（果树学专业论文）葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究.pdf

葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 中文摘要 本试验以京玉葡萄幼苗为试材，首先研究了测定叶片外渗电导率的方法， 探讨了浸提时间、浸提液体积、叶龄、真空处理和展着剂等五个因素对结果 的影响，筛选出测定电导率的最佳处理方法。其次确定了测量叶片耐热性的 方法，结果表明，5 0 c 热致死时间法能够较好地反映葡萄叶片的耐热性强弱 应用上述方法研究了水杨酸对葡萄幼苗叶片耐热性的影响，结果表明喷施2 0 0 m o l l 水杨酸能够短时提高叶片的耐热性，延续时间在6 小时左右而热锻 炼2 4 小时后，植株获得的耐热性可持续1 2 小时以上，两种处理对提高葡萄 叶片的耐热性效果大致相似此外，喷施2 0 0 “m o l l 水杨酸3 小时后，叶片 的净光合速率明显上升，喷施不同浓度水杨酸6 小时后，浓度越高，植株的 蒸腾速率越大本实验最后探讨了“恩威一号”植物生长调节物质对葡萄的 生理作用，为今后探索其在缓解高温伤害上的应用试验作准备结果表明： 土施该调节剂促进植株的生长，而喷施一定浓度该调节剂却延缓了植株的生 长 v一 关键词电导率水杨酸，耐热性热致死时间 复 ! 里查些盔堂堡主兰垡笙奎 a b s t r a c t u s i n g j i n g y u ”g r a p e v i n e sa sm a t e r i a l s ，s u c hf a c t o r sa st i m eo f s a t u r a t i o n 、 v o l u m e o f l e a c h 、l e a f a g e 、v a c u u m t r e a t m e n ta n d s p r e a d e r s t i c k e rw e r e s t u d i e dt o s e l e c tt h eb e s ta p p r o c ht om e a s u r et h ec o n d u c t a n c eo fg r a p e v i n e sl e a f t h e nt h e m e t h o do fd e f m eh e a tr e s i s t a n c eo fl e a fw a s i n v e s t i g a t e d ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t t h el e t h a lt i m ei n5 0 w a t e rc o u l db eu s e dt os c r e e nd i f f e r e n tl e v e l so f g r a p e v i n e s l e a f sh e a tr e s i s t a n c e t h es t u d yo nt h ee f f e c to fs ao nh e a tr e s i s t a n c eo f g r a p e v i n e sl e a fs u g g e s t e dt h a t2 0 0 um o l ls ae n h a n c e dl e a fh e a tr e s i s t a n c ei na s h o r t p e r i o d a f t e rt r e a t m e n t ，t h et i m ew a sa b o u t6h o u r s w h e r e a s ，t h ea q u i r e dh e a t r e s i s t a n c eb yh e a tt r e a t m e n tl a s t e dh e y o n d1 2h o u r s ，t h e s et w ot r e a t m e n t sw e r e s i m i l a r t o h e a tr e s i s t a n c e o f j i n g y u g r a p e v i n e s f u r t h e r m o r e ，a f t e rs p r a y i n 9 2 0 0 um o l ls a3h o u r s ，t h en e tp h o t o s y n t h e s i sr a t eo f l e a f i n c r e a s e dm a r k e d l y a f t e r s p r a y i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ns a 6h o u r s ，h i g h e rc o n c e n t r a t i o ns ar e s u l t e di n h i g h e rt r a n s p i r a t i o ni n t e n s i t y f i n a l l y ，t h ep h y s i o l o g y e f f e c t so f e w 一1 # a n t g r o w t h r e g u l a t o ro n j i n g y u ”g r a p e v i n e sw a sd e t e r m i n e d 。