细胞表面蛋白作为各藻细胞的标志物制备成全细胞多克 隆抗原，将产生的多克隆抗体血清应用于赤潮藻识别研究。m e n d o z a 等( 1 9 9 5 ) 将多克隆的抗体血清，通过藻细胞表面蛋白抗原抗体结合后，研制较为特异的抗 体血清，识别藻特异的标志蛋白从而识别藻的种类。 综上所述，针对赤潮生物细胞表面蛋白的研究还非常少，对它的组成和作用 几乎还一无所知。但已有的研究都显示，细胞表面蛋白在赤潮生物的生命活动中 占有极其重要的地位，非常有必要对其进行深入而细致的研究。 1 1 。4 赤潮生物蛋白质组学研究进展 蛋白质组是近十年来才发展起来的一门新学科，它是后基因组时代的产物 ( w i l l i a m s ，1 9 9 6 ；甄朱，2 0 0 1 ；杨何义，2 0 0 2 ) ，以双向电泳技术、液相色谱技 术和生物质谱技术等为研究手段，研究全基因组在某个细胞或组织中某个特定条 件下所表达的全部蛋白质为研究对象，对蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用 进行研究，以揭示生命的本质( 成海平，2 0 0 0 ；李林，2 0 0 0 ) 。由于蛋白质组学可 以一次分析数以万千计的蛋白质点，在比较不同处理间蛋白质表达差异上拥有无 以比拟的优势。因此，蛋白质组学研究成为当前全球性的一个研究热点，己广泛 深入到自然科学研究的各个领域，特别是在生物和医学领域。许多国家都将其作 为优先发展的领域列入国家研究计划，以占据这一领域的制高点。 近年来，蛋白质组概念和技术也己应用到有害赤潮研究领域。香港学者c h a n 及其合作者( 2 0 0 2 ，2 0 0 4 ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 将蛋白质组学概念和技术首先应用到有 1 0 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 害赤潮研究，取得一系列创新性成果，开辟了有害赤潮蛋白质组学这一新领域。 目前蛋白质组技术应用在赤潮科学的研究包括：( 1 ) 将双向电泳( 2 d e ) 技术 应用到有害赤潮分类学的研究，将其作为分类学的重要方法，寻找种间特异性生 物标志物一种间指示蛋白。c h a r t 等( 2 0 0 2 ；2 0 0 4 ) 应用双向电泳技术分析了赤潮 藻p r o c e n t r u mt r i e s t i n u m 、p m i c a n sp m i n i m u m p s i g m o i d s p d e n t a t u m s c r i p p s i e l l at r o c h o i d e ak a r e n i al o n g i c a n a l i sk d t g i t a t ak m i k i m o t o i 以及美国分离 的一株k b r e v i s ( f l o r i d a , u s a ) 双向电泳蛋白的表达差异。结果显示在相同的生长 环境下无壳壁的甲藻蛋白质表达点数和分布的区域明显少于有壳壁的甲藻细胞， 也有一些相同的蛋白点同时在有壳壁和无壳壁的藻株内表达，有相当多的蛋白点 是唯一分布在特定的甲藻中，这些种间特异蛋白可作为赤潮生物分类的一类生物 标志物，特别是对一些疑难种的鉴定方面( c h a ne l ；a 1 。2 0 0 2 ：c h a r te ta l2 0 0 4 ) 。 c h a n 等( 2 0 0 5 ) 也应用蛋白质组图谱识别混合样品中甲藻的种类，并试图将 该技术应用在全球水平上对藻进行识别。该技术不仅能识别不同属、也能识别到 同属的不同种。c h a r t 等( 2 0 0 5 ) 分析了从香港水域和东海海域分离的锯齿原甲藻 ( p d e n t a t u m ) 的蛋白质图谱，结果显示不同地域分离的同种藻其蛋白质组有存 在差异的表达。这一结果证明，藻细胞随着环境变更，外部环境胁迫强烈影响着 它们基因的表达，表明藻细胞内的蛋白组是动态性的、敏感的，微小的环境变化 如同营养盐水平、一些其它环境刺激都会影响藻的细胞蛋白质组。c h a r t 等( 2 0 0 5 ) 认为双向电泳技术可以作用为分类学的一个重要的技术方法。 ( 2 ) 赤潮产毒机理的研究。c h a r t 等( 2 0 0 4 ) 应用2 d 技术分析了形态相似的 两株微小亚历山大藻，其中一株为产毒株，另外一株不产毒。2 d 可以较为清楚 区分到两株赤潮藻在双向电泳图上p i 为4 8 5 3 间和分之量大小为1 7 5 k 2 1 5 k 之 间存在差异蛋白。