（核技术及应用专业论文）用于测定谷物中蛋白质含量及深度分布的核分析方法研究.pdf

用于测定谷物中蛋白质含量及深度分布的核分 析方法研究 核技术及应用专业 研究生罗小兵指导教师李泰华研究员 摘要 蛋白质是极其复杂的含氮有机化合物，是体现生命现象的物质基础，一切 生命活动均与蛋白质密切相关。蛋白质供给状况，直接关系到人们的身体素质 和智力水平，同时也是衡量一个国家经济和科学文化发达程度的重要标志。保 证蛋白质供应量、提高优质蛋白质供给水平是我国食品计划的主要任务之一， 而f 1 丽大多数动物蛋白的获得，是以消耗植物蛋自为基础，因此，提高植物蛋 白的产量是解决问题的关键。丌发培育高蛋白质含量、高蛋白质质量谷物品种， 保证堆位面积上蛋白质收获量的提高，是最具应用前景的方法之一。随着我囝 人口不断增加、人民生活水平的进一步提高，一方面要求消费更多粮食；而另 一方面，耕地面积和水资源逐年减少的趋势又不可逆转，在此情况下高蛋白质 含量、高蛋白质质量谷物品种的成功培育又具有特别的重要性，它通过提高稂 食的营养价值从而提高其使用价值，其意义与提高产量相同。 提高蛋白质含量、改善其蛋白质质量一直是谷物育种的一个重要方向，在 这一工作中，不管是对亲本的选择，还是对遗传源的确定，其第一步总是对种 子中蛋白质含量的测定。因此研究建立适合于谷物蛋白育种工作需要的蛋白质 含量分析检测方法具有重要意义。 在大规模的谷物蛋白质选种培育工作中，汇集了来自国内外的各种育种材 料，为了从中分离出有用的杂交组合或遗传变异体，需要分析的样品数量成千 上万；而在育种的早期，样品的种子量极为有限，育种学家可以分离出来用于 分析的种子只有几粒：同时由于谷物种子中蛋白质含量实际存在的极大的易变 性，因此对种子中蛋白质含量的测定及筛选方法有其相应要求：其一是快速、 价廉，以满足对成千上万个样品分析的需要；其二是能对小量样品进行分析， 即能实现对几粒种子样品的分析；其三最好能识剐基因型，从而在选种培育的 早期排除出非遗传因素造成的高蛋白含量的种子，减少育种学家的工作量，提 高选种效率。在众多的谷物蛋白含量测定方法中，基于“n ( d ，p ) ”n 核反应的 瞬发质子测量法由于其自身特点，可以很好满足谷物蛋白育种工作的需要，而 四川大学原子核科学技术研究所拥有1 2 m 回旋加速器，具有丌展用核反应方法 分析谷物蛋白质含量的设备条件。因此我们利用其产生的1 3 6 d e v 氘束，开展 了“用于测定谷物中蛋白质含量及深度分布的核分析方法研究”工作。 在谷物种子中主要是碳( c ) 、氢( h ) 、氧( 0 ) 、氮( n ) 四种元素，其中氮 元素的数目讵比于种子内蛋白质含量，而碳元素的数目可用来标记种子中干物 质的多少；因此蛋白质含量的测定实际上便转化为氮元素含量的测定，而氮、 碳元素比则可以很好表征谷物种子中蛋白质含量高低。当用回旋加速器产生的 1 3 6 m e v 的氘( d ) 束照射谷物样品时，氘与样品中碳、氧、氮元素发生氘质 子( d ，p ) 核反应，由于“n ( d ，p ) “n 核反应有更高的q 值，因此其产生的出射 质子能量更高，因而存在一个质子能量范围，不带入”c ( d ，p ) 。i c 、”0 ( d ，p ) ”0 反应产物的贡献，通过对来自于“n ( d ，p ) ”n 反应出射质子的甄别记录，可求得 样品中氮元素的含量：而由于带电粒子( 入射氘和反应产生的质子) 在物质中 的能量损失，因此不同深度发生的h n ( d , p ) ”n 核反应产生的出射质子能量 不同，记录的质子能量和离样品表面的距离之间存在有单值对应关系，因而利 用测得的出射质子能谱可以分析得到氮在样品中的深度分布。 本文基于核反应分析的基本原理，通过对谷物样品元素组成以及1 3 6b l e v 氘束与这些元素发生的核反应物理特性的分析，阐明了对蛋白质含量均匀分布 的谷物样品的最佳测量条件，对影响种子中蛋白质含量深度分布测定的相关因 素进行了分析计算。根据选种工作的实际需要，建立了相关设备。 以耐辐射、易于较正且长期稳定性好的的c s i ( n ) 晶体作为探测器，建立了 可长期使用的多角( 1 2 0 0 、1 5 0 0 、1 6 5 0 ) 多路c s i f n ) 探测器分析系统，通过对 氮、碳元素比的测定，实现了对蛋白质含量均匀分布的谷物样品中蛋白质含量 的快速甄别；采用谷物中蛋白质含量测定的标准方法一k 氏法对测量结果的正 i i 确性进行了验证，同时标定出了氮、碳元素比与蛋白质含量俺j 的转换关系；而 利用”c ( d , p ) 、1 6 0 ( d , p - ) 核反应微分截面的特点，建立了对样品中水分含量 的同步监测系统：利用建立的多角多路c s l ( 7 a ) 探测器分析系统对小麦、水稻、 油菜样品的氮、碳元素比进行了测定分析；同时在0 6 - - 5 m e v 质子能区，对 s t l 4 2 2 塑料闪烁体光输出随质子能量的非线性变化关系进行了测定，以便于用 s t l 4 2 2 塑料闪烁体( 发光衰减时间小于l n s ) 探测器替代c s i ( t i ) 探测器时对测 得质子能谱形状的分析。 