t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts o i l a p p l i c a t i o no f e w - 1r e g u l a t o re n h a n e dt h eg r o w t ho fg r a p es e e d i n g s ，b u tf o l i a r s p r a y i n gc e r t a i nc o n c e n t r a t i o ne w 一1r e s i s t e d t h i r eg r o w t h k e y w o r d sc o n d u c t a n c e s a l i c y l i ca c i d h e a tr e s i s t a n c el e t h a lt i m eo f h e a t 4 葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 1 前言与综述 自然界的环境千变万化，适合植物生长的环境条件是有限的，植物经常受到多种逆 境胁迫如干旱、高温、冷害、盐害、病虫伤害和空气污染等的危害。植物在长期的进化 过程中，形成了各种对付外界不利环境的方法，但是植物的这种自我保护能力是要付出 代价的，也是有限的，全球因此造成的农业损失极其巨大。在世界许多地区，高温是造 成作物减产的一个主要非生物胁迫，因而研究的也较多。防止高温伤害有许多常规措施， 但尚未见到一套行之有效能大面积应用的方法。化控技术由于简便易行，投入少，效果 明显，在农业中得到了广泛应用。水杨酸( s a l i c y l i ea c i d ) ，一种新的植物激素，近年来 研究较多。水杨酸的化学名是邻羟基苯甲酸，广泛存在于植物体内( r a s k i n ，1 9 9 0 ) ，它 与植物抗病方面的研究倍受关注( r a s k i n , 1 9 9 2 ) ，l o p e z 等( 1 9 9 8 ) 发现生长在一定浓度水 杨酸溶液中的番茄幼苗的抗热性增强了，之后的研究( d a t , 1 9 9 8 ) 证实了水杨酸可以提 高芥子苗的耐热性，多种与抗热有关的生理生化指标变化与热锻炼后的一致。水杨酸是 廉价易得物质，若广泛发挥它的这一生理效应，形成一套有效的抗高温技术，对减少作 物逆境胁迫造成的损失很有意义。本试验拟研究水杨酸对葡萄耐热生理的影响，并结合 其它植物生长调节物质探索抗高温的技术。 1 1 高温逆境对植物的影响 温度过高或高低，植物正常的生理代谢受到抑制，如葡萄的三基点温度是：最低温 1 0 ，最适温2 0 - 2 8 1 2 ，最高温4 9 5 。在我国北方蔬菜保护地生产的中后期，设施内 温度常达到4 0 以上，夏季露地的气温也经常高达3 5 左右，地温可达到5 0 ( 杜永 臣，1 9 9 6 ) 。此外，相对于露地来说，温室是高温高湿的环境，温度变化的特点是温度高 且升降温变化剧烈，设施内温度常高达4 0 以上( 张福墁，2 0 0 1 ) ；另一方面，设施内 温度上升过快也会造成植物伤害。对于果树设施栽培来说，高温最大危害在于导致果树 生殖器官发育不良，桃花期温度高于2 2 会导致败育，造成见花不见果的现象，严重影 响产量和品质( 郗荣庭，1 9 9 5 ) 。 5 中国农业大学硕士学位论文 植物在遭受高温胁迫后，产生一系列生理生化变化，包括细胞结构、生理生化过程、 基因表达等各个方面，这是植物对胁迫信号感受、传导和适应的结果，是产生高温危害 的原因，同时也是植物抗高温的基础。 1 1 1 高温对生物膜的影响 生物膜主要由蛋白质和脂类构成，二者靠静电和疏水键相互联系，温度升高后蛋白 质移动速度增加，迁移幅度加大，甚至导致膜蛋白变性，生物膜的结构被破坏。同时膜 透性增加细胞内部原生质外渗( 陈少裕，1 9 8 9 ) ，在电镜下观察到热害组织的细胞质膜、 液泡膜和叶绿体膜均发生了变化( 王光耀等，1 9 9 9 ) 。 高温对叶绿体结构的影响主要表现在对其外膜和类囊体的破坏上，甘蓝遭遇高温后， 叶绿体趋于变为球形，外膜出现不同程度的断裂和局部解体，类囊体片层排列紊乱，基 质片层模糊不清( 苗琛等，1 9 9 4 ) 。r u s t i c 和c a s s s ( 1 9 8 3 ) 报告高温引起叶绿体外膜断 裂和类囊体肿胀，随着时间的延长，叶绿体形状变得不规则，外膜开始消失，基质片层 难以辨认，并出现小脂肪滴。温度升高后。膜的流动性增大，透性增加，双层结构失去 正常的构型，这是高温引起膜伤害的主要原因。 高温下膜的流动性大小与膜的不饱和脂肪酸含量有关，不饱和脂肪酸比例小，膜表 现出较高的耐热性。例如，不饱和脂肪酸和脂肪酸的比例在夏季作物的叶中比冬季作物 的要小得多( 刘祖祺等，1 9 9 4 ) 。 1 1 2 高温对植物光合作用的影响 光合作用的光反应系统位于类囊体膜上，暗反应系统存在于基质中。研究表明，光 系统i i 对高温最为敏感，一般认为高温首先阻断光系统i i 的光反应，随后引起天线色素 复合体与光合系统i i 的光捕获机构分离。