（发酵工程专业论文）复合诱变及化学融合法构建酒精高产菌株.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 i 百 文 本试验以红薯为原料通过微生物发酵法生产酒精，与传统发酵工艺不同，本 试验从天然的糖化酵母和酿酒酵母出发，以多重诱变和融合的方法选育出一株能 一步发酵薯类淀粉的菌株。本文的研究主要从以下四个方面进行： ( 1 ) 对糖化酵母进行紫外一l i c l 复合诱变，确定其紫外照射时间为9 0 s ，l i c l 用量为0 5 ，正突变率达到2 1 8 。成功选育出一株遗传性能稳定的高产糖化 酶菌株a u 9 0 - 8 ，其产生糖化酶活力为3 2 4 u g ，较出发菌株提高了4 8 6 。 ( 2 ) 对k 氏酿酒酵母进行紫外一硫酸二乙酯复合诱变，通过f 交实验确定其最 佳诱变参数为紫外照射8 0 s ；d e s 浓度为5 ，于3 5 水浴振荡处理6 0 m i n 。最终选 出一株酒精高产菌株k u 8 0 一6 ，其发酵最终酒精含量为1 4 6 ( v v ) ，较出发菌 株提高了3 9 1 。 ( 3 ) 将所选育出的糖化酵母高产菌株a u 9 0 - 8 和酿酒酵母高产菌株k u 8 0 一6 通 过化学促融剂融合。确定了k u 8 0 6 用0 1 的b 一巯基乙醇预处理1 0 m i n ，在3 0 时，用浓度为2 蜗牛酶酶解1 o h ，其原生质体的形成率与再生率分别为8 1 2 和1 7 4 。糖化酵母在3 5 。c 时，用浓度为2 蜗牛酶酶解1 5 h ，其原生质体的形 成率与再生率分别为7 8 2 和1 2 5 。对亲本a u 9 0 8 原生质体进行灭活，确定其 紫外灭活时间为1 2 0 s 。融合条件为：2 54 c 高渗环境下用3 5 p e g ( 6 0 0 0 m w ) 处理 1 5 m i n ，最终成功筛选出一株性能稳定且高产酒精的融合子，命名为k a 一6 。 ( 4 ) 对融合子各项指标进行测定并对其发酵工艺进行优化，确定其最适生长温 度为3 0 。c 、最适生长p h 为6 o 、对数生长期为1 0 h 一- 1 6 h ，其酒精耐受度为1 5 ( v v ) 。融合子a k 一2 生料发酵产酒精最佳工艺条件为：原料粉碎过8 0 目筛，初 始接种量1 5 ，料液比为l ：4 ，发酵温度为3 2 。c ，p h 值4 o ，发酵周期为9 6 h 。 且在该优化条件下融合子利用生料发酵，发酵液残糖含量为1 0 6 ，产酒精量为 7 4 ( v v ) ，淀粉出酒率为5 4 6 。 对融合子进行传代性试验，其发酵能力在2 0 代之内无明显改变，遗传性能稳 定，将其用于发酵，具有广阔的市场前景。 关键词：生料发酵，复合诱变，原生质体，化学融合，融合子 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i st e s t w eu s e ds w e e tp o t a t oa so r i g i n a lm a t e r i a lt op r o d u c ea l c o h 0 1t h r o u g h m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n w h i c hi sd i f f e r e n tf r o mt r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o np r o c e s s b e g i n n i n gf r o mn a t u r a ls a c c h a r i f y i n gy e a s ta n ds a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 。w eu s e dt h e m e t h o d so fc o m p l e xm u t a g e n e s i sa n df u s i o nt ob r e e do n ek i n do fe n g i n e e r i n gb a c t e r i a w h i c hc a nf e r m e n tp o t a t os t a r c hi no n ep r o c e d u r e f o u ra s p e c t sw e r em a i n l yc o n s i d e r e d i nt h i ss t u d ya sf o l l o w i n g ： ( 1 ) a p p l y i n gt h em e a no fu v - l i c ic o m p l e xm u t a g e n e s i so ns a c c h a r i l y i n gy e a s t ， w ed e t e r m i n e dt h a tu vi r r a d i a t i o nt i m ei s9 0 sa n dl i c ld o s a g ei s0 5 t h e nt h e p o s i t i v em u t a t i o nr a t er e a c h e s21 8 w eh a v es u c