（纺织材料与纺织品设计专业论文）羊毛角朊蛋白膜的高性能化和表征.pdf

羊毛角朊蛋白膜的高性能化及表征 摘要 羊毛角朊是一种生物蛋白，由2 0 多种q 氨基酸组成，以皮层细胞形式存在于 基质和微原纤中，占羊毛总成分的9 5 。羊毛角朊蛋白包括中长蛋白、高或超高 硫蛋白、高一氨基乙酸一酪氨酸蛋白三类。羊毛角朊中二硫键交联形成的网状结构给 其再利用带来一定难度。 本课题的目的是得到一种高性能的角朊蛋白膜，无毒、无污染、高纯度，具有 一般的机械性能和较好柔软性。分为几个部分：将羊毛中的角朊成分提取出来，主 要问题是将二硫键打破同时又不破坏大分子主链；得到具有一定性能的羊毛角朊 膜，并探讨成膜工艺与膜的各种性能之间的关系；采用各种方法对角朊膜进行表征， 了解角朊膜的结构；进行多孔膜制备的探讨。 本论文阐述了以下几项研究工作： 进行溶解方法的筛选，在简单的实验研究的基础上，采用无机盐n a 2 s 2 0 5 以 及其他试剂混合与羊毛作用，选用主溶剂浓度、助剂浓度以及溶解温度作为主要因 子，以溶解率和分子量分布作为目标因子，进行正交实验，采用直观方法，a n o v a 过程以及平衡理论进行分析得到最优的溶解工艺。 采用延流法成膜，研究不同成膜工艺参数( 增塑剂含量以及成膜温度) 和最终得到的角朊致密膜机械性能( 包括延伸性能、弯曲性能、压缩性能) 之间的关系，分析得到最优的成膜方案。同时给出角朊致密膜的基本性能指 标。 运用紫外光谱以及傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 技术对羊毛、角朊蛋白溶 液以及角朊蛋白膜进行分析。对角朊蛋白溶液的分析得到其浓度的标定曲线，对角 朊致密膜的透光度以及紫外吸收情况分析得出其为透明膜并且透明度随成膜工艺 会有所变化，角朊膜同时也具有吸收紫外线功能。比较羊毛与角朊膜的红外光谱图 以及不同还原剂处理得到的角朊蛋白膜的红外光谱图，得到它们间的结构异同。 使用d s c 、d m a 、x r a y 以及s e m 表征羊毛角朊蛋白膜的内在结构 以及外观结构。纯羊毛角朊膜的玻璃化转变峰值在9 0 2 。c ，但含有甘油的羊 毛角朊膜的玻璃化温度在7 2 0 c 到7 9 0 c 之间，玻璃化转变区非常宽。d m a 结 果表明其玻璃化温度在1 0 8 0 c 左右。增塑膜的熔融温度在2 0 0 0 c 附近。广角 x 射线衍射的结果表明在4 2 1 0 0 a ，9 9 2 7 8 a ，1 4 1 4 6 3a 三处具有明显的衍射 峰。采用拟合分峰的方法计算不同甘油含量的角朊膜的结晶度在2 9 4 0 之 间。甘油会使角朊膜的结晶度降低。 角朊膜有相对均匀光滑的正表面，在背面存在蛋白质碎片。横截面的s e m 照片表明，致密角朊多孔膜具有许多纳米孔隙。 采用冷冻干燥法得到羊毛角朊多孔膜，并且探讨孔径大小以及孔隙率与冷冻 温度以及溶液浓度之间的关系。 关键词：羊毛，角朊蛋白，膜，分子量分布，形态结构，力学性能，结晶 p r e p a r a t i o no f h i g hq u a l i t yw o o lk e r a r t i n f i l ma n di t sc h a r a c t e r i z a t i o n a b s t r u c t w 6 0 lk e r a t i ni sak i n do fa n i m a lp r o t e i n w h i c hi sm a d eu po fm o r et h a n2 0k i n d so f a l p h aa m i n oa c i d s i te x i s t sa m o n gm a t r i xa n dm i c r o f i b r i l i nt h ef o r mo fc o r t e xc e l l i ti s am a i nc o m p o n e n ti nw o o la si tc o u n t so nn e a r l y9 5 w o fw 0 0 1 w 0 0 1k e r a t i nc o n t a i n s t h r e es o r t so fp r o t e i n ：i n t e r m e d i a lp r o t e i n ，h i g ho rs u p e r - h i g hs u l p h u rp r o t e i n ， h i g h - g l y c i n e - t y r o s i n ep r o t e i n t h em a i nd i f f e r e n c eb e t w e e nw o o lk e r a t i na n do t h e r p r o t e i ni st h a tw o o lk e r a t i nh a sah i g hc o n t e n to fb i s u l f i d eb o n d ，w h i c hc a nm a k ew o o l f i b e rt of o r maw e bs t r u c t u r e