采用多角多路探测器系统，每个角度的探测器功能单一，易于标定；而同 一角度环形设置多路探测器，可以迸一步提高样品分析速度；在分析过程中由 于只需记录探测器系统的定标器计数，因而数据处理简单，易于实现分析测试 过程的自动化，在3 5 0 n a 氘束流强照射下，5 秒种便可完成对一个谷物样品的 分析，很好满足了谷物蛋白育种工作中对分析速度的需求，而几粒种f ( 甚至 单粒) 的样品量都可采用该方法进行分析。 采用灵敏层厚度为3 r a m 的锂漂移金硅面垒型半导体探测器，研究建立了 对谷物种子中氮元素含量深度分布进行测定的能谱分析系统：采用a 放射源对 半导体探测器进行了能量刻度；采用1 3 6 m e v 氘束照射蜜胺( c 3 h 6 n 6 ) 薄靶， 研究确定了可用于深度分布测量的质子能区范围，并对来自于氮的出射质子的 能量分辨进行了测定。对记录能谱中质子能量( 即道数) 与氮深度的对应关系 进行了实验标定，实现了将测缛的质子能谱道数转换为其对应的氮元素深度； 而采用氮元素含量均匀分佰的厚标准样品靶，对其在1 3 6 m e v 氘束照射下的出 射质子谱进行测定，以其为标准归一消除“n ( d ，p ) ”n 核反应微分截面随能量变 化的影响，得到种子样品中氮元素的深度分布。采用建立的半导体能谱分析系 统对小麦种子中氮元素含量深度分布进行了测定，其有效分析深度可达3 0 0 z m ， 而深度分辨约2 5 u m ，完全可以将小麦的不同层次结构区分开，因而可用于谷 物颖果发育过程中不同形态部分氮元素( 蛋白质) 的存储转运规律研究、种子 中蛋白质分布与品种遗传相关性、环境因素对不同形态部分蛋白质含量的影响 研究等工作，并进而建立对基因型高蛋白种子的识别筛选方法。 关键词：蛋白质小麦育种深度分布核反应分析 i s t u d yo fn u c l e a ra n a l y s i sm e t h o df o rt h em e a s u r e m e n to f p r o t e i nc o n t e n ta n dd e p t hd i s t r i b u t i o ni ng r a i ns e e d s m a j o r ：n u c l e a rt e c h n i q u ea n di t sa p p l i c a t i o n n a m e ：l u ox i a o b i n gt u t o r ：l it a i h u a a b s t r a c t p r o t e i ni sa ne x t r e m e l yc o m p l e xn i t r o g e n o u so r g a n i cc o m p o u n d ，w h i c hi st h e s u b s t a n c eb a s i so fl i v i n gp h e n o m e n o n a n yl i v i n ga c t i v i t i e sa r ec l o s e l yr e l a t e dt o p r o t e i n t h e s u p p l ys t a t e o fp r o t e i oi s d i r e c t l y r e l a t e dt oh u m a nh e a l t ha n d i n t e l l i g e n c e s oi t i st h ei m p o r t a n ts i g no ft h ed e g r e et om e a s u r et h el e v e lo f e c o n o m ya n dc i v i l i z a t i o nd e v e l o p m e n tf o rt h ec o u n t r y ， s u p p l y i n gm o r ep r o t e i n a n di n c r e a s i n gt h eq u a l i t yo fp r o t e i n ，t h a ti so n eo fm a i nt a s ko ff o o dp r o g r a mi n o u rc o u n t r y a tp r e s e n t ，t h eo b t a i n o fa n i m a lp r o t e i ni s m o s t l y b a s e do nt h e c o n s u m p t i o no fp l a n tp r o t e i n s oh o wt oi n c r e a s et h eo u t p u to fp l a n tp r o t e i ni s t h ec r u xo ft h em a t t e r t h r o u g ht h eb r e e d i n go ft h eg r a i nv a r i e t i e sw i t hh i g h p r o t e i nc o n t e n ta n dh i g hp r o t e i nq u a l i t yt oi n c r e a s e t h ep r o