c e s s f u l l yb r e dag e n e t i c a l l ys t a b l e h i g h y i e l d i n gg l u c o a m y l a s es t r a i n sa u 9 0 8 w i t hi t sg l u c o a m y l a s ea c t i v i t ya c h i e v i n g 3 2 4 u g p r o m o t e d4 8 6 c o m p a r i n gw i t ho r i g i n a t i n gs t r a i n ( 2 ) i nt h i se x p e r i m e n t ，w eu s e du va n dd e sm u t a t i n gs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ek a c c o r d i n gt oo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h ep a r a m e t e r ss e t t i n gf o ri t sb e s tm u t a t i o nw e r ea s f o l l o w s ：8 0 su vi r r a d i a t i n gt i m ea n d5 d e sa m o u n ta n dq u i v e r i n g6 0 r a i n si n3 5 w a t e rb a t h 。a tl a s t ，w es c r e e n e do u to n eh i g h y i e l d i n gs t r a i n so fa l c o h o lk u 8 0 6 ，w i m i t sf i n a lf e r m e n t a t i o na l c o h o lr e a c h i n g1 4 6 p r o m o t e d3 9 1 c o m p a r i n gw i t h o r i g i n a t i n gs t r a i n ( 3 ) u s i n gc h e m i c a lf u s i o n p r o m o t i n ga g e n tt of u s eb r e dh i g h y i e l d i n gs t r a i n so f s a c c h a r i f y i n gy e a s ta u 9 0 8a n dh i g h y i e l d i n gs t r a i n so fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e k u 8 0 6 ，w ed e t e r m i n e dt h ec o n d i t i o n s ：a s f o rk u 8 0 6 ，p r e t r e a t i n g0 1 p m e r c a p t o e t h a n o l f o r10 m i n s ，a n du s i n g2 s n a i le n z y m et oh y d r o l y s a t ei ta tt h e t e m p e r a t u r eo f3 0 f o r1 0h o u r t h e nt h ef o r m a t i o nr a t e sa n dr e g e n e r a t i o nr a t e so f p r o t o p l a s to fk u 8 0 6w e r er e s p e c t i v e l y81 2 a n d 17 4 a sf o ri n a c t i v a t i n gt h e p a r e n t a u 9 0 8p r o t o p l a s t w ed e t e r m i n e dt h et i m eo fu vi n a c t i v a t i n gw a s12 0 s a n d t h ef u s i n gc o n d i t i o n sw e r e a s f o l l o w s ：h y p e r t o n i c e n v i r o n m e n tw i t h3 5 p e g f6 0 0 0 m w ) a t2 5 f o rl5 m i n u l t i m a t e l y , w es u c c e s s f u l l ys e l e c t e do n ef u s a n t w i t hs t a b l ep e r f o r m a n c ea n dh i g h y i e l d i n ga l c o h o l ，n a m i n gk a 一6 ( 4 ) m e a s u r i n gi n d i c a t o r so ff u s a n ta n do p t i m i z a t i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w ef o u n d t h