b u tt h es t r u c t u r em a k e st h eu t i l i z i n go fw o o lk e r a t i n b e c o m ed i f f i c u l t t h ek e ya i mo ft h et h e s i si st og e tak i n do fh i g hq u a l i t yw o o lk e r a t i nf i l mw i t h n o n p o i s o n ，h i g hp u r i t y , a n dm e d i a t em e c h a n i c a lp r o p e r t i e sa n dg o o ds o f t n e s s t h e g e n e r a lc o n t e n t sa r et og e tk e r a t i nf r o mw o o lw i t hl e s sd a m a g eo fp r o t e i nm a i nc h a i n s ， t h e nt og e tak i n do fk e r a t i nf i l ma n dd i s c u s st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep r o c e s s t e c h n i c sa n dt h ep r o p e r t i e so ff i l m s ；t oc h a r a c t e r i z et h er e s u l tk e r a t i nf i l ma n d u n d e r s t a n dt h ei n n e ra n do u t e rs t r u c t u r e so ft h ek e r a t i nf i l m t h el a s tp a r to ft h et h e s i si s t od os o m er e s e a r c h e so nt h ep r e p a r a t i o no fp o r o u sk e r a t i nf i l ma n dc h a r a c t e r i z a t i o no f p o r o u s t h ef o l l o w i n gr e s e a r c ht a s k sa r ed o n ei nt h et h e s i s ： mo p t i m i z e dm e t h o dt or e s o l v ew o o li sd i s c u s s e d o nt h eb a s i so fm a n ys i m p l e e x p e r i m e n t s ，n a 2 s 2 0 5a n do t h e ra g e n t sa r em i x e dt o g e t h e rt or e a c tw i t hw 0 0 1 i nt h e p r o c e s s ，a no r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g ni su s e d ：c o n c e n t r a t i o no fn a 2 s 2 0 5 a n du r e a ， t e m p e r a t u r ea r et h em a i ne f f e c t i v ef a c t o r s ；e x t r a c t i o np e r c e n t a g ea n dm o l e c u l a rw e i g h t d i s t r i b u t i o na r et w od e c i s i v ef a c t o r s ；n o r m a lm e t h o d ，a n o v ap r o c e s s ，a n db a l a n c e t h e o r ya r eu s e dt oa n a l y z ef o ra no p t i m i z a t i o nm e t h o d t h es i m p l es p r e a d i n ga n df l o w i n gm e t h o di su s e dt og e tac o m p a c tk e r a t i nf i l m ，a n d a tt h es a m et i m e ，s t u d yi sc a r r i e do nh o wt h ep a r a m e t e r s ( c o n t e n to fg l y c e r i na n d f o r m i n gt e m p e r a t u r e ) i nt h ep r o c e s sa f f e c tt h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，l