t e i nh a r v e s tp e ru n i t a r e a ，t h a ti so n eo ft h em o s tp e r s p e c t i v em e t h o d a l o n gw i t h c o n t i n u o u s p o p u l a t i o ng r o w t h i no u r c o u n t r y a n dt h e i n c r e a s e m e n to fp e o p l el i v i n gs t a n d a r d ，o nt h eo n eh a n d ，i tr e q u i r e st oc o n s u m e m o r eg r a i n o nt h eo t h e rh a n d ，t h ea r e au n d e rc u l t i v a t i o na n dw a t e rr e s o u r c e sa r e g r a d u a l l yd e c r e a s e dy e a rb yy e a r t h et e n d e n c ym u s tn o tt a k eat u r nf o rt h ew o r s e f o rt h i sr e a s o n ，t h es u c c e s s f u lb r e e d i n go fg r a i nv a r i e t i e sw i t hh i g hp r o t e i nc o n t e n t a n dh i g hp r o t e i nq u a l i t yh a v ep a r t i c u l a ri m p o r t a n c e t h r o u g hi n c r e a s i n gn u t r i t i v e v a l u et oi n c r e a s ei t sr i s ev a l u e i t ss i g n i f i c a n c ei st h es a m ea st h a to fo u t p u t i n c r e a s e m e n t p l a n tb r e e d i n gp r o g r a m m e sf o ri n c r e a s i n gp r o t e i nc o n t e n ta n di m p r o v i n g p r o t e i nq u a l i t ya r ec o n f r o n t e dw i t ht h en e e df o rp r o t e i ns c r e e n i n g t h ef i r s ts t e p i v w i l la l w a y sb ep r o t e i nd e t e r m i n a t i o ni ns e e d s s oi t s i m p o r t a n tt oe s t a b l i s ha e a s ya n dr e l i a b l es c r e e n i n gm e t h o df o rp r o t e i n i n l a r g e s c a l eb r e e d i n gp r o g r a m m ，al a r g e n u m b e ro f s a m p l e s a r e c o l l e c t e d i no r d e rt os e p a r a t eu s a b l ec r o s sc o m b i n a t i o no rv a r i a n t s ，t h en u m b e ro f s a m p l e sn e e dt oa n a l y n i z ei st e n so ft h o u s a n d s m o r e o v e r ，i nt h ee a r l yt i m e ，t h es e e d a m o u n ti sl i m i t e d o n l yaf e wo fg r a i ns e e d sm a yb e s e p a r a t e df o ra n a l y s i s a tt h e s a m et i m e ，d u et ot h ee x t r e m ev a r i a b i l i t yo fp r o t e i nc o n t e n t i ng r a i ns e e d s ，t h e m e a s u r e m e n to fp r o t e i nc o n t e n ti ns e e d sa n ds c r e e n i n gm e t h o dh a v ec o r r e s p o n d i n g r e q u i r e m e n t s ：1 ) q u i c k ，l o wp r i c et os a t i s f yt h er