a tt h eo p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r ew a s30 a n dt h eb e s tp hv a l u ef o rg r o w i n gw a s 6 0 t h el o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ew a s1o h 16 h ，a n dt h ea l c o h o lt o l e r a n c ew a s 15 ( v v ) t h eo p t i m i z i n gp r o c e s sc o n d i t i o n so fa l c o h o lf e r m e n t a t i o nw i t hu n c o o k e d m a t e r i a lf o rf u s a n ta k 2w e r ea sf o l l o w s ：a f t e rs c r e e n i n gs m a s h e dr a wm a t e r i a l s t h r o u g ht h eh e a do f8 0 w ec o n t r o l l e dt h eo r i g i n a l i n o c u l u ma t15 ，a n dt h er a t i o b e t w e e nr a wm a t e r i a l sa n dl i q u i df o rf e r m e n t a t i o nw a s1 ：4 t h et e m p e r a t u r e f o r f e r m e n t i n gw a s3 2 ，p hv a l u ew a s4 0 ，a n dt h ef e r m e n t a t i o nc y c l e w a s9 6 h u s i n gt h i s f u s a n tt of e r m e n tu n c o o k e dm a t e r i a lu n d e rt h e s eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，w eg o tt h es u g a r c o n t e n to fr e s i d u a lf e r m e n t a t i o nb r o t ha t1 0 6 ，w i t h7 4 a l c o h o lp r o d u c t i o na n d 5 4 6 s t a r c ha l c o h 0 1 y i e l d i n g 湖北工业大学硕士学位论文 t h ec a p a b i l i t yo ff e r m e n t a t i o nc o u l dn o tc h a n g ew i t h i n 2 0g e n e r a t i o n sa f t e r s u b c u l t u r et e s to ff u s a n t s t i l l ，t h eg e n e t i cp e r f o r m a n c ew a ss t a b l e i fi ti su s e do n f e r m e n t a t i o n ，t h e r ew i l lb ep r o s p e c t i n gm a r k e t k e y w o r d s ：f e r m e n t a t i o no fr a ws t a r c h ，c o m p l e xm u t a g e n e s i s ，p r o t o p l a s t ，c h e m i c a l f u s i o n ，f u s a n t i i i 溯办j 董大謦 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做i ：b 贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 刁怦苔 日期：功略年f 月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 糊黼张鼋怛学缈 日期：沙彰年厂月z 名日日期：群年岁月功日 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 燃料酒精工业概述 第1 章引言 1 1 1 酒精的国外发展状况 随着环保意识对的加强，人们逐渐认识到化石燃料燃烧时排放的二氧化碳会 导致温室效应加剧、地球气温变暖，石油等化石燃料受到冷落，而生物乙醇来自 于可再生的植物，利用通过光合作用转化的二氧化碳和储存于植物中的太阳能， 具有降低温室效应气体的巨大潜力，所以很快成了研究的重点，各国“燃料酒精 项目也就应运而生n ，。 目前，世界上燃料酒精生产及消费量最大的国家是美国和巴西，其次是加拿 大、意大利和法国等国家乜一1 。其中美国燃料酒精的生产量居世界首位，年产量为 5 0 多万吨。在美国，燃料酒精的生产和应用已有多年的历史，所使用的原料以玉 米为主，还有大麦、糖蜜等h 一3 。