黄瓜叶片3 8 ( 2 时光系统的光化学反应就会受 到抑制，4 2 时这种抑制成为不可逆的伤害光系统的这种高温伤害是因为高温破坏了 类囊体膜的正常结构，膜内外正常的氢离子浓度梯度消失，导致a t p 生成减少，r u b p 因能量不足合成减慢，c 0 2 同化随之减少，光合产物相应减少，这是光合作用受高温抑 制的重要原因( 杜永臣，1 9 9 6 ) 。 6 葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 1 1 3 高温对植物呼吸作用的影响 多种蔬菜作物根系的最高呼吸速率在3 5 4 5 c 之间，但喜凉作物马铃薯的根系在3 0 的呼吸速率比2 0 c 时的稍低。研究表明，作物在高温胁迫初期呼吸表现上升，一段时 间后呼吸速度逐渐降低( 赵可夫等，1 9 9 0 ) ，说明长时间的高温胁迫伤害了呼吸系统。不 同作物呼吸系统对高温胁迫的忍耐能力不同，黄瓜根系在不同温度下3 0 分钟后，测得最 高呼吸速率在4 0 - 4 5 ( 2 ，若在3 3 培养一周后，呼吸速率比2 8 的明显降低，根系在3 8 高温下经过l o 天仍保持比2 5 对照高出5 0 的呼吸速率( 周丽娟，1 9 9 9 ) 。植物线粒 体呼吸系统中电子传递的两条途径，即细胞色素途径和抗氰途径对多种逆境表现出不同 的应答反应( 饶立群，2 0 0 0 ) 。研究表明，高温所引起的呼吸亢进是由于抗氰呼吸增加的 结果，但是细胞色素呼吸比抗氰呼吸对高温更敏感。 1 1 4 高温对植物体内激素平衡的影响 1 脱落酸( a b a ) 干旱、低温、盐害等多种逆境均能诱导植物内源a b a 的升高，因此a b a 被认为是 植物的逆境信号分子。但是高温对内源a b a 水平影响的研究结果尚缺乏一致性。i t a i 等 ( 1 9 8 7 ) 将菜豆的根系在4 7 c 高温下处理2 分钟，在随后的2 4 小时内观察到木质部伤 流液中a b a 水平的升高，但e z e 等( 1 9 8 9 ) 将保持在不同湿度条件下的菜豆叶片置于 4 5 ( 2 高温下，之后测定a b a 浓度，结果表明内源a b a 水平主要决定于叶片的水分状况， 因此他们认为高温引起a b a 的增加可能是水分亏缺直接导致的而并非高温本身，因 为任何胁迫最终将导致水分胁迫。对黄瓜根系中的a b a 研究表明( 马德华等，1 9 9 8 ) ， 在3 5 以上的温度下，a b a 一天后下降为2 5 3 2 的一半，并持续至第五天。在之后连续 1 0 天的测定中，高温下生出的根系中a b a 水平都比2 5 ( 2 的高出近十倍，他们认为高温 降低了根系内a b a 水平，而1 0 天后根系中观察到的a b a 的大量积累来自叶片。总之， 高温胁迫与内源a b a 之间的关系还需进一步研究。 2 细胞激动素( c t k ) 细胞激动素具有促进蛋白质合成、抑制蛋白质分解、延缓植物衰老的作用，因此， 高温引起的作物衰老与细胞激动素水平下降有密切关系。 7 中国农业大学硕士学位论文 细胞激动素主要由根系合成，i 忸i 报告( 1 9 8 7 ) 将菜豆的根系在4 7 下处理2 分钟， 根木质部伤流液中细胞激动素含量便显著减少，玉米根系遭受短时高温后，叶片细胞激 动素含量大幅下降，叶绿体的发育和叶绿素的合成都受到抑制。黄瓜在3 5 c 以上高温下， 根和叶片中的玉米素和玉米素糖脂的含量都随着处理时间的延长而降低，但是都未观察 到叶片蛋白酶活性的增加。 3 乙烯( c 2 h 2 ) 多种逆境都可以诱导乙烯的合成，但是高温下作物体内乙烯代谢的变化研究却很少， 鹰嘴豆( c i e e r a r i e t i n u m ) 种子的发芽适温为2 5 c ，3 5 高温能明显地抑制其萌发，同时 抑制乙烯的生成，s a t t e l m a e h e r 等( 1 9 9 3 ) 测定了不同温度下马铃薯根系中的乙烯释放量， 但未发现高温对乙烯合成有影响。 1 1 5 高温对植物体内蛋白质的影响 高温对植物的影响从本质上讲可能是一个加速衰老的过程。高温逆境下植物体内酶 钝化，蛋白质合成相应下降，同时构成蛋白质的多肽链氢键被打断，蛋白质分子的空间 构型遭到破坏。蛋白质分子降解为氨基酸，这样游离氨基酸含量增加，蛋白质含量减少 ( 原永兵等，1 9 9 7 ) ，而植物衰老的特征之一就是器官中蛋白质合成的降低和蛋白质分解 的加速试验表明玉米线粒体氧化磷酸化酶在3 0 - 3 5 2 时开始解耦联，到4 0 c 完全解耦 联，使蛋白质合成受阻，植物呈现出热害症状( 刘棋祖，1 9 9 4 ) 。同时在高于生物正常生 长温度8 1 2 的温度下，生物体内将合成熟激蛋白( 邱德有，1 9 9 4 ) 。 高温对蛋白质的影响与细胞的含水量有关，高温造成植物蒸腾作用增强，呼吸加速， 代谢活跃，水分消耗大，易造成生理干旱，蛋白质的空间构型也会随之破坏。因此蒸腾 小、保水力强的植物耐热性强。但对种子来说，含水量高反而会激活蛋白质的活性，因 此干燥的种子耐热性强，含水量较大的幼苗耐热性差。 1 1 6 高温对生长发育的影响 低于或高于植物生长最适温度，就会使植株生长发育受阻，叶片提前衰老，光合产 物积累减少。