i k ee l o n g a t i o n ， b e n d i n g a n dc o m p a c t i n gp r o p e r t i e s a l s ot h eb a s i cp a r a m e t e r sa b o u tt h ef i l m sa r et e s t e d a c c o r d i n gt os t a n d a r dm e t h o da n dg i v e n w o o l ，w o o lk e r a t i ns o l u t i o na n dt h er e s u l tf i l m sa r et e s t e db yu v - v i r - n i ra n df t i r t e c h n i q u e ac u r v ef o rc a l c u l a t i n gt h ec o n c e n t r a t i o no ft h es o l u t i o ni sg o t t e n ；a n a l y s i si s t a k e no nt h et r a n s m i s s i o no fk e r a t i nf i l ma n dt h ea b s o r p t i o no fu vw i t hr e s u l t st h a t k e r a t i nf i l mi sa t r a n s p a r e n to n ea n di th a sa b i l i t yt oa b s o r bu v d i f f e r e n ts t r u c t u r ea n d c o m p o n e n ta n a l y s i sb e t w e e nw o o la n dk e r a t i nf i l ma r ea l s oc a r r i e dt h r o u g h f t i r d s ct e c h n i q u ei su s e dt og e tt h et h e r m a lp r o p e r t i e so fk e r a t i nf i l ma n dg e tt h e c o n c l u s i o nt h a tt h eg l a s st e m p e r a t u r eo fp u r ek e r a t i nf i l mp e a k sa t9 0 2 。c ，b u tt h a to f f i l m sc o n t a i n i n gg l y c e r i nr a n g ef r o m7 2 。ct o7 9 0 cf o rd i f f e r e n tf o r m i n gt e c h n i q u e ，a n d m e l t i n gt e m p e r a t u r ei sn e a r2 0 0 0 c t h ed m a m o d eo fd y n a m i ct h e r m a lm e c h a n i c a l a n a l y z e rs h o w st h a tt h eg l a s st e m p e r a t u r ep e a k sa t10 8 0 c w i d ea n g l ex - r a y d i f f r a c t i o n ( w a x d ) s h o w st h a tk e r a t i nf i l mh a st h r e ed i s t i n c t d i f f r a c t i o np e a k sa t4 210 0 a ， 9 9 2 7 8 a ，14 14 6 3aa n dt h a tt h ec r y s t a l l i n i t yo fk e r a t i nf i l md i f f e r sf r o m2 9 t o4 0 a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tc o n t e n to fg l y c e r i n g l y c e r i nc a nm a k ec y s t a l l i n i t yl o w e r t h e o u t e ra p p e a r a n c ef r o ms e m p h o t o g r a p hs h o w st h a tt h ef r o n ts u r f a c eo fk e r a t i nf i l mi s s m o o t h e rt h a nt h eb a c ks u r f a c eo fi t t h ec r o s ss e c t i o no fk e r a t i ns h o w ss m a l lp o r o u si n n a n os c a l e o p o r o u sk e r a