为了支持燃料酒精行业的发展，美国联邦政府在 税收上给予了充分的优惠政策。在政府支持下，美国的燃料酒精工业迅速发展起 来，有利地促进了农业发展，保护了环境，同时也减少了不可再生资源石油 的消耗呻1 。在美国，每年消耗燃料酒精约4 0 0 万吨，1 9 9 9 年美国有1 2 以上的车在 汽油中添加了酒精口3 。目前，美国已有5 0 多套燃料酒精生产装置，其中年产量最 高的为7 0 万吨，年产量最小的只有几千吨。随着燃料酒精在美国的推广，与2 0 世纪7 0 年代相比，依赖原油的程度仅为7 0 年代的5 0 嘲。 巴西为了解决汽油大量依赖进口的问题，制定并实施了以酒精代替石油的国 家十年计划p 1 。与美国不同的是巴西有两种燃料类型的汽车，一种以汽油为燃料， 另一种以酒精为燃料，两者采用了不同的发动机n 们。巴西政府规定，汽车燃料采 用含2 0 酒精的改性汽油( g a s o h 0 1 ) ，迄今全国汽车所需燃料的4 3 已使用酒精n 。 巴西发展了以糖蜜为原料生产燃料酒精的技术，为5 0 0 万人创造了新的就业机会， 这对于巴西人民生活的改善和国民经济发展起到了非常重要的作用u 刳。 1 1 2 酒精的国内发展状况 中国作为人口大国，随着汽车工业的迅速发展和轿车逐步进入家庭，对机动 车燃料的需求越来越太，同时面临的环保形势也越来越严峻，因此对环保型燃料 的需求将日益迫切，而在我国酒精的产量中，以玉米、谷物为原料的占5 5 ，薯类 湖北工业大学硕士学位论文 为原料的占3 3 ，糖蜜为原料的占1 2 ( 主要产自广西) n 3 。生物乙醇来自于可再 生的植物燃料乙醇的应用可大大改善大气环境，经检测得出在汽油中添加一定乙 醇可降低一氧化碳排放量约3 0 - - 3 8 ，挥发性有机化合物( v o c ) 约1 2 ，有害 物质排放平均降低1 3 以上n 钔。因此我国发展燃料酒精工业已变得十分必要。 ( 1 ) 发展燃料酒精具有十分广阔的市前景。近年来，随着原油价格的上涨，汽油 价格也不断上涨，9 3 号汽油已达到每吨3 万多元，而生产一吨燃料酒精的成本不 超3 0 0 0 元。仅从价格上看，燃料酒精在我国具备了发展条件，如果政府再给予优 惠的收费政策，燃料酒精的发展前景将十分广阔。 ( 2 ) 发展燃料酒精是环境保护的需要。随着经济的发展，我国的环境污染问题日 趋严重，国家不断加大了环境治理工作的力度。汽车尾气是城市空气的主要污染 源之一，向汽油中添加燃料酒精可使汽车尾气对空气的污染程度明显减轻。 ( 3 ) 发展燃料酒精可使汽油改性，提高汽油标号。酒精不仅是一种比较清洁的燃 料，向汽油中混加酒精还能提高燃料的辛烷值，避免引擎撞击以及冬季汽油管路 冻结。由于炼油厂生产出来的汽油辛烷值一般小于9 0 ，而车用汽油要求9 0 号以上。 我国已禁止使用含铅汽油，一般通过添加m t b e 来提高汽油辛烷值，而酒精的辛烷 值高于m t b e ，所以向汽油中舔加酒精，将会明显提高汽油的辛烷值。由于燃料酒 精价格低于m t b e ，因此经济效益十分可观n ，1 7 1 。 目前，我国酒精主要为内销，部分出口到日本、韩国、东南亚等国家和地区， 优势为运距短，物流便利，劣势为原料成本比巴西高。随着世界各国日益重视能 源问题，燃料乙醇需求量迅速增加，给我国的酒精出口带来了新的机遇。目前中 国酒精的价格在与世界接轨，考虑到运距的问题，我国的酒精将具有较好的竞争 力。现在我国逐步在汽油中添1 0 的燃料乙醇，下一步将在柴油中添加5 的燃料 乙醇，到2 0 0 8 年对燃料乙醇的需求将达到4 0 6 5 6 8 万吨年n 引。 1 1 3 酒精的应用前景展望 7 0 年代至8 0 年代末，受到两次石油危机的冲击后，世界各国普遍认识到，有 朝一日，廉价的原油是会用完的，对不可再生能源石油的过分依赖是危险的， 据专家估计，如果还未发现新的油田，世界现有石油开采量至2 l 世纪二三十年代 将会枯竭。于是各国纷纷开始研究开发新的、可再生的能源，而其中对利用可再 生资源生产燃料酒精的研究更是被提到了一个尤为重要的地位。不过当时对燃料 酒精的青睐还只是迫于石油短缺和油价高升的压力n9 删。到了2 0 世纪8 0 年代末， 酒精作为清洁燃料的概念才开始突显出来，随着人们逐渐认识到化石燃料燃烧时 排放的二氧化碳会导致温室效应加剧、地球气温变暖，石油等化石燃料受到冷落， 2 湖北工业大学硕士学位论文 而生物乙醇来自于可再生的植物，利用通过光合作用转化的二氧化碳和储存于埴 物中的太阳能，具有降低温室效应气体的巨大潜力，所以很快成了研究的重点， 各国“燃料酒精”项目也就应运而生乜h 捌。 酒精作为燃料具有一系列的特点：( 1 ) 酒精的热值较高，纯乙醇的低位热值 为2 7 1 1 0 千焦千克，虽只有汽油低位热值的6 2 ，但乙醇分子结构内含有氧成 分( 占重量成分的3 5 ) ，理论燃烧所需的空气量较少，其单位容积理论燃烧的空 气混合物热值只比汽油的相应值低4 6 。实际上影响发动机单位容积功率的是可 燃混合气体的热值，就这一点来说，酒精只比汽油略有逊色。( 2 ) 酒精的辛烷值 高达1 1 1 ，相当于高级的汽油，与不添加抗爆剂的汽油掺和，就能达到发动机对 辛烷值的要求。( 3 ) 酒精极易燃烬，燃烧效率高，掺烧部分酒精，发动机效率并 未明显变化。( 4 ) 酒精燃烧时产生的污染物很少，试验证明燃气轮机燃用酒精时， 其c 0 2 的排放量只有燃用柴油的四分之一左右。