e q u i r e m e n to fa n a l y s i sf o rt e n so f t h o u s a n d so ft h es a m p l e ；2 ) a n a l y s i sm a yc a r r yo u tf o ral i t t l ea m o u n to fs a m p l e ， t h a ti st os a y ，c a nb er e a l i z e df o raf e wo fg r a i n ；3 ) g e n o t y p ec a nb ed i s t i n g u i s h e d t h u s ，t h es e e d sw i t hh i g hp r o t e i nc o n t e n tc a u s e db yn o n - g e n e t i cf a c t o rm a yb e r e m o v e da tt h ee a r l yp h a s eo fb r e e d i n g s ot h ew o r kl o a dc a nb ed e c r e a s e d ，a n dt h e e f f e c t i v e n e s sf o rs e e ds e l e c t i o nm a yi n c r e a s e i nn u m e r o u sm e a s u r i n gm e t h o d so f g r a i np r o t e i nc o n t e n t ，t h e m e t h o db a s e do n 1 4 n ( d ，p ) 1 5 nn u c l e a rr e a c t i o nh a s i t sc h a r a c t e r i z a t i o n sw h i c hc a ns a t i s f yt h er e q u i r e m e n t sf o rg r a i nb r e e d i n g t h e r e i s1 ，2 mc y c l o t r o ni ni n s t i t u t eo fn u c l e a rs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yo fs i c h u a n u n i v e r s i t y t h ee q u i p m e n tc o n d i t i o ni sr e a d yf o re s t a b l i s h i n gt h en u c l e a rr e a c t i o n a n a l y s i sm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nc o n t e n ti ng r a i n s ob yu s i n gt h e ( d ，p ) n u c l e a rr e a c t i o ni n d u c e db y1 3 6 m e vd u t e r o ni ng r a i n ，w eb e g a nt h er e s e a r c h w o r kf o rt h em e a s r e m e n to fp r o t e i nc o n t e n ta n dd e p t hd i s t r i b u t i o n i n g r a i n s e e d s a n dt h ea n a l y s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e dt of i tt h er e q u i r e m e n t so fb r e e d i n g r e s e a r c hw o r k g r a i ns e e d sa r ec o m p o s e do ff o u rm a j o re l e m e n t s ：c a r b o n ，o x y g e n ，h y d r o g e n a n dn i t r o g e n n i t r o g e ni sm a i n l ye x i s t e di np r o t e i na n dt h ec o n t e n to fn i t r o g e ni n v a r i o u sk i n d so fp r o t e i ni sn e a r l yt h es a m e s ot h en i t r o g e nc o n c e n t r a t i o ni s c l o s e l yr e l a t e dt ot h ep r o t e i nc o n t e n to fs e e d s a st h ec a r b o nc o n t e n ti nt h em a j o r o r g a n i cm a t t e r so fs e e d ( p