t i nf i l mi sg o t t e nt h r o u g hl o wt e m p e r a t u r ef r e e z i n ga n dt h e nv a c u u m d r y n e s sm e t h o d r e l a t i o n s h i pb e t w e e np a r a m e t e r so fp o r o u sa n dt h ec o n d i t i o no f f o r m i n gi sd i s c u s s e d a u t h o r ：y a n w e it a n g s u p e r v i s e db y ( t e x t i l em a t e r i a l s ) p r o f w e i d o n gy u k e yw o r d s ：w o o lk e r a t i nf i l mm o l e c u l e w e i g h t d i s t r i b u t i o n s t r u c t u r e & p r o p e r t yc r y s t a l l i n i t y 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的 内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名：穸为熬；辛7 日期： 2 矿口立年 z 月 ，7 日 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人 授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密瓯在i 鱼年解密后适用本版权书。 不保密 - ? 。 学位论文作者签名： 夕南趣韦 日期：2 。岁年，2 月门日 指导溯签名：勺弼 一， 醐w 钧7 日 第一章羊毛角朊蛋白的研究与发展 第一节简介角朊蛋白 、简述角朊蛋白 1 、角朊的定义【1 t2 3 】 角朊( k e r a t i n ) 又称角蛋白，原系解剖学名称，是一种特殊形式的线形蛋白， 它是脊椎动物表皮层的主要成分，包括动物的保护性表皮( 如毛皮、羊毛、头发、 羽毛，皮肤) ，及动物的外部附属物( 如爪、喙、角、指甲、翎毛等) 。其组成元 素为c 、h 、o 、n 、s 。从分子的角度看，角朊最大的特点为富含胱氨酸残基( 约 占整个氨基酸残基数量的7 - - - 2 0 ) ，它们使角朊结构得以稳定存在。羊毛角朊微 原纤即低硫角蛋白碎片主要组成成分，大多数包含硫的氨基酸残基都是位于既含 有氨基n 又含有羧酸端基c 的区域。用简单的模型来表示还原角朊，它是在两 端拥有很多活性s h 基团蛋白单分子，如图1 1 所示。其中粗细实线分别代表螺 旋区和非螺旋。大多数半胱氨酸胱氨酸位于氨基端n 或者羧基端c 。 n 端 ； i 一约4 0 n m i c 端 二 j u 2n 尸姐 i ；i l i|；| 总合 ； ! 氨基酸个数 5 51 5 92 71 2 94 64 1 6 一s h 一s s 一数量 840492 5 - s h - s s - 含量 1 4 52 5o3 11 9 63 9 7 图1 1 羊毛角朊中的低硫蛋白碎片主要成分的胱氨酸和半胱氨酸的分布 2 、角朊的分类 通常角朊可分为两类：软角朊( 主要存在于皮肤和其他一些组织中) 和硬角 朊( 如头发、羊毛、羽毛、指甲、角、喙) 。这种角朊的“软 与“硬”是根据胱 氨酸含量来划分的，硬角朊相对富台胱氨酸包含大量的二硫键和常见的各种氨 基酸：软角朊包台甚少或几乎不含胱氨酸，但富含侧链氨基酸，如氨基醋酸、丙 氨酸、丝氪酸等。 角朊根据肚链形状还可分为角朊和b 角朊。洳角朊的特点是在正常不拉伸 的情况下其肽链是处于非弯曲的、回线形的状态；而在拉伸的情况下，它们可 能由q 型转变为伸直的p 型，即变为d 一角朊，如图1 2 所示。n 角朊和b 角朊广 角x 一光衍射图具有明显不同的特点。小角朊的反射特点是在子午线上有o1 5 n m 和05 1 n m 两个衍射弧，在赤道处为0 9 4 n m 的衍射弧：而b 一角朊的反射特点是 在于午线上有0 3 3 n m 和0 4 6 r a n 的两个衍射弧，在赤道处为o9 4 n m 的衍射弧， 如图1 3 所示。 ：( c hr 爻 。 k c h r。矿 a h1 - 2 口角朊变为b 角肌的图解 圉i - 3 小角朊和争角朊的x 光衍射图 昔。 。靠 。 ”。 e 、 c 3 、角朊的性质 角朊是一种复杂的蛋白质化合物，当被酸或碱水解后，最终生成氨基酸。角 朊是由2 0 多种a 氨基酸缩合而成的大分子。各种氨基酸( 除脯氨酸) 的通式为： i 洲2 一一0 0 h 不同的氨基酸r 基不同。