面临着今后环境条件的严峻形势， 这个优点更具有重大的价值。( 5 ) 酒精蒸发温度很低，着火速度极快，酒精含水 量高达6 0 时，其与空气的混合物还能着火，这就有可能燃用品位较低的酒精溶 液。( 6 ) 酒精的物理化学性质毕竟与汽油不同，如酒精的粘性就比汽油粘性大，因 此全烧酒精或燃用含酒精量较大的汽油，酒精混合物要用专门设计的发动机，但 据称掺烧1 0 的酒精，发动机可不必改动，掺烧2 0 的酒精发动机只需略作改 动2 蝴3 。 但是，欲使酒精燃料能在市场上占有一席之地，要解决的主要问题是使其在 价格上能具有竞争力。为此，一方面应在改进生产技术上下功夫，以祈生产成本 能有较大幅度降低；另一方面，国家应在税赋方面给予一定的优惠政策。为此建 议首先搞些试点，待到条件成熟时，再采取一些相应的政策措施，如强制规定各 加油站应出售含有一定酒精含量的汽油、酒精混合物，最终实现具有一定的规模 效应，使酒精真正起到作为替代燃料的补充能源的作用。 1 2 淀粉质生料发酵概述 酒精发酵主要由酵母菌在厌氧条件下通过e m p 途径将葡萄糖降解为丙酮酸， 然后在丙酮酸脱氢酶的作用下，将丙酮酸脱梭形成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的作 用下生成乙醇。 j 以淀粉为原料生产酒精，一般所采用的方法是将粉碎的谷物在高温下进行蒸 煮，或加淀粉酶低温蒸煮后糖化、发酵。蒸煮的目的，其一是破坏谷物的组织结 构，使淀粉彻底地糊化、液化，以利于液化酶和糖化酶的分解；其二是使醪液进 3 湖北工业大学硕士学位论文 行灭菌瞳引。蒸煮需要消耗大量的热能，所耗的蒸气，占整个生产过程蒸气消耗的 2 5 - - - 3 0 。但蒸煮过程中能耗过大，对环境亦会造成一定的污染，因此，新的 发酵工艺应运而生。 生料发酵研究在2 0 世纪4 0 年代就开始了。早在1 9 4 4 年b a l l a 等报道了小麦、 玉米的生淀粉能被米曲露的浸出液迅速完全转化为可发酵性糖。研究发现生淀粉 和糊化淀粉其酶解的差异只是在水解的速率上。k n e e n 等报道了麦芽浸出液能直接 水解小麦淀粉，水解能力与q 一淀粉酶的活性有关啪1 。u e d a 等发现，生淀粉水解 时，黑曲霉属的淀粉酶水解生淀粉的能力比米曲霉或麦芽的淀粉酶强。但黑曲酶 属的a 淀粉酶对生淀粉的水解活性非常低，只有葡萄糖淀粉酶对生淀粉的水解具 有较高的活性。但将两种酶共同对生淀粉水解，其能力比任何一种单一酶都高， 表明酶之间有相互促进作用1 。 自2 0 世纪7 0 年代发生石油危机以来，石油价格不断上涨，各国政府和大企 业意识到以石油作为唯一能源是危险和不可靠的，他们大量投资进行新能源的开 发和研究，从而酒精这种再生能源得到各国科学家的重视，许多研究者对淀粉原 料的蒸煮方法进行大量研究，特别是生淀粉发酵工艺的研究，取得许多可喜成果， 使得生料酒精发酵工业化大生产成为现实洲。 我国在生料发酵研究虽然起步晚，但应用早，发展快。进入2 0 世纪8 0 年代， 生料发酵制酒研究随着酶工程的发展取得了实质性进展。生料发酵( 无蒸煮发酵) 技术关键在于三个方面，其一是生料糖化，即生淀粉的直接水解，其二，糖化淀 粉酶和酵母进行的直接酒精发酵，其三，杂茵污染的防治。 生料糖化是原料中的生淀粉在葡萄糖淀粉酶的酶促作用下水解生成葡萄糖。 葡萄糖淀粉酶又称糖化酶，它能将淀粉以非还原性末端水解a 一1 ，4 糖苷键，也能 缓慢水解q - 1 ，6 糖苷键，转化为葡萄糖口。糖化酶的生淀粉水解速率与它能否被 生淀粉颗粒吸附以及吸附强度有关，容易被生淀粉吸附的淀粉酶其水解生淀粉的 能力就强，反之则低。由于淀粉的吸附作用，加上糖化酶中有一定生淀粉亲和力 位置存在，使糖化酶更易接近淀粉粒而催化水解成葡萄糖。糖化酶对生淀粉的水 解速率与原料性质、作用温度p h 但和醪液浓度有关；葡萄糖淀粉酶因其来源和 活性不同对生淀粉的水解程度也不相同口引。 生料酿酒生产工艺分固态法生料酿酒和液态法生料酿酒两种。固态法生料酿 酒采用原料粉碎，高温润料，配加辅料，固态发酵，酒质较好，出酒率较高h 驯。 液态法生料酿酒是淀粉质原料直接加曲、加水糖化发酵、蒸馏而成，其特点是采 用生原料，不经蒸煮糊化，不需配糟，整个发酵过程是在液态中进行。此法投资 省，操作简便，清洁卫生，出滔率高，是目前生料酿酒的主流。川。 4 湖北工业大学硕士学位论文 生料酿酒工艺与传统发酵工艺比较，具有节约能源、。提高出酒率、操作简便、 便于工业化生产等优点，有广阔的市场前景。 1 3 诱变育种的研究进展 1 9 2 7 年，m u l l e r 发现x 射线能诱发果蝇基因突变，从此开创了诱变育种技术 的先河口引。经过近一个世纪的不断发展和完善，诱变育种尤其是物理诱变育种技 术已成为目前工业微生物育种中最为常用和最有效的技术之一。 诱变育种的目的在于提高微生物最终产物或中间产物的产量，改进质量或改 变原有的代谢途径产生新的代谢产物。诱变育种包括物理诱变、化学诱变和复合 诱变。 物理诱变是使用辐射中的各种射线为诱变源( 包括紫外线、x 射线、y 射线、 快中子、微波、超声波、电磁波、激光和宇宙射线等) 啪3 ，对生物靶进行诱变。多 年的育种实践发现对微生物诱变效果较好且应用较广泛的主要有紫外线、x 射线、 y 射线和快中子。这些诱变技术设备简单、操作方便，利用这些诱变源进行单一或 复合诱变。已得到了大量的高产工业微生物菌株7 棚3 。