受害时间太长或太严重，会造成不可恢复的永久伤害，以后外界条件即使 8 葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 恢复到适当水平，植物也不能正常生长( 刘祖祺等，1 9 9 4 ) 。 温度对植物花芽分化的影响十分显著，一般落叶植物花芽分化多起始于夏季高温阶 段，这时主要进行花的孕育，由于温度直接支配树体碳素代谢，影响有机物质的积累和 分配。从而间接影响花芽分化的过程。木本植物的花芽分化要求较高温度、干燥和日照 充足的环境条件，但温度过高反而减少花芽形成率，日平均温度2 0 2 7 0 利于苹果等落 叶果树的花芽分化，伏令夏橙在较低的夜温( 2 0 1 5 ( 3 ) 和比较高的日温( 3 0 c ) 条件下 利于形成花芽( 曲泽州，1 9 8 5 ) 。 大多数落叶果树生长期间当温度高达3 5 0 时，生理代谢开始受抑制，温度到达5 0 一5 5 时受到严重伤害，常绿果树耐高温能力强些，但当气温高达5 0 c 以上时也会引起严重 伤害。果树受到高温伤害后的主要症状是( 赵可夫，1 9 9 0 ：刘祺祖等，1 9 9 4 ) ： 1 大量落花落果。花前及花期高温致使花器官发育不完全，幼果期遇高温天气导致 幼果大量脱落。 2 果实和树干日烧，造成果实品质和价格大幅降低。 3 枝条向心生长。 4 叶片变形脱落。 1 1 7 高温对酶的影响 细胞膜处于原生质的最外侧，高温对细胞膜和内膜系统的影响最为显著。正常情况 下植物细胞中自由基的产生和消除处于动态平衡状态，当遭受逆境后，这种平衡就被破 坏，累积的自由基易引发膜的过氧化作用。造成细胞膜系统的损伤( 吴国胜，1 9 9 5 ) 。植 物对膜脂过氧化有两类防御系统( 陈少裕，1 9 8 9 ) ：一类是酶促防御系统，包括过氧化物 酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 、 谷胱甘肽还原酶( g s h - r ) 等。另一类是非酶促防御系统，包括维生素和辅酶o 等。目 前有关耐热生理的研究大多集中于蔬菜上( 杨向辉等，1 9 9 9 ；周群初等，2 0 0 0 ) ，包括白 菜( 罗少波，1 9 9 6 ：司家钢等，1 9 9 5 ；孙立全，1 9 9 8 ；杨向辉等，1 9 9 9 ) 、甘蓝( 李成琼， 1 9 9 8 ) 、辣椒( 姚元干等，1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) 、萝b ( 陈火英，1 9 9 0 ) 、黄瓜( 马德华等，1 9 9 8 ； 周丽娟等，1 9 9 9 ) ，其它还有小麦( 许为刚等。1 9 9 9 ；陶宗亚，1 9 9 9 ) 、柑桔( 林定海等， 1 9 9 6 ) 、草坪( 何亚丽等，2 0 0 0 ) 、猕猴桃( 彭永宏，1 9 9 5 ) 、苹果砧木( 杨静慧等，1 9 9 6 ) 9 中国农业大学硕士学位论文 等。其中以研究各种酶的变化和筛选合适的耐热性指标为主，目的是选育耐热品种，或 进行耐热性鉴定( 司家钢等，1 9 9 5 ；孙立全，1 9 9 8 ；罗少波，1 9 9 6 ) 。高温胁迫后主要保 护酶活性和相关生理指标的变化如下： 1 过氧化物酶( p o d ) 萝h ( 陈火英等，1 9 9 0 ) 、黄瓜( 李兆亮，1 9 9 8 ：庞金安，2 0 0 0 ：马德华，1 9 9 8 ) 、 辣椒( 姚元干等，1 9 9 8 ) 叶片中的p o d 活性有不同程度的升高，大白菜的p o d 活性表 现下降( 刘维信等，1 9 9 2 ；司家钢，1 9 9 5 ：吴国胜等，1 9 9 5 ) 。而水杨酸可以诱导水稻体 内p o d 活性升高( 桑海旭等，2 0 0 0 ) 。 2 超氧化物歧化酶( s o d ) 不同品种的黄瓜s o d 活性有升有降( 孟焕文，2 0 0 0 ) ，耐热品种活性升高，不耐热 品种的活性降低。萝h 叶片中的s o d 活性降低( 陈火英等，1 9 9 0 ) ，可能是因为s o d 消除了自由基所致。大白菜s o d 活性升高( 吴国胜等，1 9 9 5 ) 。 3 过氧化氢酶( c a t ) 大白菜c a t 活性升高( 吴国胜等，1 9 9 5 ) ， 其它相关指标的变化如下：呼吸强度降低( 刘维信等，1 9 9 2 ) ，叶片电导率均下降( 周 群初等，2 0 0 0 ) ，甘蓝和辣椒的丙二醛( m d a ) 含量上升( 李成琼，1 9 9 8 ；姚元干等， 1 9 9 8 ) 。丙二醛是膜腊过氧化的最终产物，对生物膜会产生严重损伤( 王爱国等，1 9 8 6 ) 。 其次，高温胁迫还造成叶子叶绿素含量下降，可溶性蛋白含量由于热激蛋白的产生而增 多，呼吸强度下降( 杜永臣，1 9 9 6 ) 。 1 2 水杨酸诱导植物耐热性的研究 水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) ，化学名邻羟基苯甲酸，分子式c 7 h 6 0 3 ，分子量1 3 8 ， 属酚酸。水杨酸常温下是短针状结晶，熔点1 5 7 1 5 9 c ，7 9 c 时升华。微溶于水，易溶 于乙醇、乙醚、氯仿和沸水，饱和水杨酸的p h 值是2 4 ，当用3 0 1 r i m 光激发时，s a 发 出4 1 2 n m 荧光。 