a 氨基酸缩合而成的大分子基本形式为： i i i i i i甲f i2 斤 甲i n 一苫可一n 一王一c i ! ：l1 旷 县，h i ! i上苫3直 角朊大分子间还存在以下几种交联形式： 二硫键( 胱氨酸键) 分子式 盐式键分子式 氢键分子式 c oc o 川川 j c i p 叽一s s 一叽弋_ c o c o n hh n c 一胱嫩键幽 仁硫键) i 州h 妒q 吨m 一鸭+ 叫q 叫 的 州一 qn 击 州m 竹 仆州州一虬刊 h h n c = = = o 夕一伊“h n r c h h r 一h o c 各种交联使角朊大分子形成一坚牢网状结构，不溶于水，在热水中仅能稍微 膨化，不溶于稀酸和碱，不被一般的胃蛋白酶所消化，尤其对硬角朊来说可使它 拥有坚韧、耐久、不易降解，弹性好，稳定性好等优良的机械性能。 4 、角朊的优点 角朊来源广泛，在日常生活中随处可见，食品工业养鸡场的鸡毛，纺织工业 的羊毛废弃物，理发店的废弃头发等；角朊拥有很好的机械性能( 如上所述) ， 使它在很多生物结构中起基本的结构作用，这也是目前工业和消费用的各种材料 所需拥有的性能；角朊化学性能优良，优于许多化合材料；角朊的环保性是其最 大的特征，可用于开发绿色环保材料。 二、羊毛角朊的优缺点 羊毛角朊除了具有上述角朊共性外，自身还具有很多特点。 羊毛组成中有9 5 的是线性蛋白的角朊或称角蛋白( k e r a t i n ) ，以皮层细胞 形式存在，见图1 4 。 羊毛角朊分为中长蛋白、高或超高硫蛋白、高一氨基乙酸一酪氨酸蛋白三类。 中长蛋白是一种典型的高摩尔重量( 4 5 6 0 l ( d ) 的蛋白质，约占羊毛重量的5 8 9 6 ， 约含6 的胱氨酸，分子大部分是螺旋结构；高或超高硫蛋白质，约占羊毛的2 6 9 6 ， 为球状结构，摩尔重量为1 0 4 0 k d ，含超过3 0 的胱氨酸；高一氨基乙酸一酪氨酸 蛋白占羊毛重量的6 ，摩尔重量约为1 0 k d ，主要包含氨基乙酸、酪氨酸。除角 朊外，羊毛还含有极微量的动物胶朊、色素及灰分，这对提取纯净的羊毛角朊会 有一定的影响。角朊与胶原质、蚕丝蛋白以及其他的结构蛋白有明显的不同，因 为它的胱氨酸( s s ) 和半胱氨酸残基( - s h ) 的含量很高，占所有的氨基酸残 基的7 - 2 0 m 0 1 ，其胱氨酸和半胱氨酸的比值约为1 ：4 。 羊毛中各元素的含量为：c ：4 9 0 5 2 o ，h ：6 0 8 8 ，n ：1 4 4 - - 2 1 3 ， o ：1 7 8 - 2 3 7 ，s - 2 2 5 4 ，灰分：0 1 6 1 0 1 。可见，羊毛的含硫量非常大， 且硫在羊毛中主要存在于胱氨酸和蛋氨酸中，硫硫原子间形成强二硫键，这是羊 毛区别于其他纺织纤维的最大特点。 但是羊毛角朊中既含酸性基( c o o h ) ，又含碱性基( 胺基n h 2 ，亚胺基 _ n h ) ，故对碱性或酸性试剂不太稳定。 4 这样，羊毛的高胱氨酸含量使其形成强二硫键而结构稳定，但同时给羊毛角 朊的再利用带来许多难题，如何将二硫键打破而不破坏蛋白质主链，使角朊从羊 毛中最大限度的提取出来，或进一步分解为各种氨基酸再利用已成为羊毛角朊再 利用的关键问题。 图1 4 羊毛角朊的结构图 第二节羊毛溶解及角朊蛋白膜的研究现状 羊毛作为一种天然蛋白质纤维，细、软、弹性好、保暖、吸湿保湿、不易玷 污、光泽柔和、与人体皮肤具有亲和性，已为几千年人类的使用所肯定，是重要 的、高档的纺织原料。但其中粗( 单纤维直径 3 0um ) 、短( 纤维长度 6 c m 的细毛和半细毛只有2 1 4 6 万吨。 剩下的大量的粗短毛不能满足纺织用而被废弃。国外亦是如此，世界范围内年废 弃量为4 0 ( 包括废弃纺织品) ，销毁困难，污染环境。如何有效处理和积极利 用这一资源，是亟待解决的资源和生态问题。 近2 0 年来，应该说人们已在羊毛或其他天然角蛋白物质的回用或再生利用 上作了许多工作。尤其后者如重金属捕捉剂、化妆品添加剂、食品的覆层和添加 剂，头发护理剂，衣物整理剂，药用及医用组织工程材料等。但大多数系用碱或 强酸溶解得到的分子量较低的物质，作为生物材料或再生纤维都不太适宜。 一、羊毛溶解与制备技术的研究 1 、羊毛溶解的研究与进展 ( 1 ) 强碱和强酸 国外，很早就有学者研究羊毛的溶解，最初认为只有强碱【4 6 1 、强酸7 矗9 】 或硫代羟基化合物、或硫化物的碱性溶液可溶解羊毛，生成氨基酸或多肽【l o 1 1 】。 若采用有机酸预处理角朊材料，可降低角朊分子破坏量，提高角朊的溶解性 1 2 】。 ( 2 ) 氧化法 氧化法是指采用氧化剂将羊毛浸入碱性溶液而得到0 c 角朊蛋白的一种方法。 该方法中心反应是将二硫键氧化成两个硫磺酸基，碱性溶液的作用是使产物稳 定。提取过程见图1 5 所示。反应中可加入其它助剂，将氢键打破而帮助羊毛膨 胀。氧化法使用试剂多为过氧化物，主要分为过氧酸和过氧化氢两类，其中过氧 酸本身具有腐蚀性，其工业可及性较差【1 3 ，1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 】；过氧化氢价格便宜且反 应最终产物为水，被看作为最佳试剂，但其反应剧烈，较难控制其水解程度，得 到的蛋白质也部分变性，主链破坏的程度较大【1 9 ，2 0 1 。另外有学者用其他的氧化 液( 卤化异氰酸、润湿剂、氢施体) 来处理羊毛，能以很小的液固比将羊毛均匀 氧化得到角朊蛋白溶液【1 8 】。 ( 3 ) 还原法 还原法多用2 巯基乙醇和2 巯基乙酸进行反应，主要原理是将二硫键转变 为s h ，但s h 在空气中极易被氧化重新形成二硫键，须采取一些措施防止s h 的氧化，加入甲基碘化物或醋酸碘或者加入硫代羟基乙酸使其甲基化或羧甲基化 而永久变性【2 1 1 ，从而阻止自由的半胱氨酸变为二硫键，这样最大的缺点是使角 朊永久变性；使用表面活性剂( s d s ) 来形成胶束保护【2 2 】：用有机酸将其酸化沉 淀【2 3 ，2 4 】；与金属盐接触形成复杂的盐【2 5 】；可以具有特定结构的阳离子试剂反应 2 6 1 ；将反应体系和空气、氧气隔绝，如可将整个反应体系放在氮气中”1 。这些 6 方法的唯一缺点是产品中会残留剧毒2 巯基乙醇。还原方法的提取示意图见图 1 6 。 图1 5 氧化法提取角朊示意图 图1 - 6 还原法提取角朊示意图 7 ( 3 ) 还原硫磺化法 还原硫化方法是用硫化物( 亚硫酸氢钠、亚硫酸钠以及硫代硫酸钠) 来处理 羊毛，实际上也是一种还原的方法，其将原角朊中的二硫键转变为s h 和 s s 0 3 - n a - ，经分馏可以得到两种可溶角朊蛋白，s 磺酸盐角朊连续长丝蛋白以 及s 磺酸盐角朊高硫蛋白。这种方法的最大优点是中间的反应液可以不断地重 复使用，且反应用试剂价廉，故可以降低耗费以及环境污染，可进行大规模的生 产，但制取率不高，需工艺优化。硫磺化提取角朊的示意图见图1 7 。 图1 7 硫磺化法提取羊毛角朊的示意图 此外，还可用物理、微生物方法来提取角朊。物理方法，包括高压球粉碎方 法1 2 8 】、高压蒸汽水解法【2 9 】、机械和菌类结合法【3 0 1 ，机械和超生波结合法，一般 设备和能源昂贵，且对角朊主链破坏很大，实用性较差；微生物的方法，是一种 绿色环保的方法，目前己引起很多学者的关注【3 1 3 2 ，3 3 ，3 4 3 5 3 6 ，3 7 - 3 8 t3 9 1 。相对来 说，国内外学者较多用化学方法提取角朊，其最大缺点是化学药剂很多具有毒性 或腐蚀性，反应过程中还可能产生有害气体；另外，反应通常是在酸性或碱性条 件下进行，很难控制溶液在中性条件下。 综上所述，羊毛溶解方法的研究，各有利弊。从满足生态环境和能源的角度 看，采用无毒、无腐蚀性试剂，条件温和的溶剂及溶解方法还存在一定难度。 8 2 、羊毛角蛋白溶液的制备技术及进展 溶解液需经过滤或透析得可用蛋白质溶液，过滤多用不同目数的过滤筛进 行，可加压或加离心方法；透析通常用透析袋对蒸馏水或浓度较低的溶液进行， 以去除不溶物和部分小分子。生化产品制备上还采用超滤力口压膜分离技术可高 效去除小分子溶剂和氨基酸多肽，是对透析法的改进。其他还有利用蛋白质等电 沉淀得到角朊粉末或固体后再行溶解：或利用蛋白质盐析性质分离再溶解；或用 凝胶层析法分离蛋白。 二、羊毛角蛋白膜的制备与性能优化研究 l 、羊毛角蛋白膜的制备技术及进展 用角朊溶液制取角朊蛋白膜多采用三类方法。一是溶液浇铸法即将均匀的角 朊蛋白溶液，倾倒在经过严格选择的平整玻璃板上，制或铺展成一定厚度的均匀 液层，然后干燥形成薄膜【4 0 】。二是湿法成膜法即角蛋白溶液淋膜进入凝固液， 凝固形成膜。三是热压法，即将角朊粉术与水混合后放在加热夹板之间，并施以 高压，冷却后得到均一无粉术的角朊蛋白膜【4 。这些方法得到的为均质膜。 对多孔膜的研究较晚，起初是混入气泡成膜，但孔隙过大影响强力。后有将 丙烯腈( 或其他单体) 接枝到还原角朊材料上，用尿素净洗未反应的还原角朊， 使膜中形成孔洞，得到可超滤的多孔膜【4 引。还有将硫磺化角朊粉末、尿素以及 n a c l 微粒在尿素的熔点以上压膜成型，然后在水中去除盐和尿素得多孔膜，可 控制盐微粒的大小来控制孔洞大小及孔隙率【43 1 。这两种方法属成孔剂析出法，简 单易行，但是孔的形状不规则，易残存成孔剂。近年来有冷冻法制备多孔膜【44 。 2 、角蛋白膜性能的优化 不加任何增韧、增塑剂的角朊膜脆性大，伸长小，湿强低，水中易膨胀，应 用价值极低。主要改善方法是：增韧，加入适量的增塑剂或直接浸入增塑剂溶 液中【4 5 】或两种方法同时进行：交联增强或加入酸、还原剂使强力增大；改善 吸水性，加入壳聚糖可使拒水性降低【4 6 】；渗透性优化，可加入二价或多价脂肪 醇；增大分子量和分子间的缠结。 3 、羊毛角蛋白膜的基本应用 角朊膜材料，可用于包括组织工程结构材料，渗透、分析，分散、超滤和离 9 子交换膜，移植基体和细胞胶囊等许多方面。因此作为生物组织工程用料许多问 题还未解决。 第三节本课题的选题和研究方向 一、课题的研究背景和意义 1 、研究背景 纵观羊毛角朊蛋白的研究及再利用情况，早在2 0 世纪5 0 年代，美国有专 利涉及利用羊毛角朊制造再生蛋白纤维，后来较多学者采用化学方法提取羊毛角 朊后再利用。化学方法包括碱性法，酸性法，氧化法，还原法，还原硫化法等， 这些方法都各有优缺点，例如碱性法可以达到6 0 4 的角朊提取率，但是对蛋白 主链的破坏很大：利用过氧化物可以得到中性的高吸水性( 吸收自重1 0 1 3 倍的 水) 角朊，但反应迅速、激烈，很难控制，角朊成膜后脆性极大；研究用尿素和 硫脲在碱性条件下提取角朊可以达到高达7 5 的提取率，溶液的p h 值在4 5 5 5 之间；利用还原剂将羊毛溶解，提取率可达8 0 以上，其中多用剧毒的2 一巯基 乙醇作为还原剂，反应后得到的s h 基极易被氧化而使溶液不稳定。