这些传统的诱变育种技术 在2 0 世纪的工业微生物育种工作中起着很重要的作用。但是，长期、重复使用某 种诱变源，往往导致突变率低、突变谱窄和抗性饱和口帕。因此，一些新型、高效 的诱变方法应运而生。如空间诱变、离子注入诱变、激光诱变等新型、高效的微 生物诱变育种技术。它们不仅操作简单、安全，而且具有突变谱宽和在一定程度 上能克服菌种对传统诱变源的抗性饱和等优点。二- 经开发就很快得到广泛应用h 训。 化学诱变主要是导致碱基对的转换、缺失和易位等h u 。化学诱变剂的种类很 多，如烷化剂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等。 当前在菌种诱变育种上应用的主要是硫酸二已酯( d e s ) 、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、 l i c l 、n a h s o 。、亚硝基胍( n t g ) 、盐酸羟胺、5 一溴尿嘧啶( 5 一b u ) 、乙烯亚胺( e i ) 、 亚硝酸( n a ) 和8 一甲氧基补骨脂素( 8 - m o p ) 等h 引。化学诱变引起微生物基因突变， 使其在d n a 链上引起碱基排列的改变或是结构的改变。由于碱基序列或结构的变 化，导致了编码氨基酸的变化，因而影响某些蛋白质的合成或酶的活性，生物体随 之发生的便是某一性状的改变。这种改变可以稳定的遗传给后代，得到具有新的遗 传性状的菌株。化学诱变效率高，即使在低致死率的情况下也有很强的诱变作用， 因而受到广泛的青睐。 复合诱变育种是采用两种或两种以上的方式进行诱变育种，已经被广泛应用 于微生物诱变育种中，并取得了理想的正突变效果引。由于各种诱变剂对微生物 5 湖北工业大学硕士学位论文 d n a 的作用位点和方式不尽相同，因此，反复使用同一诱变因子会出现钝化现象， 可能引起微生物的回复突变，这就要求在所选菌种进行诱变育种时要尽量选用新 的诱变因子，才会有较大可能性取得成功h 钆蜘。 另外，还可以利用原生质体进行诱变。原生质体由于去除外壁障碍，因而对 各种诱变剂敏感性较强，往往正突变率高，因而利用原生质体直接诱变经过多种 诱变剂处理过的钝化株而言，是一种较有意义的诱变方法。 诱变育种这种传统的育种方式虽然有其弊端，但也具有菌种遗传稳定性高、 简便、易行和安全等优点，是微生物育种不可缺少的育种手段。 1 4 原生质体融合的现状和发展 1 4 j1 原生质体融合技术的起源 原生质体融合( p r o t o p l a s tf u s i o n ) 技术起源于2 0 世纪6 0 年代，1 9 6 0 年法国 的k a r s k i 研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。 同时，日本的o k a d a 发现并证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此融合， 从而开始了细胞融合的探讨h 力。1 9 7 4 年，匈牙利的f e r e n c z y 采用离心力诱导的方 法报道了白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u m ) 营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而 使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到 界间的融合( 如光合细菌与酵母菌的融合) 呻1 。1 9 7 9 年匈牙利的p e s t i 首先提出了 融合育种提高青霉素产量的报告，开创了原生质体融合技术在实际工作中的应 用，使原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。h o p w o o d 等提出，原 生质体融合重组可能实现隐性基因的重组暴露，使一些隐性基因表达或随机产生 新的基因表型，从而使之成为育种的新途径h 引。随后人们相继用n a c l 、k c l 和c a n 0 3 等作为诱变剂进行融合，但融合频率都很低。同年，k a o 发现p e g 在适量c a 2 + 存 在下能有效地诱导植物原生质体融合，p e g 种类对原生质体融合的影响不大，从而 使这一技术跃上了新的阶段，大大提高了融合频率剐。 1 4 i2 原生质体融合技术的国内研究进展 彭智华等对野生大杯蕈( c i t o c y b e m a x i m a ) 进行原生质体制备的过程中，用2 种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌等证明，在一定范围内，酶作用 的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关，而与再生率成反相关： 林红雨等采用酶解1 0 分钟后补加e d t a 的方法，改变酶解环境中的离子强度和渗 透压，可以提高原生质体形成率。c o s t e r o nj w 等( 1 9 6 7 ) 报道，在高渗t r i s 6 湖北工业大学硕士学位论文 溶液中添加1 5 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 等原生质体扩张剂，有助于制备原生质体， 添加0 0 2 m o l l 镁离子，有利于原生质体的稳定陆。