r o t e i n ，c e l l u l o s e ，s t a r c h ，s u g a re t c ) i sa b o u tt h es a m e ， c a r b o nm a ys e r v ea sa ni n d i c a t o rf o rd r yo r g a n i cm a t t e r s ot h er a t i oo f 1 4 n 1 2 c m a yi n d i c a t et h ec o n t e n to fp r o t e i ni ns e e d s w h e nt h eg r a i ns a m p l ew a si m p a c t e d v b yd e u t e r o nb e a m ，( d ，p ) r e a c t i o n sw i t hc a r b o n ，o x y g e na n dn i t r o g e nw e r ei n d u c e d d u et o “n ( d ，p ) “nn u c l e a rr e a c t i o nh a sm u c hh i g h e rqv a l u e ，t h ep r o t o ne n e r g y p r o d u c e di s m u c hh i g h e r ，t h u s ，t h e r ei sar a n g eo fp r o t o ne n e r g yw i t h o u tt h e c o n t r i b u t i o no fp r o t o n sf r o m ”c ( d ，p ) ”c ，“o ( d ，p ) ”0 b yd i s t i n g u i s h i n gt h e p r o t o n sf r o m “n ( d ，p ) ”nr e a c t i o n ，i tm a ye v a l u a t e t h ec o n t e n to fn i t r o g e n e l e m e n ti nt h es a m p l e d u et ot h ee n e r g yl o s so fc h a r g e dp a r t i c l e s ( i n c i d e n t d e u t e r o na n dp r o t o np r o d u c e d b yr e a c t i o n ) i ns a m p l em a t e r i a l ，t h ep r o t o n e n e r g yp r o d u c e db y “n ( d ，p ) “nr e a c t i o ni nd i f f e r e n td e p t hi sd i f f e r e n t t h ep r o t o n e n e r g yr e c e d e da n dd i s t a n c ed e p a r tf r o ms a m p l es u r f a c ea r ec o r i e l a t i v e t h u s ，b y u s i n ge n e r g ys p e c t r u mo fp r o t o nm a y o b t a i nn i t r o g e nd i s t r i b u t i o nw i t hd e p t hi nt h e s a m p l e t h r o u g ht h ea n a l y s i s o ft h ee l e m e n tc o m p o s i t i o ni ng r a i na n dp h y s i c a l c h a r a c t e r i z a t i o no fn u c l e a rr e a c t i o np r o d u c e db y1 3 6 m e vw i t ht h o s ee l e m e n t s ， t h e o p t i m u mm e a s u r e m e n t c o n d i t i o n sf o r g r a i ns a m p l e w i t h h o m o g e n e o u s d i s t r i b u t i o no fp r o t e i nc o n t e n ta r ee x p l a i n e do nt h eb a s i so fn u c l e a rr e a c t i o n a n a l y s i sp r i n c i p l e t h e r e l e v a n tf a c t o r si n f l u e n c i n gt h e d e p t h d i s t r i b u t i o n m e a s u r e m e n ti ns e e d sa r ea n a l y z e da n dc a l c u l a t e d c s i ( t 