还原硫磺法 是最近研究开发的一种较为成熟的方法，可以得到的分子量为1 5 2 0 k d 的硫磺 化角朊高硫蛋白和分子量为3 0 6 0 k d 硫磺化角朊中长丝蛋白，且已经研究可其 工业实施的可行性，但制取率不高，需工艺优化。我们的目的是寻求一种快速、 高提取率、高纯度、低分子主链破坏的、稳定的羊毛角朊蛋白的提取方法，并研 究不同成膜工艺与膜性能间的关系，以制备高性能的角朊蛋白膜。 2 、理论意义 理论上若能解决高性能羊毛角朊蛋白膜的制备及表征，既解决羊毛角朊的提 取和溶液的制备问题，又解决溶液的固化问题，将补充国内在这方面研究的空白， 对研究羊毛角朊的其他利用，如成粉、成膜、覆层、纺丝、凝胶或形成海绵等， 起到基本的理论支持作用，同时对于羊毛化学性能的研究也有一定的理论支持意 义。 3 、现实意义 羊毛角朊本身具有很多优异的性能，如拥有很好的机械性能、优异的化学性 1 0 能、环保性、可生物降解性等，使角朊制品成为高新技术及产品，具有很高的实 用价值和潜在经济效益。 随着各种膜材料需求的增加，膜品种需求不断增多，如用于组织工程基质材 料、创口敷料、人工皮肤以及人工植入体基材方面；用作渗透膜、分析膜、分散 膜、超滤过膜、离子交换膜、移植设备的覆层以及细胞胶囊。它们共同的特点是 制备工艺复杂、成本高，尤其具有生物相容性的膜材料的需求不断的扩大，如要 求分散膜是非抗原分散膜，与人体具有生物相容性，可很好的控制药物释放；要 求过滤膜有纳米级别的孔洞，可以过滤重金属和纳米级别的污染物；得到高吸湿 性的膜，可作吸收材料，如尿布、妇女卫生材料。故要得到高性能的羊毛角朊蛋 白膜，使膜能工业应用，必须对膜的各种性能加以深入研究，这是本课题的出发 点，本课题的解决将对羊毛角朊蛋白的再利用提供重要的参考，对新型膜材料的 发展起推动作用。 在整个世界可持续发展的大环境下，本课题所有研究及其结果均要求为生态 的，而本身研究的目的与技术为废弃羊毛的升级与再生利用，故为绿色和可持续 的课题，具有很好的环保效益。 二、研究内容、目标及拟解决的关键问题 众所周知，影响膜性能的除了膜材料的化学构成外，还与膜材料的分子聚集 态( 膜中的大分子分布及结构形态) 有关，而分子聚集态又与很多因素有关，如 制膜液的组成( 溶剂或添加剂等) 及成膜工艺条件等。理想的铸膜液的获得要求 将羊毛角朊尽可能以更小的分子主链破坏，更大的提取率，更纯的形式提取出来， 而对于膜的晶态和非晶态的研究，一般认为晶核的形成和长大，发生在铸膜液的 蒸发阶段( 湿纺) 或压出熔融阶段( 熔纺) ，因此在某种程度上，通过控制制膜 过程，也可以控制膜非晶区和晶区的分布，从而控制成膜的性能。这样要制取高 性能的角朊蛋白膜必须对以下两个问题进行深入研究，也是本课题的主要研究内 容。 1 、羊毛的溶解，达到的目标完成高纯度、高制成率、无毒、中性稳定的羊 毛角蛋白溶液制取方法的研究，关键问题是解决溶剂选择、各种溶剂之间的种类 配合方案，各种溶剂的数量配合方案等，具体讲是两个问题：溶解原理( 溶解、 提纯、调理) 以及实验分析研究，确定溶解方法，溶剂的选择，浓度，反应温度 搅拌方式等参数。本过程中表征羊毛溶解好坏程度的指标主要是溶解蛋白的分子 量和提取率。 2 、成膜方法探索：达到的目标是得到高性能的角朊膜，包括理想的结构( 一 定的孔隙大小和分布) 、机械( 拉伸、弯曲、压缩) 性能。主要解决的问题是角 朊溶液的成膜工艺参数对角朊膜的结构、性能的影响研究，进而可控地得到不同 性能的膜。不同的工业用膜要求性能不同，该论文着重研究角朊蛋白膜的医用价 值，故着重考虑以下性能，机械性能、表面形态、成份分析、光学分析、聚集态 分析。 本课题的预期目标为：明晰主溶解机理；制取适合各种用途的稳定、无毒、 中性、可控、高制取率、高纯度、高分子量的角朊溶液；筛选增塑剂和成孔剂或 成孔方法：表征溶解作用机制和成膜特征，以制备高性能、结构可控的生物膜材 料。 三、创新点 本课题的创新点主要涉及两个方面。 其一，是获取中性、无毒、高纯度、高提取率、稳定的羊毛角蛋白溶液的制 备技术。 其二，为角蛋白膜的固化成形方法，关键是不同成膜过程中羊毛角朊的微细 结构变化理论的研究，在此基础上选择溶液固化方法( 即成膜方法的选择) ，成 膜中工艺参数的控制及铸膜液的配制( 不同的增塑剂和成孔剂的选择以及数量的 控制) 和最终膜性能之间的关系。 四、目前存在的问题 膜的性能很大程度上取决于蛋白分子的组成和微细结构。前者在很大程度上 取决于羊毛溶解时的分子损伤；后者完全依赖于溶液固化成形时的条件和采用的 制备方法及路线。 因此在溶液制备中的主要问题是溶剂的成本、毒性和腐蚀性，包括残存物对 人体的影响。在成膜制备存在的问题是s h 基交联会增强，但膜的脆性较大，故 1 2 增塑剂的种类和用量需摸索。在实际生物应用中的膜材料的适应性，多孔性，及 其成膜的微孔特征控制与表征等。 第四节本章小结 羊毛属角朊中的硬角朊，本章对此作了一定的研究，从羊毛的分子结构，组 成探讨了羊毛溶解的可能性，在对羊毛角朊的提取和成膜以及性能优化的国内外 已有研究的综述的基础上，提出本课题的主要研究问题及目标。 