除了传统的化学方法外， 王金盛等报道了电场诱导细胞融合的新技术，进一步提高了融合频率。陈五岭等 报道了激光诱导动物细胞融合。此外，其融合率还受其它诸因素的影响。陈海昌 等引的研究证明原生质体的融合受p e g 和钙离子的浓度及诱导融合时间的影响。 林红雨等采用在融合液中添加新生磷酸钙的方法可以促进原生质体融合。 1 4 3 原生质体融合技术在酿酒领域的应用 高年发等将酿酒酵母与粟酒裂殖酵母进行属间原生质体融合选育到降解苹果 酸强的菌株畸纠。高玉荣利用发酵力强的葡萄酒酵母与降酸能力强，发酵性能好的 杰酒裂母融合，进行生物基因交换和重组，获得的融合子降酸率可达3 0 4 ，比 葡萄酒酵母的降酸性提高2 0 喳朝。方霭祺等报道了以酿酒酵母3 9 6 和假丝酵母c 6 为亲本，通过原生质体融合技术，得到了一株在4 0 c 培养条件下原料利用率为9 4 3 ，乙醇产量为5 9 7 9 l 的属间融合株。文铁桥等通过p e g 诱导碘乙酸灭活呼 吸缺陷克鲁维酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合，获得4 5 c 发酵产酒率高达 8 7 的高温酵母菌株a y 0 0 6 阳1 。k u m a r i 等将能够分解纤维素的t ro m9 4 1 4 和从 葡萄糖产酒精的s c e r e v i s i a en c i m 3 2 8 8 进行融合，得到具有很强的将滤纸纤维 素转化为酒精的融合子5 1 。赵华等运用紫外线灭活原生质体融合技术，成功地对 酒精酵母( k 酵母) 和产酯酵母( f 2 ) 进行了属间细胞融合，获得既具有高产酒特性， 又具有高产酯特性的发酵性能稳定的融合子f k 3 2 扎 应用原生质体融合技术对酶的研究也是相当广泛的。研究最多的是淀粉酶、 蛋白酶和纤维素酶，主要用于提高菌种的产酶活力，改变菌种酶分泌的种类或使 产酶菌种获得新的优良性状等。日本w a s e d a 大学应用此技术以柠檬酸生产菌株黑 曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 和纤维素酶产生菌绿色木霉( t r i c h o d e r m a 匠一纠为 亲本，融合后筛选到能在甘蔗渣固体培养基上生长产生柠檬酸的融合子，兼具了 绿色木霉产纤维素酶和黑曲霉产柠檬酸的能力。曹军等以两性霉素b 抗性作为标 记，进行栖土曲霉种内非营养缺陷型原生质体融合，在4 0 的p e g 一6 0 0 0 促融下， 获得稳定的融合子，融合子为杂合二倍体，产角蛋白酶活力较亲本显著提高嘲1 。 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要 工具，也为遗传育种提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种工作的各个 方面。但是还都只局限于两个菌之间的融合，没有扩展到3 个以上的菌之间的融 合，如果我们能够开展多个菌之间的融合，则有可能获得同时具多个优良性状的 菌株，进一步扩宽这一技术的应用。 7 湖北工业大学硕士学位论文 1 5 选题目的、意义及方法 1 5 1 选题目的和意义 本课题以红薯淀粉为原料通过微生物发酵法生产酒精。我国红薯种植面积有 9 3 0 万h m 2 ，总产量在4 5 亿吨左右，占世界总产量的8 0 以上，居世界首位畸7 j 。 红薯的产量高也导致生产过剩，往往是人吃1 3 、饲用i 3 、烂掉i 3 ，红薯定价 不合理，市售率低，造成大量积压，加重了政府财政负担。 红薯可在任何作物生长的地方种植，具有很强的抗干旱、耐贫瘠等特性，而 且产量高、易储藏，其发展潜力十分可观。各级政府非常重视对薯类的研究和产 业的发展，面对农业结构战略性调整、农民增收的艰巨任务和融入世界经济一体 化的需要，今后还需要加大薯类加工的力度，促进我国薯类产业的发展。尤其是 加入世贸组织后，我国的薯类淀粉有着较大的资源优势、价格优势，不仅在国内， 在国际贸易中也颇有市场。红薯的碳水化合物的含量丰富，是发酵微生物的良好 碳源嘲。随着各种深加工技术的逐渐成熟，薯类逐渐成为世界公认的综合利用价 值极高的经济作物和重要的工业原料。将红薯用于酒精发酵，不仅成本低廉，而 且可以减轻产品堆积，缓解农民压力，提供新型能源，对国民经济可持续发展有 着积极重要的作用。 酒精生产的方法主要有化学合成法和生物发酵法两种。化学合成法产品含杂 较多，且原料不可再生。而工业发酵法产品纯度较高，原料可再生，世界上9 5 的酒精工业采用发酵法。传统发酵采用高温蒸煮的方法使淀粉颗粒膨胀，进而实 现淀粉的糖化，但蒸煮消耗大量的燃料，成本较高且工业复杂。生料发酵生产酒 精的早籼稻谷粉碎后不经过蒸煮，直接发酵加入生淀粉糖化酶来破坏水束层，糖 化生淀粉。生料发酵法生产酒精工艺简化，劳动强度大幅下降，可以节约3 0 4 0 的燃料，而且此研究不需除去谷壳，粉碎后的谷壳粉和谷粉一起发酵，进一 步简化工艺，降低成本。当前中国能源紧缺，急需开发可再生能源，生料发酵生 产可再生性能源酒精，具有重要的意义。 目前，国内生产酒精多通过酿酒酵母发酵，先将淀粉质原料高温蒸煮糖化， 再往糖化醪接种酿酒酵母。酿酒酵母不含有淀粉酶基因，不能直接利用生淀粉生 产酒精。