r a s k i n ( 1 9 9 0 ) 在分析了3 4 种重要的农艺植物后，确定s a 广泛存在于植物的叶和 生殖器官中。水稻、狗尾草、大麦和大豆的s a 含量都超过了l 1 1g g f w ，s a 的最高水 平出现在植物的花序和被病毒感染的植物体内。 1 0 葡萄耐热性涓定方法及抗热性调控技术的研究 水杨酸是植物产生的，其特殊的植物生理效应人们很早也观察到了，但直到六十年 代才开始逐渐发现水杨酸在植物体中的作用机制( r a s k i n 。1 9 9 2 ；k l e s s i g ，1 9 9 4 ) 。七 十年代末又发现s a 可以诱导植物产生抗病能力，s a 的研究变得非常活跃。由于研究抗 病的重要意义，迄今大部分与s a 有关的研究集中于与植物有关的抗病研究上。有关水 杨酸在植物体中的作用已有多篇综述( r a s k i n ，1 9 9 2 ；k l e s s i g ，1 9 9 4 ；原永兵，1 9 9 4 ； 李德红等，1 9 9 5 ) 早在1 7 7 8 年，l a m a r o k 描述了天南星属( a r u m ) 植物的发热现象，现在已经发现 苏铁科植物的雄性生殖器官和一些被子植物如a n n o n a o e a e 、a r a c e a e 、a d s t o l o c h i a c e a e 、 c y l a n t h a c e a e 、n y m p h a e a c e a e 、p a l m a e 的花序都能产热( r a s k i n ，1 9 8 7 ) 。最典型的是一 种百合科植物乌独百合( s a u r o m a t u mg u t t a t u ms c h o r ，v o o d o ol i l y ) ，它的佛焰花序在开 花当天凌晨花序上的大苞片展开，露出上部的棒状附属物，之后花序开始升温，同时释 放胺和吲哚类物质，胺和吲哚类物质的腐败气味吸引昆虫聚集，帮助百合传粉。到中午 棒状附属物的温度高出周围气温1 4 c ，傍晚时恢复到正常温度，晚间花的下部花粉室内 开始第二次升温放热百合科植物放热高峰时的0 2 消耗非常剧烈，呼吸速率与蜂鸟在飞 行中扇翅时的呼吸速率相当( r a s k i n 。1 9 8 9 ) 。这一现象引起了很多人的兴趣。 v a nh e r k ( 1 9 3 7 ) 提出乌独百合的放热是由一种”热素”引发的，”热素”是由附属物下 的雄花产生的水溶性物质，并在开花前就进入附属物中从而引发了放热。经过5 0 多年的 研究，1 9 8 7 年r a s k i n 等高度纯化了从乌独百合( v o o d o ol i l y ) 中提取出的“热素”，应 用质谱分析法确定这种物质就是2 羟基苯甲酸( 2 - h y d r o x y b e n z o i ca c i d ) ，即常见的水扬 酸( s a ) 。更深入的研究表明，在开花前一天，乌独百合产热器官中水杨酸的含量增加 了1 0 0 倍，达到1ue g g f w ，附属物内的s a 中午开始增加，傍晚达到最大值，而花序 下部的s a 晚上才达到最大值，与升温时间相符，说明s a 与生热直接相关。热素粗提 取物和s a 都能使花序升温，2 0 0 u l 、1 5um 的s a 使花序升温8 2 ，与热索提取物作 用的效果相当( r a s k i n ，1 9 8 9 ) 。r e s k i n 等( 1 9 8 9 ) 试验了3 3 种s a 的类似物，只有2 、 6 二羟基苯甲酸( 2 、6 - d i h ) r d r o x y b e n z o i ca c i d ) 和乙酰水杨酸( a c e t y l s a l i c y l i ca c i d ，a s p r i n ) 有生热效应，并且2 、6 一二羟基苯甲酸的活性高于s a 至于在开花前附属器官对s a 升 高的敏感性，则受控于光周期。 植物的生热现象与抗氰呼吸的电子传递系统有关，抗氰呼吸的电子传递与磷酸化过 程不耦联，化学能以热的形式放出而不是以a t p 形式储存( y a l p a n ，1 9 9 2 ) 。现在已经 l l 中国农业大学硕士学位论文 从枯苞( s a u t o m a t u mg u t t a t u m 。s c h o t t ) 中分离出了编码氧化酶的核基因( r h o a d sa n d m c i n t o s h ，1 9 9 1 ) ，大小为3 9 k d ，经纯化的百合雄花提取液和s a 都可激发该基因，证 明s a 可激活氧化酶系统。s a 还可加强烟草悬浮细胞的抗氰呼吸而不影响细胞色素氧化 途径( k a p u l i n i k ，1 9 9 2 ) 。但是，氧化酶在乌独百合开花前3 天已经开始积累( r h o a d s d m a n dl e em ，1 9 9 2 ) ，可以推测还有另外的物质参与了调控，而且开花过程中胺和吲哚类 物质的来源至今尚未阐明。 植物放热是消耗呼吸底物如碳水化合物、蛋白质、脂肪或有机酸等的过程，这对植 物有利还是有弊，意义何在? 应该认为这一现象是自然选择的结果，花序放热可抵御严 寒，增加抗性。