在其分析论证后鉴定了t 1 ，t 2 两个蛋白是与毒素合成相关的 蛋白。因此，c h a r t 等( 2 0 0 4 ) 认为可以将t l ，t 2 作为含有麻痹性贝毒毒素亚历 山大藻的指示蛋白。 目前有关赤潮生物细胞表面蛋白质组研究尚未有报道。近来在其他一些海 洋微藻中已开展了一些工作。h u a n g 等( 2 0 0 2 ，2 0 0 4 ) 研究了蓝藻s y n e c h o c y s t i s 6 8 0 3 的细胞表面蛋白质组，通过质谱技术也鉴定了其中的5 7 个蛋白点，其中有 四个蛋白为运动相关蛋白，一些与营养物质转运相关的蛋白。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 应用l d 和质谱技术分析了不同生长周期和细胞周期绿藻h o e m a t o c o c o c c u s p l u v i a l i s ( c h l o r o p h y c e a e ) 的胞壁蛋白。分析的1 6 3 个蛋白条带中有8 1 个蛋白被 鉴定。结果显示，在该藻生长的不同周期和生长阶段，其细胞表面蛋白都有明显 的变化( w a n ge ta 1 2 0 0 4 ) 。 总之，蛋白质组学及其技术的出现为细胞表面蛋白质组学的研究提供了理 论依据和技术支持，运用该技术研究赤潮生物细胞表面蛋白，将对揭示赤潮生物 细胞表面蛋白功能及其在赤潮生物生命活动中的作用、赤潮形成的机制都重要的 理论价值。 1 2 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 1 2 营养盐对赤潮生物细胞表面蛋白表达的影响研究概述 在海洋中，营养盐的变动直接影响到赤潮生物的生长和一切生理活动。评 价营养限制的方法是研究赤潮生物生长趋势的重要技术( m i l l s ，1 9 8 9 ) 。研究海 区赤潮生物对营养盐的吸收需求对赤潮预报和防灾减灾具有重要意义。目前的化 学分析方法具有很大的局限性，不能反应生物真正的营养状态。因而评价生物本 身对营养盐变化的直接响应的生理指标，显得十分的直观而简便。作为营养盐限 制的生物标志物( 例如g l u t a m a t e g l u t a m i n e 的比率是作为氮限制的标志) 已经得 到深入的研究( f l y r m ，1 9 9 0 ) 。但目前很少的研究涉及到细胞表面蛋白作为细胞 营养状态的指示物。研究不同环境下的细胞表面特征蛋白，将这些特异的蛋白制 备成抗体，可以作为研究赤潮生物营养状态和检测赤潮的技术手段( b r i a ne ta l ， 1 9 9 5 ) 。 应用蛋白质组学的方法研究不同氮营养环境下赤潮藻细胞壳壁蛋白，为我 们提供了一个应用蛋白质组学分析赤潮生物营养状态的方法。分析不同营养环境 下的细胞表面蛋白质组的差异表达，可能会寻找到一些与营养相关的的特异蛋白 一营养指示蛋白。进一步研究这些蛋白的特征，并可以进一步开发研究指示营养 状态的检测方法技术。 b r a i n 等( 1 9 9 5 ) 运用荧光标志的方法研究了球石藻赫氏藻细胞表面蛋白， 发现一种氮调控蛋白- n 印l ，分子量大小约为8 2 k d a ，它只在氮限制或尿素为 氮源的条件下出现，而在磷限制或以硝酸盐和氨盐为氮源的条件下则缺失，该蛋 白可用来指示细胞所处环境中氮的状况。该蛋白是氮限制细胞中主要的膜蛋白或 壁蛋白，并且在其他几株赫氏藻中也发现了该蛋白。b r a i n 等( 1 9 9 5 ) 对n r p l 蛋白的功能进行了推测，认为n r p l 蛋白很可能是( 1 ) 一种能保护蛋白，保护细 胞在氮饥饿的状态下生存下去；( 2 ) 是一种氮限制诱导的转运蛋白，该蛋白可以 吸收转运环境中的氨基酸、胺、嘌呤、嘧啶和尿素等。一些学者研究，丙氨酸可 以作为唯一的氮源支持赫氏藻的生长( 2 0 ) 。但是在b r a i n 的研究中，n r p l 不会 作为丙氨酸等氨基酸的转运蛋白：( 3 ) 另外，n r p l 也可能是一种d n a 、r n a 和 蛋白降解酶。它们可以降解大分子量的含氮有机物，从而使得这些有机氮源成为 可利用的氮；( 4 ) 由于赫氏藻可以生长在尿素培养下，并且能表达n r p l 这一蛋 1 3 中国近海典型赤潮生物细胞表面蛋白质组研究 白，所以该蛋白可能是一种尿素转运蛋白或者是脲酶。该蛋白可能会在氮显著的 条件下诱导出来，并尽最大可能的吸收环境中的尿素( b r i a n ，1 9 9 5 ) 。在另一种 真菌s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 也发现一种分子量接近于8 0 k d a