通过原生质体融合技术把糖化酶的基因引入酿酒酵母，从而构建能直接 利用生淀粉发酵的新型酵母工程菌株。将其应用于发酵不仅可以缩短工艺过程，而 且可以节约设备和投资，具有实际的经济效益与广阔的市场前景。 8 湖北工业大学硕士学位论文 1 5 2 主要技术方案 。 微生物菌种质量的优劣对发酵工业有极其重要的影响，因此选育出一株好的 工程茵对于发酵工程是至关重要的。从自然界中得到的工业微生物菌种，由于其 目的代谢产物产量较低而很少直接被用于工业生产。因此，从自然界筛选出来的 菌种一般都要经过人工诱变，来提高产量。 本试验从天然的糖化酵母和酿酒酵母出发，以复合诱变和融合的方法选育一 株能一步发酵薯类淀粉的工程菌。先对出发菌株k 氏酵母和糖化酵母a s 2 1 5 4 8 分 别进行物理及化学复合诱变，筛选出高产菌株，提高出发菌株的性能：再以所选 育出的高产菌株为亲本，通过化学促融剂进行原生质体融合，筛选出稳定且高产 的融合子；通过一系列实验优化其发酵工艺。 9 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 前言 第2 章初始菌株发酵性能的测定 本法以红薯淀粉为原料，糖化酵母a s 2 1 5 4 8 生长代谢所产生的糖化酶可将原 料中的直链淀粉转换为葡萄糖，而k 氏酵母在厌氧条件下利用可发酵性糖通过糖 酵解途径生成酒精，两株菌的各项性能对发酵起着至关重要的作用。 2 2 实验材料 2 2 1 菌种 糖化酵母( s d i a s t a t i c u s ) ：购自中科院微生物研究所( a s2 1 5 4 8 ) k 氏酵母( s c e r e v i s i a ek ) ：湖北省工业微生物重点实验室保藏 2 2 2 试剂 葡萄糖广东光华化学有限公司 酵母浸膏北京双旋微生物培养基制药厂 琼脂粉广东环凯生物科技公司 蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂 糖化酶酶活力5 0 0 0 0u g ，无锡酶制剂厂 可溶性淀粉天津市福诚化学试剂厂 n a c l 上海试剂一厂 c a c l 2 天津市福晨化学试剂厂 m 9 2 s 0 4 7 h 2 0成都化学试剂厂 ( n h 4 ) 2 s 0 4天津市福诚化学试剂厂 l ( h 2 p 0 4 上海试一化学试剂有限公司 h c l 上海试一化学试剂有限公司 乙醇上海振兴化工一厂 酒石酸钾钠天津市博迪化工有限公司 冰乙酸天津市博迪化工有限公司 1 0 湖北工业大学硕士学位论文 乙酸钠天津市科密欧化学试剂开发中心 次甲基蓝上海三爱思试剂有限公司 亚铁氰化钾国药集团化学试剂有限公司 硫酸铜上海科昌精细化学品公司 p h 4 6 醋酸一醋酸钠缓冲液 p h 6 0 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液 斐林试剂：参考文献瞄叼 2 2 3 培养基 完全培养基( y e p d ) ：蛋白胨1 ，葡萄糖2 ，酵母膏1 ，在1 1 5 c 下灭菌3 0m i n 。 p d a 活化培养基：称取2 0 0 9 马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 0 0 0 m l 煮沸半个小时， 纱布过滤，再加2 0 9 葡萄糖和2 0 9 琼脂，充分溶解后趁热纱布 过滤，1 1 5 灭菌3 0 m i n 麦芽汁液体培养基：将麦芽粉碎过4 0 目筛，加入四倍质量的水，6 5 c 恒温糖化4 h ， 加碘液直到不显蓝色为止，煮沸后用纱布过滤，1 1 5 灭菌 3 0 m i n 得至0 麦芽汁；调节p h 至6 o 固体麸曲培养基：麸曲：淀粉：水= 3 ：1 ：3 ，在1 1 5 0 c 下灭菌3 0 m i n ，调节p h 至6 0 。 生淀粉发酵培养基：红薯晒干后粉碎过8 0 目筛，红薯粉与水的比例1 ：3 5 ，以 3 0 0 u g 加入糖化酶，调p h 值到4 0 2 2 4 主要仪器设备 超净工作台， l s 一2 ， 恒温旋转摇床，h q 4 5 z ， 可见分光光度计， 7 2 2 s ， 显微镜，x s - 2 1 2 ， 手提式压力灭菌锅，y x q s g 4 1 2 8 0 ， 光照培养箱，2 0 0 2 1 1 ， 台式离心机， ，t c l 一1 6 c ， 电子天平， b l 一2 2 0 h ， 电子天平，a r d 1 1 0 ， 微量移液器，型， 苏州净化设备有限公司； 中科院武汉科学仪器厂； 上海精密科学仪器有限公司 南京江南光电股份有限公司； 上海华代医用核子仪器有限公司 国华企业 上海安亭科学仪器制造厂 s h i m a d 2 yc o r p o r a t io n o h a u sc o r p p in e 上海市求精生化试剂仪器有限公司 湖北工业大学硕士学位论文 芝3 实验方法 2 3 1 原料淀粉含量的测定 将新鲜红薯晒干粉碎后过8 0 目筛，用碘量法测定淀粉含量。 2 3 2 生长曲线制备 将糖化酵母于p d a 活化培养基上2 8 活化培养2 d ，再转接于y e p d 液体培养 基中，2 8 c 恒温摇床，1 3 0 r m i n 振荡培养1 6 h 。 将活化后的糖化酵母种子液转接于y e p d 液体培养基中，分别2 8 恒温摇床， 1 3 0 r