南非的臭菘依靠放热可在冰天雪地中开放，花序产热时间与开花期一致， 这改变了花序的局部小气候，胺和吲哚类物质的腐败气味吸引昆虫传粉，高温为昆虫创 造了温暖的环境，利于植物繁衍后代。此外，抗氰呼吸的p o 比为1 0 或2 0 ，因此可提 供一定量的a t p ，补充能量的不足( 何新华，1 9 9 3 ；d a v i d ，1 9 9 2 ) ，花序放热是自然选 择和物种进化的结果。 特别是大量的研究表明，水杨酸能够诱导某些植物产生抗病能力，而病源也可以诱 导植物体内s a 水平升高。多种现象表明s a 可能是诱导抗病的原初信号，同时也是一 种内源信号传递物质，扮演信号传递链中一个成员的角色。鉴于上述方面的研究，研究 者对s a 调节植物抗逆性的作用也倍感兴趣。 h u m g c r t o ( 1 9 9 8 ) 发现，生长在由乙酰水杨酸溶液试管中的番茄幼苗组织，其耐热 性增强了。d a t 等( 1 9 9 8 ) 于是设计实验想证明是否s a 能在整个植株中诱导产生耐热性。 通过喷施s a ，与热锻炼之后的幼苗相比较，结果s a 显著提高了整株植物的耐热性。 d a t 等还测定了h 2 0 2 含量及过氧化氢酶活性的变化，二者在处理之后都显著降低。这是 首篇关于s a 提高幼苗耐热性的报道，之后d a t 等( 1 9 9 8 ) 又深入测定了几个相关的酶。 已经清楚地表明，s a 并不是仅仅对病原有反应，高温可以诱导s a 增加，其它如紫 外线、臭氧均可引起植物体内s a 升高，而且紫外线也可以引起热激蛋白合成。d a t 等( 1 9 9 8 ) 提出了热锻炼期间s a 、a o s 和抗氧化剂酶之间的可能联系：高温引起0 2 和h 2 0 2 的增 加，h 2 0 2 升高刺激了s a 的合成，因此高温和s a 可能是通过h 2 0 2 的含量的增加而联系 的。反之，s a 结合蛋白具有过氧化氢酶活性，也可以认为s a 结合蛋白就是过氧化氢酶， 因此s a 抑制h 2 0 2 的分解可引起h 2 0 2 的增加，同时高温抑制了c a t 活性也引起h 2 0 2 的积累，h 2 0 2 又可被c a t 和a p x 循环除去，喷施s a 或热锻炼后的i 5 _ 4 小时内，芥 1 2 葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 子苗的h 2 0 2 的水平和c a t 活性均下降，王利军( 2 0 0 1 ) 也有相同的结果表明两种处 理可能存在统一的作用机制，其机理有待于进一步研究。 d a t 等( 1 9 9 8 ) 试验所用试材均为芥子( s i n a p i s a l b a l ) 苗，芥子苗生长周期短( 8 天) ，占地小，能大批量利用，可以看成模式植物，方便研究但缺乏实用价值。d a t 等采 用的热锻炼温度是气温4 5 c ，时间l 小时，因试材数量多，故用成活率直接判断耐热性 高低，苗木的抗热能力一目了然，热激温度是气温5 5 c ，时间1 5 小时，1 0 天后观察成 活率。该法实验周期短，热处理条件设计合理，取得了较好结果。 1 3 用电导法测量植物抗逆性 1 3 1 电导率及其测量方法 细胞膜是分隔细胞内部和外部的屏障，是细胞和环境发生物质交换的主要通道。由 于处于原生质的最外层，因此细胞膜首先感受到环境因子的变化( 郑东虎等，1 9 9 8 ) 。细 胞膜的主要特征是选择透性，正常条件下进出细胞膜的物质处于平衡状态，虽然细胞膜 具有自我恢复和一定的自我修复能力，但逆境条件下细胞膜的选择透性会或多或少地受 到影响当质膜的选择遮性因逆境伤害而明显改变或丧失后，细胞内的物质( 尤其是电 解质，均为小分子物质) 大量外渗，把组织细胞浸泡在浸提液中，浸提液的电导率就会 发生变化。因此，测定脂膜透性常作为植物抗性研究中的一个手段，通过测定外渗液电 导率的变化，就可以知道质膜的受损情况，它反映了逆境环境对植物的伤害程度，也反 映了植物对逆境的忍耐程度，即抗逆性的强弱。不同抗性的植物品种，其原生质膜的稳 定程度不同。抗性强的品种在逆境下，其质膜仍能保持正常，电解质外渗少，外渗电导 率较低，抗性弱的则相反。电导法反映了细胞原生质膜的稳定性，它的优点是快捷、准 确、简便，所需仪器和试剂少，逐渐得到较多的应用( 郁俊谊，1 9 9 7 ：周伟华，1 9 9 9 ； 罗少波，1 9 9 6 ，1 9 9 7 ：杨静慧等，1 9 9 6 ：杨丽薇等，1 9 9 6 ：王利军等，2 0 0 1 ) 。 d e x t e r ( 1 9 3 0 ) 首先用电导法测定了植物的抗冻性。电导就是电解质溶液导电性的大 小，截面为1 c m 2 、相距l e m 的溶液的电导值称为溶液的电导率，单位是us e m 。它是电 解质溶液的特征常数，与该溶液的总离子浓度和电荷有关，植物组织浸泡液的电导率称 为外渗电导率，用电导率衡量抗逆性的方法称为外渗电导法。 中国农业大学硕士学位论文 如何表示外渗电导率? 常用到以下几种数值( 郑东虎等，1 9 9 8 ：陈建白，1 9 9 9 ) ： 1 外渗电导率值 直接用外渗电导率表示，对照为不加植物组织的浸提液，其余条件相同，测量值减去 对照值就是该组织的外渗电导率。由于不同细胞电解质含量不同。