1 ) c r y s t a li su s e da sd e t e c t o r a n a l y z i n gs y s t e mw i t hm u l t i p l e a n g l e ， m u l t i p l e c h a n n e ld e t e c t o r sh a sb e e ns e tu p t h r o u g ht h em e a s u r e m e n to nt h er a t i o o fn i t r o g e na n dc a r b o n ，t h ep r o t e i nc o n t e n ti ng r a i ns a m p l ew i t hh o m o g e n e o u s p r o t e i nd i s t r i b u t i o nh a sb e e nd e t e r m i n e dq u i c k l y b ya d o p t i n gs t a n d a r dm e t h o df o r t h em e a s u r e m e n to fp r o t e i nc o n t e n ti ng r a i n km e t h o d ，t h ec o r r e c t n e s so ft h e m e t h o di sv e r i f i e d a tt h es a m et i m et h ec h a n g er e l a t i o n sb e t w e e nt h en i t r o g e n ， c a r b o nr a t i oa n dp r o t e i nc o n t e n th a sb e e nc a l i b r a t e d b yu s i n gc h a r a c t e r i z a t i o n so f d i f f e r e n t i a lc r o s s s e c t i o no f ”c ( d ，p ) ，1 6 0 ( d ，p ) r e a c t i o n s ，t h es y n c h r o n o u s m o n i t o rs y s t e mh a sb e e ns e tu pf o rt h ec h a n g eo fw a t e rc o n t e n ti ns a m p l e s b y u s i n gt h ea n a l y z i n gs y s t e me s t a b l i s h e d ，t h em e a s u r e m e n to fr a t i oo fn i t r o g e n a n d c a r b o ne l e m e n t sh a sb e e nc a r r i e do u tf o rw h e a t ，r i c ea n dr a p e i no u rm u l t i p l e - a n g l e ，m u l t i p l e c h a n n e ld e t e c t o rs y s t e m ，t h ed e t e c t o ra t e v e r ya n g l eh a ss i n g l ef u n c t i o na n de a s i l yc a l i b r a t e d a tt h es a m ea n g l e ，a n n u l a r l y m u l t i p l e - c h a n n e ld e t e c t o r sa r es e tu p ，t h a tm a yf u r t h e ri n c r e a s ea n a l y z i n gs p e e d f o rs a m p l e d u r i n gt h e a n a l y s i sp r o c e s s ，t h ed a t at r e a t m e n ti ss i m p l e ，s oi t i se a s y t or e a l i z ea u t o m a t i cf o ra n a l y z i n g u n d e rt h ei r r a d i a t i o no f3 5 0 n ad e u t e r o nb e a m c u r r e n t ，t h ea n a l y s i sf o ro n eg r a i ns a m p l em a yb ef i n i s h e dw i t h i n5s e c o n d s ，t h a t s a t i s f yt h er e q u i r e m e n to fa n a l y z i n gs p e e df o rg r a i np r o t e i nb r e e d i n gp r o g r a m m b yu s i n gs e m i c o n d u c t