选题意义： 本课题为上海市自然科学基金项目( n o 0 4 z r l 4 0 0 7 ) 。旨在利用废弃羊毛或 粗短羊毛提取角朊得到高性能的角朊膜，可改变国内在这方面研究的落后状态， 满足天然医用蛋白膜的要求，对成粉、成膜、覆层、纺丝、凝胶或形成海绵等， 起到基本的理论支持作用；同时本课题的目标和技术为废弃羊毛的升级与再生利 用，故为绿色和可持续的课题，具有很好的环保效益。 研究方向： 本课题的主要目的就是要寻找一种能将羊毛大分子间的氢键，特别是二硫键 打开，能破坏交联而又有助于溶胀，不损伤主链的提取羊毛角朊的方法。且此法 须是安全无毒、无污染、高提取率、高纯度、中性、可工业化应用的溶液制备方 法。 采用得到的溶液，制备高性能角朊蛋白膜，从理论上分析和研究制膜工艺条 件和与膜的结构、性能之间的关系，获得可控的高性能角朊膜制备方法；探讨多 孔膜的成形与表征研究，得到膜的多孔性及孔隙大小的有效控制的多孔角朊膜制 备方法。 课题难点： 羊毛高含量的强二硫键，使其结构稳定，不溶于酸碱及一般试剂，故如何将 这些二硫键打破而不破坏原来的蛋白质主链，使角朊从羊毛中最大限度的提取出 来，已经成为这方面的一个难题；另外，寻求一种可以控制孔隙大小与分布及数 量的多孔膜的制备技术也存在一定难度。 第二章羊毛角朊蛋白的提取优化过程 第一节羊毛角朊蛋白的提取原理 一、羊毛溶解的相关物理化学性质 1 、羊毛二硫键的特点【l 】 ( i ) - - 硫键在肽链间属于共价键连接，在离子s 。存在的情况下发生下列反应： 一s a+ 一s a s b - - 害一s f + 一s a s 卜 当s 。s b 处在机械应力的作用下，而s 。s 。处在很低或几乎没有应力作用时， 反应朝正方向进行。然而在天然的角朊结构中含有很少的s 。，可以引入硫醇基 ( - s h ) ，也可以将二硫键还原为s h ，来促使反应的进行。 ( 2 ) 在碱性条件下，二硫键会被水解，反应式如下，在一般情况下，碱液的 p h 8 时，开始较显著地作用；而在p h 1 1 时，作用就非常剧烈了。 1 s 一+一o h 斗一s + 一s o h 一 ( 3 ) 二硫键可以被过甲酸、过乙酸、过氧化物以及卤素氧化，在这些情况下， 二硫键会被氧化为两个硫磺酸基。 ( 4 ) - - 硫键也可以用亚硫酸氢钠还原，反应式为： - - s s 一4 - h s 0 3 一。一s h + 一s s o i - ( 5 ) - - 硫键与2 巯基乙醇、硫醇、巯基乙酸反应会生成s h ，它很容易被空气 氧化而重新形成二硫键，因而可使用甲基碘化物或碘醋酸使其永久变性，而阻止 自由的半胱氨酸转变为二硫键，但这样会使角朊变性。 ( 6 ) u v 和其他形式的辐射可以将二硫键转变为自由端基，反应式为： 一s s 一_ 2 ( 一s ) ( 7 ) 重金属离子，如a g + 、h 9 2 + 可以与胱氨酸残基反应，使二硫键断裂形成金 1 4 属硫化物。 2 、羊毛中其他连接键的特点 ( 1 ) 在高温高浓度的强酸下，羊毛会受到破坏，酸基作用在角朊的盐式键的氨 基上( 角朊的碱性基团) ，而破坏了盐式键。 ( 2 ) 碱中的羟基与角朊中的盐式键起化合作用使角朊中的连接减弱。 ( 3 ) 碱金属的某些卤化物如溴化锂、氯化锂和氯化锌以及脲素等，都有比较强 烈地破坏羊毛角朊中氢键的作用。 ( 4 ) 卤素对于羊毛纤维的鳞片具有特殊强烈地破坏作用。 二、羊毛溶解的可能性 羊毛角朊蛋白由4 0 0 - 6 0 0 个氨基酸残基组成，其中胱氨酸占有1 0 ，形成 了大量强的二硫键交联，使羊毛性能比较稳定，不溶于水，不溶于一般的酸碱， 故溶解角朊的关键是将二硫键打破，同时使其他的连接键之间的作用力弱化。下 面探讨一下各种溶解机制的可能性。 l 、碱或强酸溶解 此法对羊毛的溶解比较容易，但这是分子链段破坏的溶解。虽实用，但对再 生纤维和成膜不适用。 2 、溶胀溶解 溶胀方法是目前最可行的方法，溶胀使羊毛的盐式键和氢键减弱，继而使化 学试剂进入将二硫键打破，此时便可找到溶剂是羊毛溶解。特点是能够保证大分 子较少破坏。 溶胀所用试剂多为尿素，或有机无机弱酸及其盐。采用的打开二硫键的试剂 有三大类t 过甲酸、过乙酸、过氧化物以及卤素可使二硫键成为两个硫磺酸基； 2 巯基乙醇可使二硫键变为两个s h 基；亚硫酸盐及亚硫酸氢盐可使二硫键变为 一个s h 基和一个硫磺酸基。此外，硫化物在碱性条件下可与二硫键反应；重金 属离子，如a 矿、h g + 可使二硫键断裂形成金属硫化物。 3 、构象转变溶解 理论上可将羊毛角蛋白分子从氨基酸侧基大且复杂的a 螺旋构象转化至排 列规整、伸直性较好的1 3 构型，大量减少二硫键交联，再寻找溶剂将其溶解。 第二节优化实验 一、不同溶解方法的选择 采用氧化法、还原法、碱性法以及硫化磺化法进行羊毛的溶解试验，主要目 的进行溶解方法的筛选。此过程中主要指标是提取率，分子量大小。采用粘度法 简单判定分子量大小，得到碱性法以及氧化法得到的分子量要比硫化磺化法和还 原法的都要小很多，而硫化磺化法的分子量比还原法的要稍微大一些；通过测量 残余物