该法误差很大。 2 绝对电解质渗漏量 即测出一定量组织的电解质渗出量，结果是一个绝对值，该法过程复杂，基本不用 于抗性研究。 3 相对电解质渗出率 为了消除实验中的各种误差，便于各结果之间相互比较，测量外渗电导率较多采用下 面的改进方法。将去离子水的电导率作为本底值，先测一次处理的电导率，之后将其煮 沸冷却后再测一次电导率，外渗电导率用以下公式表示： 外渗电导率= 耋鲞萱皇量奎x1 0 0 煮杀后电导率 外渗电导率= 毒鬻孽萎善善妻三糕。 伤害率= 慕糕等黼灿。 实际测量中本底电导率即去离子水的电导率，新鲜去离子水的电导率很小，可忽略不计， 因此多数试验采用第一种表示方法，本试验也采用第一种表示方法。 1 3 2 半致死温度和热致死时间 半致死温度主要用于冷害和冻害研究中( 朱月林，1 9 8 8 ) 。耐热性研究大多集中于蔬 菜上，主要以生物学观察为基础，结合电导法、脯氨酸、丙二醛等指标评价耐热性，有 的取得了较好的结果。s u k u m a r a n ( 1 9 7 2 ) 等用一系列低温处理马铃薯叶片组织后，根 据冻害试验结果，提出用外渗电导率达到5 0 的温度作为半致死温度。半致死温度是逆 境伤害的临界温度，它用以表示低于该温度的冻害将认为导致植物受到不可逆的伤害而- 死亡，高于该温度的逆境伤害植物可以自我修复不造成死亡。抗逆性强的品种半致死温 度较高，反之较低，因此半致死温度反映了该植物抗逆性的强弱。 当用一系列温度( 低温和高温) 处理组织后。外渗电导率和温度之间呈“s ”型曲线 1 4 葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 关系其回归方程公认为是l o g i s t i c 方程( 朱根海等，1 9 8 6 ) 。其拐点即半致死温度，目前 测半致死温度都用这一方法。在大白菜( 刘维信等，1 9 9 2 ：罗少波等，1 9 9 6 ) 、柑桔( 孙 中海，1 9 8 8 ，1 9 9 2 ) 、苹果( 周恩等，1 9 8 9 ) 、猕猴桃( 彭永宏，1 9 9 5 ) 等园艺作物上测 试，与田间表现一致。 本实验需要鉴定葡萄叶片的耐热性，拟用半致死时间衡量，即用叶片在5 0 ( 2 水浴中 外渗电导率达到5 0 的时间作为衡量耐热性的指标，它是一个相对值，本课题组对该法 已有应用( 王利军，2 0 0 1 ) 。半致死温度法要求一系列间隔不大的温度梯度，现有条件下 难以做到准确控制温度，同时本实验所用试材较多，用半致死时间法能够缩短试验时间， 减少误差，因为处理过程中只用到一个恒定的水浴温度。此外，半致死时间法的结果也 同样便于相互比较。 1 5 中国农业大学硕士学位论文 2 测定葡萄叶片外渗电导率计量单位的研究 电导法已有较多应用，但本法由于方法本身的原因随意性很大，无法标准化，不同 的试材，不同的试验目的，所用的计量单位多有不同，有的实验专门探讨方法本身的各 个因素( 郁俊谊等，1 9 9 7 ；贺普超等，1 9 8 2 ) 。因此，实验首先应该排除各种可能因素的 干扰，选择适合本实验条件的计量单位。据现有的结果，电导法有两点较为熏要，一是 操作过程中的器具、试材和试剂均可能带有可溶物质。溶进浸提液中将增大电导率，应 尽量减少外来电解质的干扰。同时还要尽量使细胞的外渗电解质溶进浸提液中。通常叶 肉组织内含有空气由于空气的阻隔，浸提液不能很好地渗入植物组织，外渗电解质全 部溶解很困难，用真空泵抽出组织内的空气，或延长浸泡时间，可利于溶解。本实验将 首先将浸提时间( 煮杀前和煮杀后) 、浸提液体积、叶龄、抽真空处理和添加展着剂等五 个环节作为可变量，确定它们对结果的影响，且每次试验仅使用其中一个变量，选取测 量京玉葡萄叶片电导值的最佳方法。 2 1 材料与方法 2 1 1 苗木培养 京玉葡萄扦插苗，定植于直径1 6 c m 高1 6 c m 的苗钵中，土壤由草炭土、蛭石和生土 按1 ：1 ：l 的比例混和而成，置于玻璃温室中培养，温室日平均温度2 5 2 8 ，常规管 理。苗木为无病虫的健康苗，去掉所有侧枝，只留一个主枝，平均有8 片成熟的叶片， 单株小区，三次重复。 2 1 2 电导率的测定 根据已有的研究，确定本实验测外渗电导率步骤是：每株剪取中部三片相邻叶片， 即从上向下数第4 、5 、6 片叶，用去离子水快速漂洗三遍，用滤纸吸干水迹，用打孔器 每叶均匀打取l o 个叶圆片，打孔器孔径o 6 c m ，避开大的叶脉。具塞刻度试管中预先加 入1 5 m l 新鲜去离子水作为浸提液，其中可以加入展着剂，将叶圆片浸入浸提液中，振 荡，静置或用真空泵反复抽真空三次，将叶圆片沉入试管底部，这一步的目的是尽量让 外渗电解质进入浸提液，用d d s - i i c 型电导仪测电导率，之后试管上塞。置于1 0 0 水 1 6 塑堕堕垫竺塑塞查鳖墨垫垫堡塑整垫查堕堕塞 浴中煮杀叶圆片1 0 分钟，完全杀死细胞，叶圆片变为褐色，取出试管冷却至室温，静置 一段时间，再测一次电导值。整个过程中所用器具清洁，各步骤所用时间保持一致。 