o rd e t e c t o r ，t h ee n e r g ys p e c t r u ma n a l y z i n gs y s t e mh a s b e e ns e tu p t h ed e p t hd i s t r i b u t i o no fn i t r o g e ne l e m e n ti ng r a i ns e e d sh a sb e e n m e a s u r e d b yu s i n ga s o u r c e s ，e n e r g y c a l i b r a t i o nh a sb e e nc a r r i e do u to n s e m i e o n d u c t i v ed e t e c t o r b yi r r a d i a t i n gt h i n n i t r o g e n o u st a r g e t w i t h1 3 ，6 m e v d e u t e r o n s ，t h ep r o t o n e n e r g yr a n g ew h i c hi ss u i t a b l ef o rt h em e a s u r e m e n to f d e p t hdi s t r i b u t i o nh a sb e e n d e t e r m i n e d t h ee x p e r i m e n tc a l i b r a t i o nw a sc a r r i e d o u tf o rt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e np r o t o ne n e r g y ( c h a n n e l s ) a n dn i t r o g e nd e p t h b y u s i n gt h i c ks t a n d a r ds a m p l e sw i t hh o m o g e n e o u sd e p t hd i s t r i b u t i o no fn i t r o g e n e l e m e a t t h ei n f l u e n c eo ft h ev a r i a t i o no fd i f f e r e n t i a lc r o s s s e c t i o nf o r “n ( d ， p ) ”n r e a c t i o nw i t he n e r g yw a se l i m i n a t e d ，a n dn i t r o g e ne l e m e n td i s t r i b u t i o n w i t hd e p t hi ns e e ds a m p l ew a s to b t a i n e d b yu s i n gt h ee n e r g ys p e c t r u ma n a l y z i n g s y s t e me s t a b l i s h e d ，t h en i t r o g e nd e p t h d i s t r i b u t i o ni nw h e a ts e e dh a sb e e n m e a s u r e d t h ee f f e c t i v ed e p t ho fa n a l y s i si sa b o u t3 0 0 m ，a n dt h ed e p t hr e s o l u t i o n i sa b o u t2 5 , u m i ti se n o u g ht od i s t i n g u i s ht h ed i f f e r e n tp a r t so fw h e a ts e e d s oi tc a n b eu s e df o rt h ei n v e s t i g a t i o no ft h ec o r r e la t i o n sb e t w e e nt h ed e p t hd i s t r i b u t i o no f p r o t e i na n dt h eg e n o t y p i cc h a r a c t e r sf o rg r a i n s k e yw o r d s ：p r o t e i n ，w h e a t ，b r e e d i n g ，d e p t hd i s t r i b u t i o n ， n u c l e a rr e a c t i o na n a l y s i s i 论文申明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川i 大学所有，特此声明。 四j | i 大学博士擘侥论文 第一章引言 1 1 研究工作的目的意义 蛋白质是极其复杂的含氮有机化合物，是体现生命现象的物质基础，一切 生命活动均与蛋白质密切相关。