2 2 结果与分析 2 2 1 浸提时间对外渗电导率的影响 一5 0 喜4 5 未t o 落3 5 3 0 03 06 09 0 1 2 0 1 5 01 8 0 时间( 分钟) 图l 一年生京玉葡萄叶圆片煮杀前电导率随时间的动态变化 f i g 1t h ed y n a m i cv a r i a t i o no f t h ec o n d u c t a n c eo f t h el e a v e sp i e c e so f o n e - y e a r - o k t j i o g y u g r a p e v i o e sb e f o r ed e a c hb yh e a t 2 2 0 名2 1 0 罟2 0 0 j1 9 0 甜1 8 0 曲1 7 0 脚1 6 0 1 5 0 0 3 0 6 09 01 2 0 1 5 0 1 8 0 时问( 分钟) 图2 一年生京玉葡萄叶圆片煮杀后电导值随时间的动态变化 f 醣2t h ed y n a n 血v a r i a t i o no f t h ec o n d u c t a n c eo f t h el e a v e sp i e c e so f o n e - y e a r - o l d j i n g y u g r a p e v i n e sa f t e r d e a c hb yh e a t 注：煮杀前时间从叶圃片放入浸提液开始计时，煮杀后时间从开始冷却时计时 由图1 看出，从叶圆片开始浸泡后，前6 0 分钟电导值不稳，之后电导值趋于稳定上 升，且变化幅度不大，表明随着时间的延长，越来越多的电解质进入浸提液。图2 表明， 煮杀6 0 分钟后，电导值变化即差异不显著，至1 2 0 分钟后电导值己趋于稳定，为减少可 1 7 中国农业大学硕士学位论文 能带来的误差，因此采用6 0 分钟和1 2 0 分钟两个时刻作为以后测量的标准，即煮杀前浸 泡6 0 分钟后测第一次电导率，煮杀后浸泡1 2 0 分钟测第二次电导率。 2 2 2 浸提液体积对外渗电导率的影响 图3 浸提液体积对一年生京玉葡萄叶圆片外渗电导率的影响 f i g - 3e f f e c to fl e a c hv o h l m eo ne x o s m o t i cc o n d u c t a n c eo ft h e l e a v e sp i e c e so f o n e - y e a r - o l d j i n g y u f a p e v m e s 图3 反映出三个处理之间并没有显著差异，因为计算的是相对电导率，说明相对电 导率很好地消除浸提液体积差异带来的影响。由于具塞试管中有1 5 m l 液体可方便电极 插入其中测量，浸提液体积定为1 5 m l 。 2 2 3 叶龄对外渗电导率的影响 图4 一年生京玉葡萄不同叶龄的外渗电导率 f i g 4e f f e c to f l e a f a g eo l lc m s m o t i cc o n d u c t a n c eo f t h el e a v e so f o n e - y e a r = o l d j i n g y u g r a p e v i n e s 注：新叶指从上向下数第1 - 3 片成熟叶，老叶指从下向上数第1 - 3 片叶 1 8 葡萄耐热性测定方法及抗热性调控技术的研究 试验中所用苗木的生长期是4 0 天，平均每4 天长出一片新叶，因此老叶的叶龄平均 是3 2 天，新叶是8 天。上图反映出叶龄之间的差异显著，故所有苗木应取相同叶龄的叶 片。 2 2 4 抽真空处理对外渗电导率的影响 图5 抽真空处理对一年生京玉葡萄叶片外渗电导率的影响 f i g 5e f f e c to f v a c u u mt r e a t m e n to ne x o s m o t i cc o n d u c t a n c eo f t h el e a v 部o f o n e - y e a r - o l d j h l g y u g r a p e v i n e s 从图5 可以看出，抽真空处理显著提高了相对电导率，说明真空处理可以很好地地 排除细胞间隙里的空气，利于外渗电解质扩敢到浸提液中。 从已有的实验方法看测量茎段的电导值多采用延长浸泡时间的措施促使电解质溶 解，浸提时间甚至长达1 3 小时( 郁俊谊，1 9 9 7 ) 。测叶的电导值也可单纯延长浸提时间， 而抽真空处理能在较短时间内达到较好的效果，可以减少误差，真空处理操作简单。如 果要精确测量电导率抽真空应该是必需的措施。 1 9 里查兰竺查兰堡主兰垡望苎 2 2 5 展着剂对外渗电导率的影响 图6 展著剂对一年生京玉葡萄叶圆片外渗电导率的影响 f i g 6 f f f c c to f s p r e s d e r - s t i c k e r o nc o n d u c t a n c eo f t h el e a v e so f o n e - y e a r - o l d j i n g y u g r a p e v i n e s 注：高效展着剂是一种新型展着舟j ，商品名“效力增高渗增效剂”，生产厂家：中国农业 大学有害生物防治研究所 展着剂能让叶片亲水。使水分子更容易地渗入细胞间隙，添加展着剂的目的是希望 促进电解质的溶解图6 表明，吐温2 0 不影响结果，高渗展着剂极显著地提高了相对 电导率，说明其渗透性极强，估计对细胞膜已造成伤害，细胞膜由于展着剂的破坏透