蛋白质供给状况，直接关系到人们的身体素质 和智力水平，同时也是衡量一个国家经济和科学文化发达程度的重要标志“1 1 。 保证蛋白质供应量、提高优质蛋白质供给水平是我国食品计划的主要任务之一， 而目前大多数动物蛋白的获得，是以消耗植物蛋白为基础“1 ，因此，提高植物 蛋白的产量是解决问题的关键。丽开发培育高蛋白质含量、高蛋白质质量谷物 品种，并将其引入到生产中来，是最有前景的方法之一“3 。 随着我国人口不断增加、人民生活水平的进一步提高，一方面要求消费更 多粮食：而另一方面，耕地面积和水资源逐年减少的趋势又不可逆转，在此情 况下高蛋白质含量、高蛋白质质量谷物品种的成功培育又具有特别的重要性， 它通过提高粮食的营养价值从而提高其使用价值，其意义与提高产量相同9 。 在高蛋白谷物育种中包括两个基本的环节1 ：一是创造所需要的遗传变 异，如采用杂交、射线诱变、遗传工程等方法创造变异子体；一是选择优良变 异，即建立对谷物中蛋白质含量测定和筛选的方法，优选出我们需要的高蛋白 变异子体，并通过反复栽培筛选试验得到遗传稳定的优良品种和晶系。在这一 育种工作中，不管是对亲本的选择，还是对遗传源的确定，其第一步总是对种 子中蛋白质含量的测定。因此建立适合于高蛋白谷物育种工作需要的蛋白质含 量测定方法对于育种工作的成败具有重要意义。 1 2 高蛋白谷物育种研究中对蛋白质含量测定方法的要求 对谷物中蛋白质的研究已有近百年历史，对影响小麦水稻谷物种子中蛋白 质含量的各种因素有很多论述“”。已有的研究表明：小麦水稻种子中蛋白质 的含量属于数量性状，是遗传因素与环境因素相互作用的结果，其中环境因素 ( 土壤、施肥水平、施肥时间、气候条件及栽培条件等) 对蛋白质含量的影响 巨大。如果定义蛋白质含量为种子中蛋白质重量与种子中干物质( 水分除外) 重量之比，则单粒种子中蛋白质含量经历着极大的可变性，氮肥施用水平、气 四川大学博士学位论文 候环境条件、甚至是在谷穗中所处位置，都会极大影响其蛋白质含量，所以， 选种过程的最初阶段，不恰当地力图进行高精确度的分析，有损于其分析效率 和它们的价值；对选种过程的大多数阶段，测量蛋白质含量的随机误差为4 5 ( 相对的) 便能满足需要。而正是由于谷物中蛋白质含量实际存在的易变性， 大大降低了对这一性状进行选择的可靠性和效率，为了分离出由遗传因子决定 的高蛋白含量种子，需要对大量选种材料进行反复筛选，其工作量极其繁重同 时又极费时。更为困难的是对禾本科作物，由于蛋白质含量和谷物产量之间大 多呈现一种负相关关系，如果只根据蛋白质含量进行筛选，得到的往往是谷粒 干瘪、产量很低的种子，因此要培育出有生产价值的高蛋白品系，必须在正常 产量的谷物种子中选择，这就需要考查更多杂交组合和人工变异体，如果再对 其予代中蛋白质积累规律性加以监测，则需要对其蛋白质含量进行分析的样品 数量成千上万，而给予该项分析工作的时问是有限的。特别是冬季作物，很重 要的是在从收割到播种不多时间内作出评价。而且在育种的第一阶段，样品的 种子量是极有限的，对个别的种子，育种学家可以分离出来用于分析的种子只 有几粒。因此在高蛋白小麦等谷物育种工作中，要求建立的筛选手段必须有快 速、准确、价廉、能对少量样品中蛋白质含量进行分析的特点，如果能在选种 培育的早期排除由非遗传因素造成的高蛋白含量的种子，则可以大大减少育种 学家的工作量，极大地提高选种效率。 同时在小麦颖果的不同形态部分之间，蛋白质的分布，在数量上是不均匀 的，而影响小麦营养品质的最重要的氨基酸一赖氨酸，在颖果的不同部位蛋白 质中的含量也不相同，有文献报道“：蛋白质在小麦颖果中的分布由外向里， 依次为：壳层蛋白质浓度约为4 ，糊粉层蛋白质浓度约为2 0 ，胚乳外层约为 1 3 7 ，胚乳中层约为8 8 ，胚乳内层约为6 2 ，胚胎蛋白质浓度约为3 3 3 ； 糊粉层蛋白质中赖氨酸含量约为4 6 ，胚乳蛋白质中赖氮酸含量约为1 7 ，胚 胎蛋白质中赖氨酸含量约为8 4 。在颖果发育过程中，不同形态部分蛋白质形 成时间不同，其蛋白质的结构、化学组成和功能有本质区别。对于种子中蛋白 质含量( 实际上是整粒种子中蛋白质平均含量) 与品种遗传、环境因素相关性 研究有很多“7 + 2 “，然而对于颖果发育过程中不同形态部分氮元素( 蛋白质) 的 存储转运、种子中蛋白质分布与品种遗传相关性、环境因素对不同形态部分蛋 白质含量的影响等问题尚缺乏研究，原因在于实际上没有快速检测蛋白质在谷 2 四川大学博士学位论文 粒中体分布的方法。”1 。如果能建立对小麦、水稻颖果中氮元素( 蛋白质) 分 布特性进行快速检测的方法，不仅可以对上述问题进行系统研究，还有可能分 化出二个别具特色的选种任务：其一是利用蛋白质体分布信息高效率地筛选基 因型高蛋白谷物种子，这是由于在颖果发育过程中，不同形态部分蛋白质形成 时间不同，因此环境因素对各层的蛋白质含量的影响不同，种子中受环境因素 影响最小的最稳定层蛋白质含量，可以认为主要由遗传基因决定，以该层蛋白 质含量为标准，自然可以选出遗传性好的基因型高蛋白种子。其二是利用赖氨 酸在种子的不同形态部分蛋白质中的含量不同特点，采用蛋白质体分布信息可 以间接筛选高赖氨酸谷物品种。而这对于在育种中高效率地选育出高蛋白质、 高赖氨酸优质谷物品种将具有实际应用价值。 1 3 谷物中蛋白质含量测定方